Name: Remming van wond epidermisvorming via volledige huidflapchirurgie tijdens Axolotl Limb Regeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Leer een chirurgische methode om wond-epidermisvorming te remmen tijdens ledemaatregeneratie bij axolotls (Ambystoma mexicanum). Dit protocol is efficiënt en reproduceerbaar voor moleculaire analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteur bedankt Doug voor zijn constante aanmoediging en niet-aflatende steun, evenals de leden van het Melton-lab voor hun nuttige feedback en opmerkingen over het manuscript. De auteur wil ook het Harvard Office of Animal Resources (OAR) bedanken voor hun toegewijde dierenverzorging.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC (Protocol #: 11-32) en AAALAC-richtlijnen aan de Harvard University.
1. Oplossingen voorbereiden en instellen voor anesthesie en herstel
<ol><li>Bereid verse 0,1% tricaïne-oplossing voor anesthesie en 0,5% sulfamerazine natriumzoutoplossing voor herstel. Maak de oplossingen met water geschikt voor axolotl-veehouderij37 volgens goedgekeurde IACUC-protocollen bij de betreffende onderzoeksinstelling (bijvoorbeeld de oplossing van Holtfreter aangepast). Zorg ervoor dat de oplossingen goed gemengd zijn en dat er voldoende volume is voorbereid om de hele axolotl onder te dompelen.<ol>
<li>Om 0,1% tricaïne-oplossing te bereiden, mengt u 1 g tricaïne en 1 g natriumbicarbonaat met 1 l water. De oplossing kan volgens dit recept worden opgeschaald.</li>
		<li>Om 0,5% sulfamerazine natriumzoutoplossing te bereiden, mengt u 5 g sulfamerazine natriumzout met 1 l water. De oplossing kan volgens dit recept worden opgeschaald. Sulfamerazine-oplossing is een anti-bioticum dat bacteriële infectie tijdens chirurgisch herstel zal voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontsmet het operatiegebied door het te besproeien met Clidox-S of 70% ethanol. Steriliseer chirurgische hulpmiddelen (tang, ontleedschaar, veerschaar) door autoclaveren. Als u meerdere operaties uitvoert, zorg er dan voor dat u de chirurgische hulpmiddelen steriliseert met een hete kraalsterilisator tussen dieren.</li>
	<li>Om het herstelgebied in te stellen, plaatst u een petrischaal van 15 cm of een container die op de axolotl past bovenop een emmer gevuld met nat ijs. Vul de petrischaal met een laag gehalte van 0,5% sulfamerazine natriumzoutoplossing, voldoende zodat de axolotl niet volledig onder water komt te staan. Het herstel op ijs na de operatie zal de beweging van het dier vertragen terwijl het ontwaakt uit anesthesie, waardoor het hechte gebied relatief ongestoord kan genezen. OPMERKING: Deze opstelling kan door onderzoekers worden aangepast, afhankelijk van welke materialen ze beschikbaar hebben.</li>
</ol>2. Het uitvoeren van de volledige huid flap chirurgische ingreep
<ol><li>Verdoof de axolotl door deze onder te dompelen in een container met 0,1% tricaïne-oplossing. Dit duurt ongeveer 15-20 minuten. Zorg ervoor dat de axolotl inderdaad volledig verdoofd is door een staartknijp uit te voeren. Als er geen reactie van de axolotl is, ga dan verder met de operatie. OPMERKING: Gebruik oudere, grotere axolotls voor deze operatie (minstens 15 cm groot). Zorg ervoor dat de axolotl gedurende de hele operatie goed gehydrateerd blijft door de huid periodiek nat te maken met axolotl-systeemwater met behulp van een plastic pipet. Zorg ervoor dat u de operatieplaats aseptisch voorbereidt door het gebied voorafgaand aan de operatie te irrigeren met steriele PBS. Het dier moet ook op een steriel chirurgisch gordijn worden geplaatst voor de procedure.</li>
	<li>Voer een ledemaatamputatie uit aan het distale uiteinde van de zeugopodiale skeletelementen met behulp van de ontleedschaar (figuur 1.1).</li>
	<li>Maak met de voorjaarsschaar een kleine incisie (ongeveer 2 mm) op het ventrale deel van de huid (figuur 1.2).</li>
	<li>Gebruik de tang om de huid voorzichtig terug te pellen tot ongeveer de middellijn van de zeugopodiale skeletelementen, waardoor de onderliggende ledemaatweefsels (spier, bot, enz.) worden blootgesteld (Figuur 1.3). Zorg ervoor dat u de huid niet beschadigt. Zie opmerking na stap 2.8.</li>
	<li>Amputer de blootgestelde onderliggende ledemaatweefsels aan de middellijn van de zeugopode met behulp van een chirurgische schaar (figuur 1.4).</li>
