Name: Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Leer minimale volume vitrificatie van onvolwassen kattenoöcyten voor vruchtbaarheidsbehoud en biodiversiteitsconservering. Dit protocol optimaliseert cryopreservatie met laboratoriumgemaakte media.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd mede ondersteund door EVSSAR (European Veterinary Society for Small Animal Reproduction) Grant 2016 en door Università degli Studi di Milano, Piano di Sostegno alla Ricerca 2019 (Linea 2 Azione A). We willen ook dr. MariaGiorgia Morselli bedanken voor haar bijdrage aan de experimenten die hierbij worden afgebeeld en aan de beeldaanwinst.

De afgebeelde procedures hebben geen ethische goedkeuring ondergaan, aangezien kattenstokken bij veterinaire klinieken werden verzameld als bijproducten van door de eigenaar gevraagde routineovariectomie of ovariohysterectomie.
1. Oocytencollectie
<ol><li>Bereid voor aanvang van de experimenten oplossingen voor eierstok- en eicelcollectie. Bereid eierstokverzameloplossing met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een mengsel van antibiotica en antimycotica (100 IU/mL penicilline G natrium, 0,1 mg/mL streptomycinesulfaat, 0,25 μg/mL amphotericine B). Bereid oocytenopvangoplossing (d.w.z. PBS/PVA) met PBS met 100 IU/mL penicilline G natrium, 0,1 mg/mL streptomycinesulfaat en 0,1% (w/v) polyvinylalcohol (PVA).</li>
	<li>Bewaar oplossingen voor eierstok- en eicelverzameling bij 4 °C tot gebruik.</li>
	<li>Neem op de dag van het kuurwerk van koninginnen, enkele uren voor de verwerking van de monsters, een deel van eierstok- en eicelleninzamelingsoplossingen en laat ze opwarmen bij kamertemperatuur (RT; 25 ± 2 °C).</li>
	<li>Wanneer monsters aankomen in het lab, isoleren van de eierstokken uit de omliggende bindweefsel en van de eicel en was ze in verse eierstok collectie medium in een petrischaal.</li>
	<li>Vul een 35 mm petrischaal voor elke koningin met ongeveer 3 mL RT PBS/PVA, en nog een schotel om de eicellen te verzamelen.</li>
	<li>Plaats een paar eierstokken in een petrischaaltje en maak gehakt van de cortex met een chirurgische scalpel. Zorg ervoor dat alle follikels zijn gebroken met behulp van een stereomicroscoop (vergroting 8x).</li>
	<li>Verzamel COC's met een pipet en verplaats ze in verse PBS/PVA in de toegewezen petrischaal. Selecteer goede eigenschappen COC's, met een homogeen, donker cytoplasma en omgeven door verschillende compacte lagen cumuluscellen (graad I18).</li>
</ol>2. Verglaringing
<ol><li>Bereid evenwichts- en verglaasingsmedia voor.<ol>
<li>Bereid evenwichtsoplossing (ES) voor met 7,5% ethyleenglycol (EG) en 7,5% (v/v) dimethylsulphoxide (DMSO) in Medium 199, met 20% foetaal runderserum (FBS).</li>
		<li>Bereid vitrification solution (VS) voor met 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO en 0,5 M sacharose in Medium 199, met 20% FBS (gewijzigd vanaf 19).</li>
		<li>Laat ES en VS opwarmen bij RT voor gebruik. OPMERKING: Cryoprotectants (bijvoorbeeld EG, DMSO) staan bekend als cytotoxisch. Een strategie om hun toxiciteit tegen te gaan is het verminderen van de temperatuur waarbij de cellen worden blootgesteld aan hen20, en eicellen worden meestal blootgesteld aan cryoprotectiva op RT. Zo wordt de hele procedure, van eicelinzameling tot vitrificatie, uitgevoerd bij RT in dit protocol om temperatuurschommelingen te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de vitrification schotel (dat wil zeggen, een speciaal gerecht bestaande uit zes kegelvormige putten verdeeld in twee rijen, bekend als "Repro plate"). Bereid een rij (drie putten) voor elke vitrification ondersteuning.<ol>
<li>Voeg 20 μL ES toe aan de onderkant van de eerste put.</li>
		<li>Voeg 300 μL VS toe aan de onderkant van de tweede (d.w.z. 1VS) en derde (d.w.z. 2VS) putten.</li>
	</ol></li>
	<li>Equilibrate COC's in ES.<ol>
<li>Met een kleine boring pipet (bijvoorbeeld, een Pasteur pipet getrokken op een Bunsen snavel om het dunner te maken - diameter moet ten minste 200 μm), breng een (of meer) COC(s) op de bodem van de eerste put. OPMERKING: Kies de grootte van de pipet op basis van het aantal lagen cumuluscellen rond de eicellen, dus naar coc-afmetingen, met als doel om het volume van de media die in elke stap wordt overgedragen met COC's, zoveel mogelijk te verminderen. Met het huidige protocol kunnen getrainde operators met succes tot acht katachtige COC's per vitrification-ondersteuning met succes verglaasen.</li>
		<li>Voeg langzaam 20 μL ES toe aan de rand van de druppel. Wacht 3 minuten.</li>
		<li>Voeg langzaam andere 20 μL ES toe aan de rand van de druppel. Wacht 3 minuten.</li>
		<li>Voeg langzaam 240 μL ES toe aan de rand van de druppel. Wacht 9 minuten.</li>
		<li>Tijdens het wachten, bereid een doos met vloeibare stikstof (LN2), label een vitrification ondersteuning met het experiment / kat identificatiecode en laat het open. Zet ze allebei in de buurt van de stereomicroscoop, zodat ze gemakkelijk bereikbaar zijn tijdens het werken. Voorzichtigheid! Draag persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van LN2.</li>
		<li>Als er meerdere COC's moeten worden verglaasd, begint u ook aan de eerste evenwichtsstap (zie stap 2.3.1 - 2.3.