	<li>Duw het spierweefsel terug met de chirurgische schaar en trim het blootgestelde bot. OPMERKING: Dit is nodig om een betere genezing te garanderen en ook om het succes van de operatie te vergroten, omdat uitstekend bot tegen de gehechte flap kan worden gekarteld en later de integriteit van een intacte huidflap kan verstoren.</li>
	<li>Trek met behulp van de tang voorzichtig de extra huid van volledige dikte over het amputatievlak om de blootgestelde onderliggende weefsels en hechting op zijn plaats te bedekken door verbinding te maken met de ventrale huid van volledige dikte (figuur 1.5).</li>
	<li>Hecht de resterende rechter- en linkerkant van de huidflap in de onderliggende ventrale delen van de intacte huid. Dit kan worden gedaan door de zijkanten van de flap op een "kriskras" manier te hechten (aanbevolen) (figuur 1.6-1.9), of gewoon recht in de ventrale huid te hechten. Gebruik de tang en gebogen veerschaar voor het hechten. Zorg ervoor dat er geen blootgestelde onderliggende weefsels te zien zijn en dat hechtingen strak zijn vastgebonden (minstens drie keer geknoopt). OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de intacte huid niet wordt beschadigd in stap 2.4, 2.7-2.8. We hebben ontdekt dat schade aan de huid van volledige dikte is gecorreleerd met mislukte operaties, omdat de gebieden met schade nog steeds een kleine wondepidemis kunnen vormen. Probeer indien mogelijk een doffere tang te gebruiken bij het overhandigen van de huidflap van volledige dikte.</li>
	<li>Voer een amputatie uit op de contralaterale ledemaat (optionele interne diercontrole) door deze te amputeren op mid-zeugopod-niveau met een chirurgische schaar. Duw het spierweefsel terug met een chirurgische schaar en trim het blootgestelde bot. OPMERKING: Een interne contralaterale ledemaatcontrole kan worden uitgevoerd om het succes van de operatie tijdens stap 4 bij hetzelfde dier beter te beoordelen. Amputatie van dezelfde ledemaat in een afzonderlijk dier kan echter ook worden gebruikt om als controle te dienen.</li>
</ol>3. Postoperatief herstel en zorg
<ol><li>Zodra de operatie is voltooid, plaatst u een Kimwipe of steriele papieren handdoek op de bodem van de container of petrischaal om deze nat te maken. Plaats het dier in de container op nat ijs en wikkel de blootgestelde uiteinden van de Kimwipe of papieren handdoek voorzichtig rond de bovenkant van het dier om het goed gehydrateerd te houden met sulfamerazine-oplossing. Laat 30 minuten tot 1 uur op nat ijs staan om minimale beweging te garanderen tijdens het herstel van de anesthesie.</li>
	<li>Plaats het dier in een statische behuizingscontainer met 0,5% sulfamerazine-oplossing. Axolotls moeten de eerste 24 uur in deze oplossing blijven om infectie te voorkomen.</li>
	<li>Plaats de axolotl in normaal systeemwater en controleer de gezondheid dagelijks. Zorg ervoor dat er elke dag geen hechtingen uitvallen, omdat dit kan resulteren in de vorming van een kleine wond epidermis die de resultaten zal verstoren. OPMERKING: Zorg ervoor dat de behuizingscontainer voldoende ruimte heeft voor de axolotl om te bewegen en minimaliseer de kans dat de gehechte ledemaat op de axolotl in contact kan komen met de zijkanten van de container. Dit zal helpen om ervoor te zorgen dat de hechtingen op hun plaats blijven, vooral tijdens de eerste week na de operatie.</li>
</ol>4. Beoordeling van het succes van de operatie onder een stereomicroscoop
OPMERKING: We raden aan om dieren minstens één keer per week onder een stereomicroscoop te controleren om de integriteit van de volledige huidflap en het succes van de operatie te beoordelen.
<ol><li>Verdoof de axolotl in 0,1% tricaïne zoals in stap 2.1. Zorg ervoor dat er voldoende ruimte in de container is voor de axolotl om te bewegen.</li>
	<li>Als u de eerste twee weken na de operatie inspecteert, inspecteer dan de gehechte ledemaat met behulp van een stereomicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen hechtingen zijn uitgesprongen en dat een duidelijke dunne wondepidemis nergens zichtbaar is. Als u inspecteert in de derde week na de operatie of later, zorg er dan voor dat er geen blasteem is gevormd en vergelijk met hoe de normale controle geamputeerde ledemaat (van hetzelfde dier of een ander dier) zich tijdens de regeneratie heeft ontwikkeld (d.w.z. of zich een blasteem heeft gevormd).</li>
	<li>Als u klaar bent, brengt u de axolotl terug naar normale systeemwater- en houderijomstandigheden.</li>
</ol>

<ol><li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpallanzani%2C+L+%22Prodromo+Di+Un%27opera+Da+Imprimersi+Sopra+Le+Riproduzioni+Animali%22">Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali</a>. , Nella Stamperia di Giovanni Montanari (1768).</li>
<li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li>
<li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153(2018).</li>
<li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li>
<li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+limb+blastema%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li>
<li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li>
<li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024(2020).</li>
<li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li>
<li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li>
<li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li>
<li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li>
<li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li>
<li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+injury%2C+nerves%2C+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li>
<li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li>
<li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li>
<li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt%2C+Notophthalmus+viridescens%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li>
<li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li>
<li>Singer, M., Saltpeter, M. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSinger%2C+M+%22Growth+in+Living+Systems%22">Growth in Living Systems</a>. Zarrow, M. X. , Basic Books. New York. (1961).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li>
<li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li>
<li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Entwmech%22%5BJournal%5D)">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li>
<li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li>
<li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li>
<li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li>
<li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li>
<li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286(2017).</li>
<li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li>
<li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16(2013).</li>
<li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li>
<li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt%2C+Cynops+pyrrhogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831(2014).</li>
<li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li>
<li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+%28Bolitoglossa+ramosi%29+for+limb+regeneration+research%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li>
<li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li>
<li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li>
<li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+axolotl+%28Ambystoma+mexicanum%29+husbandry%2C+breeding%2C+metamorphosis%2C+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li>
<li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+salamanders%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li>
<li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft een protocol voor het uitvoeren van volledige huidflapoperaties in axolotl-ledematen om de vorming van wondepidemis te remmen. Hoewel deze operatie relatief eenvoudig en technisch reproduceerbaar is in vergelijking met andere methoden om de vorming van wondepidemis te remmen, zijn er verschillende kritieke stappen die het succes van de operatie kunnen beïnvloeden. Ten eerste, bij het trekken van de intacte volledige huidflap over de blootgestelde onderliggende weefsels, is het van het grootste belang dat de huid van volledige dikte op geen enkele manier wordt beschadigd. Schade aan de huidflap kan nog steeds leiden tot de vorming van een kleine wondepidemis, wat kan resulteren in een kleine blasteemachtige uitgroei. Ten tweede, zorg ervoor dat hechtingen niet uitvallen tijdens postoperatieve zorg, omdat dit ook kan leiden tot de vorming van een kleine wond epidermis. Tot nu toe is het minimaliseren van het potentiële contact tussen de gehechte ledemaat en eventuele oppervlakken belangrijk, vooral tijdens de eerste week na de operatie. Verschillende manieren om dit te voorkomen zijn het huisvesten en verdoven van de axolotl in een container die groot genoeg is, zodat de axolotl voldoende ruimte heeft om na de operatie te bewegen.
Deze operatie heeft ook verschillende beperkingen. Misschien wel het meest opvallende is dat het succes van operaties slechts op twee manieren kan worden beoordeeld: het gebruik van de ontleedkijker tijdens de eerste twee weken van de operatie om te zoeken naar een afwezigheid van een wondepidemis en / of controleren of zich binnen 3 weken een blasteem vormt. Hoewel deze methoden effectief zijn, hebben ze een relatief lage doorvoer. De ontwikkeling van toekomstige transgene reporter axolotls voor wond epidermis-specifieke markers kan helpen bij een snellere screening op succesvolle versus mislukte operaties. Bovendien is deze operatie moeilijker uit te voeren bij jongere dieren omdat de intacte huid kwetsbaarder is. Het gebruik van sub-volwassen of volwassen axolotls wordt daarom aanbevolen.
Hoewel deze operatie oorspronkelijk werd ontwikkeld in N. viridiscens19, is het gemakkelijk aangepast voor axolotls25,39 en kan het waarschijnlijk ook op andere salamandersoorten worden toegepast. Kortom, het toepassen van deze techniek op toekomstige ledemaatregeneratieve studies zal onderzoekers in staat stellen om zowel meer hulpmiddelen te ontwikkelen om wondepidemisbiologie aan te pakken als de onderliggende mechanismen te identificeren die de functie ervan bij het initiëren van blasteemvorming stimuleren.

Sinds Lazzaro Spallanzani het in 17681 meldde, is de regeneratie van salamanderpen een van de best bestudeerde natuurlijke regeneratieve fenomenen die biologen eeuwenlang heeft gecharmeerd. Succesvolle ledemaatregeneratie hangt af van de vorming, uitgroei en daaropvolgende patronen van een ongedifferentieerde cellulaire structuur die bekend staat als het blasteem. Onderzoekers hebben aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het begrijpen van de cellulaire samenstelling van het blasteem en welke ondersteunende weefsels en celtypen nodig zijn voor de vorming ervan2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Toch blijven de gecoördineerde signaleringsmechanismen tussen verschillende weefsels en celtypen die leiden tot het initiëren van blasteemvorming slecht begrepen.
Een belangrijke vereiste voor succesvolle blasteemvorming en regeneratie is de wondepidemis, een voorbijgaand en gespecialiseerd epitheel dat het amputatievlak binnen 12 uur na amputatie bedekt10. Na amputatie migreren epitheelcellen van de intacte huid proximaal naar de verwonding snel over het amputatievlak om een dun wondepitheel te vormen14. Naarmate het blasteem zich in de volgende weken vormt, ontwikkelt de vroege wondepidemis zich tot een dikkere epitheliale signaleringsstructuur die de apicale epitheliale dop (AEC) wordt genoemd15. Terwijl de normale huid van volledige dikte zowel een epitheliale als een dermale laag bevat, gescheiden door een basale lamina, bestaat de wondepithina/AEC alleen uit een epitheellaag en ontbreekt een basale lamina16,17. De afwezigheid van de basale lamina en dermis zorgt voor direct contact tussen de wondepitheelcellen en de onderliggende weefsels, wat bidirectionele signalering tussen de twee compartimenten vergemakkelijkt die van cruciaal belang is voor zowel blasteemvorming als onderhoud17,18.
Klassieke experimentele studies bedachten verschillende innovatieve chirurgische methoden om wondepidemis / AEC-functie en noodzaak te onderzoeken via het remmen van de vorming ervan. Deze methoden omvatten het hechten19 of enten van huid van volledige dikte20,21 over het amputatievlak, het onmiddellijk hechten van de geamputeerde ledemaat in de lichaamsholte22 en continue dagelijkse verwijdering of bestraling van de vroege wondepithoffer en AEC23,24. Al met al hebben deze experimenten niet alleen het belang van de wondepidemis / AEC vastgesteld, maar ook de rol ervan in vroege weefselhistolyse verder bepaald, evenals het handhaven van proliferatie van voorlopercelen en blastemale uitgroei13 tijdens de regeneratie.
Deze eerdere studies waren echter grotendeels beperkt tot histologische kleuring en tritiated thymidine-pulsen om celproliferatie te volgen. In feite is het opnieuw bekijken van deze klassieke experimenten met moderne sequencingtechnologieën en functionele technieken in salamanders pas onlangs gedaan en heeft dit geleid tot de ontdekking van extra rollen voor de wondepidemis bij het moduleren van ontsteking en ECM-degradatie / afzetting tijdens vroege stadia van regeneratie25. Met de afgifte van verschillende salamandergenoom- en transcriptoomsequenties26,27,28,29,30,31,32,33,34, evenals het ontluikende aantal functionele methoden dat beschikbaar is bij salamandersoorten11,35,36,37,38 , zijn onderzoekers nu goed gepositioneerd om te beginnen met het ontrafelen van de moleculaire mechanismen die de vorming, functie en AEC-ontwikkeling van wondepidemis aansturen.
Helaas zijn verschillende van deze klassieke methoden die worden gebruikt om de vorming van wondepidemis te remmen technisch uitdagend, wat problemen oplevert voor de reproduceerbaarheid tussen biologische replicaties in hetzelfde experiment. Het onderhouden van huidtransplantaten kan bijvoorbeeld een uitdaging zijn, omdat grafts uiteindelijk van de ledemaat van de gastheer kunnen vallen en het dagelijks verwijderen van de wondepidemis / AEC moeilijk is zonder de onderliggende weefsels te beschadigen. Bovendien is het hechten van de geamputeerde ledemaat in de lichaamsholte een uitdaging en vereist het ook extra letsel op de plaats van inbrenging. Aan de andere kant is het hechten van de huid van volledige dikte onmiddellijk over het amputatievlak relatief eenvoudig, technisch reproduceerbaar en introduceert het minimale weefselschade. Deze full skin flap (FSF) chirurgische methode werd eerder ontwikkeld door Anthony Mescher in 1976 bij volwassen salamanders (Notophthalmus viridiscens). Hij toonde aan dat de FSF-operatie de vorming en functie van wondepithinamis remde door zowel epitheelcelmigratie over het amputatievlak als direct contact tussen epitheelcellen en de onderliggende weefsels te verbieden.
Hier wordt deze chirurgische ingreep stap voor stap getoond met behulp van de axolotl-ledemaat. In combinatie met moderne moleculaire en sequencingtechnologieën, kan deze techniek zeer nuttig blijken te zijn voor onderzoekers om ons begrip van wondepidemis / AEC-vorming en -functie tijdens ledemaatregeneratie te verdiepen.

<table><tbody><tr><td>Gebogen veerscharen</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Twee paar nodig</td></tr><tr><td>Nylon monofilament hechtdraad (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazine natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

remming van wond epidermisvorming via volledige huidflapchirurgie tijdens axolotl limb regeneration

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Klassieke experimenten in salamander regeneratieve biologie in de afgelopen eeuw hebben al lang vastgesteld dat de wond epidermis een cruciale signaleringsstructuur is die snel na amputatie wordt gevormd en nodig is voor ledemaatregeneratie. Methoden om de precieze functie ervan op moleculair niveau te bestuderen in de afgelopen decennia zijn echter beperkt vanwege een gebrek aan precieze functionele technieken en genomische informatie die beschikbaar is in salamandermodelsystemen. Opwindend genoeg maakt de recente overvloed aan sequencingtechnologieën in combinatie met de release van verschillende salamandergenomen en de komst van functionele genetische testmethoden, waaronder CRISPR, het mogelijk om deze fundamentele experimenten opnieuw te bezoeken met een ongekende moleculaire resolutie. Hier beschrijf ik hoe de klassiek ontwikkelde full skin flap (FSF) -operatie bij volwassen axolotls moet worden uitgevoerd om de vorming van wondepidemis onmiddellijk na amputatie te remmen. De wondepidemis vormt zich normaal gesproken via distale migratie van epitheelcellen in de huid proximaal naar het amputatievlak om de wond af te sluiten van de externe omgeving. De operatie omvat het onmiddellijk hechten van de huid van volledige dikte (die zowel epidermale als dermale lagen omvat) over het amputatievlak om epitheelcelmigratie en contact met de onderliggende beschadigde mesenchymale weefsels te belemmeren. Succesvolle operaties resulteren in de remming van blasteemvorming en ledemaatregeneratie. Door deze chirurgische methode te combineren met hedendaagse downstream moleculaire en functionele analyses, kunnen onderzoekers beginnen met het blootleggen van de moleculaire onderbouwing van wond epidermisfunctie en biologie tijdens ledemaatregeneratie.

Dit chirurgische protocol zorgt voor de volledige remming van de vorming van de wondepidemis (figuur 1) en uiteindelijk voor de regeneratie van de ledematen. Een succesvolle operatie resulteert in geen blasteemvorming in ongeveer 2-3 weken, afhankelijk van de grootte van het dier, terwijl controle regenererende ledematen normaal gesproken een blasteem zouden moeten vormen.
Onderzoekers moeten de gehechte ledemaat om de 2-3 dagen met het blote oog inspecteren om er zeker van te zijn dat de hechtingen er niet uit zijn gesprongen en dat er zich geen blasteem vormt. Als een of meer van de hechtingen eruit springen, kan zich nog steeds een wondepidemis vormen, wat resulteert in een klein of groot blasteem en een mislukte operatie (figuur 2). Bovendien moeten onderzoekers de gehechte ledemaat minstens één keer per week onder een stereomicroscoop inspecteren om er zeker van te zijn dat een dunne wondepidemis nergens op het amputatieoppervlak zichtbaar is. Ter vergelijking moeten onderzoekers ook de controle regenererende ledemaat onderzoeken die een wondepithdermis over het amputatievlak moet hebben en gedurende 2-3 weken een blasteem moet vormen. De wond epidermis zal dun en helder lijken, terwijl de normale huid meer ondoorzichtig en lichtroze (bijna wit), lichtgeel of donkergroen zal lijken in respectievelijk leucistische, albino- of wildtype axolotls.
Als onderzoekers weefsel willen verzamelen voorafgaand aan de blasteemvormingsstadia na 2-3 weken, moeten ze de gehechte ledematen inspecteren voorafgaand aan de monsterverzameling om er zeker van te zijn dat de hechtingen op hun plaats bleven en dat er geen kleine wondepidemi werd gevormd. Bovendien kan het sagitisch doorsnijden van het gehechte ledemaatweefsel en het uitvoeren van histologische analyses op elk moment ook de aanwezigheid van de dermis van de volledige huidflap rond het hele amputatievlak en de afwezigheid van een wondepithdermis verifiëren (figuur 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de stappen van de volledige huidflapoperatie. De stappen van het protocol zijn hier genummerd en in een diagram weergegeven. De stippellijnen geven de amputatievlakken aan bij stap 1 en 3 van het protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Figuur 2: Voorbeelden van succesvolle en mislukte volledige huidflapoperaties. Representatief brightfield-beeld van een ledemaat dat een succesvolle operatie heeft ondergaan (links), een mislukte operatie (rechts) en een controle regenererende ledemaat (geen operatie) 25 dagen na amputatie (dpa). De succesvolle operatie heeft een plat amputatievlak waar de volledige huidflap overheen werd gehecht, terwijl de mislukte operatie een klein blasteem ontwikkelt. Pijlpunten geven het amputatievlak aan en witte stippellijnen zijn er om de visualisatie van de afwezigheid van een blasteem in de succesvolle operatie en de aanwezigheid van blastema's in de mislukte operatie te helpen visualiseren en regenererende ledematen te beheersen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Figuur 3: Histologische kleuring van normale regenererende en FSF gehechte ledematen. (A-B') Representatieve brightfield-afbeeldingen van picro-mallory gekleurde secties van regenererende (A-A') en gehechte axolotl-ledematen (B-B') bij 7 dpa. Inzetstukken in A en B worden weergegeven in respectievelijk A' en B'. De collageenzware huidlaag bekleedt en bedekt het hele amputatievlak in gehechte ledematen. Amputatievlak wordt aangeduid met pijlpunten in A-B. Schaalbalken vertegenwoordigen 500 μm. Dit cijfer is overgenomen van Tsai et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit artikel beschrijft hoe een chirurgische methode kan worden uitgevoerd om de vorming van wondepidemis te remmen tijdens axolotl ledemaatregeneratie door de huid van volledige dikte onmiddellijk over het amputatievlak te hechten. Met deze methode kunnen onderzoekers de functionele rollen van de wondepidemis onderzoeken tijdens de vroege stadia van ledemaatregeneratie.

Remming van wond epidermisvorming via volledige huidflapchirurgie tijdens Axolotl Limb Regeneration

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

Axolotl-ledregeneratie vereist een gespecialiseerde wondepidermis. Deze chirurgie remt de vorming van wondepidermis en kan worden gecombineerd met moleculaire en functionele technieken om ledregeneratie te bestuderen. Het grote voordeel van dit protocol is dat het efficiënt en technisch reproduceerbaar is.Deze chirurgische methode biedt onderzoekers een hulpmiddel om de functie van de wondepidermis te onderzoeken en ons begrip van waarom deze structuur cruciaal is voor regeneratie te bevorderen. Na te hebben gecontroleerd of de axolotl volledig verdoofd is, voer de ledamputatie uit aan het distale uiteinde van de skeletelementen van het zeugopodium met behulp van de dissectiescharen. Maak vervolgens met behulp van veerscharen een kleine incisie op het ventrale deel van de huid.Gebruik de pincetten om voorzichtig de huid terug te trekken tot ongeveer de middellijn van de skeletelementen van het zeugopodium, waarbij de onderliggende ledtissues worden blootgelegd, terwijl erop wordt gelet dat de huid niet wordt beschadigd. Gebruik indien mogelijk een doffere set pincetten bij het hanteren van de volledige dikte huidflap om schade te voorkomen. Amputeer de blootgestelde onderliggende ledtissues op de middellijn van het zeugopod met de chirurgische schaar, en duw vervolgens het spierweefsel terug met de chirurgische schaar en snijd het blootgestelde bot bij.Trek voorzichtig de extra huid met volledige dikte over het amputatiesvlak om de blootgestelde onderliggende weefsels te bedekken, waarbij erop wordt gelet dat de huidflap zijn structurele integriteit behoudt. Naai het aan de ventrale huid met volledige dikte. Gebruik de pincetten en gebogen veerscharen om de resterende rechter- en linkerkanten van de huidflap op een kruisende manier te naaien in de onderliggende ventrale delen van intacte huid.Als u klaar bent, zorg er dan voor dat er geen blootgestelde onderliggende weefsels zichtbaar zijn en dat de hechtingen strak gebonden zijn en minimaal drie keer zijn geknot. Als optionele interne controle, voer een amputaties uit op het contralaterale led op het niveau van het midden van het zeugopod met chirurgische schaar, en duw vervolgens het spierweefsel terug met chirurgische schaar en snijd het blootgestelde bot bij. Plaats de delicate-task-doek op de bodem van een container met sulfamerazinesoplossing op ijs.Plaats vervolgens de axolotl in de container en wikkel de blootgestelde uiteinden van de doek voorzichtig om de bovenkant van het dier om het goed gehydrateerd te houden. Laat het 30 minuten tot een uur op ijs om minimale beweging tijdens herstel van de verdoving te garanderen, en plaats het vervolgens in een statische behuizingscontainer met 0,5% sulfamerazinesoplossing. Axolotls moeten de eerste 24 uur na de operatie in deze oplossing blijven om infectie te voorkomen.Dit chirurgische protocol maakt volledige remming van de vorming van wondepidermis en uiteindelijk ledregeneratie mogelijk. Het is belangrijk om de gehechte led dagelijks te inspecteren. Als een of meer van de hechtingen uitvallen, kan zich een wondepidermis vormen, wat resulteert in een klein of groot blasteem en een onsuccesvolle operatie.Het sagittaal doorsnijden van het gehechte ledweefsel en het uitvoeren van histologische analyses op elk tijdstip kan ook de aanwezigheid van de dermis van de volledige huidflap en de cirkelvormige gehele amputatiesvlak in de afwezigheid van een wondepidermis verifiëren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de huidflap zijn structurele integriteit behoudt en het amputatiesvlak bedekt. Het strak knopen van de hechtingen en ervoor zorgen dat de flap veilig is, is ook cruciaal voor het succes van het protocol.Deze methode kan worden gecombineerd met downstream-analyses, waaronder RNA-sequencing of functionele technieken, inclusief ectopische genetische overexpressie, om nieuwe moleculaire regulatoren van wondepidermisfunctie en ledregeneratie te identificeren.

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Hier is een protocol voor het uitvoeren van tijd-en ruimtebeperkt gen knock-out in Axolotl ruggengraat koorden door het injecteren van CAS9-gRNA complex in het ruggenmerg centrale kanaal gevolgd door elektroporation.

Directe gen knock-out van Axolotl ruggenmerg neurale stamcellen via Elektroporation van CAS9 proteïne-gRNA complexen

Dit doel van dit protocol is het produceren van chimerische axolotls met haploïde voorpoten afgeleid van Cas9-mutagenized donorweefsel met behulp van embryonale weefsel enten technieken.

Generatie chimeric Axolotls met Mutant Haploid Ledematen door embryonale grafting

Dit manuscript presenteert protocollen voor het chirurgisch toebrengen van gecontroleerde bot en scherpe ruggenmergletsels aan een regeneratieve Axolotl (Ambystoma mexicanum).

Contusie ruggenmergletsel via een microchirurgische laminectomie in de regeneratieve axolotl

Het doel van deze studie was om een murine model van burn wound healing te ontwikkelen. Een thermische brandwond werd veroorzaakt op de rughuid van muizen met behulp van een voorverwarmde messing sjabloon. Verbrand weefsel werd gedebrideerd en bedekt met een huidtransplantatie geoogst uit de staart van een genetisch vergelijkbare donormuis.

Een Murine Model van een burn wound gereconstrueerd met een allogene huidtransplantatie

Dit protocol beschrijft hoe bilaterale excisionale wonden met volledige dikte bij muizen kunnen worden gegenereerd en hoe u de wonden vervolgens controleren, oogsten en voorbereiden op morfometrische analyse. Inbegrepen is een diepgaande beschrijving van het gebruik van seriële histologische secties om morfometrische defecten te definiëren, nauwkeurig te kwantificeren en op te sporen.

Murine Excisional Wound Healing Model en Histological Morphometric Wound Analysis

Xenopus tropicalis is een ideaal model voor regeneratief onderzoek, omdat veel van zijn organen een opmerkelijk regeneratief vermogen bezitten. Hier presenteren we een methode voor het construeren van een hartletselmodel in X. tropicalis via apexsectie.

Een apicale resectiemodel in het volwassen Xenopus tropicalis-hart

Een protocol voor femorale osteotomiechirurgie met behulp van interne plaatfixatie bij volwassen axolotls wordt gepresenteerd. De procedure kan worden gebruikt om vergelijkende studies uit te voeren naar de regeneratie van ledematen en de genezing van fracturen bij aquatische amfibieën.

Stabiliseren van een dijbeenosteotomie met een plaatfixatie bij Ambystoma mexicanum

In dit protocol laten we zien hoe axolotlweefsel kan worden voorbereid op atoomkrachtmicroscopie (AFM) en hoe indrukmetingen kunnen worden uitgevoerd in intact en regenererend kraakbeen van ledematen.

Atoomkrachtmicroscopie Metingen van kraakbeen in intacte en regenererende axolotl-ledematen

Het doel van deze studie was om een veilige en reproduceerbare chirurgische aanpak te standaardiseren voor het uitvoeren van een volledige transversale amputatie van de mandibula in Ambystoma mexicanum voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie.

Ontwerp en standaardisatie van een model voor mandibulair letsel voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie in het Ambystoma mexicanum model

Leer een chirurgische methode om wond-epidermisvorming te remmen tijdens ledemaatregeneratie bij axolotls (Ambystoma mexicanum). Dit protocol is efficiënt en reproduceerbaar voor moleculaire analyses.

Remming van wond epidermisvorming via volledige huidflapchirurgie tijdens Axolotl Limb Regeneration

Meer video's verkennen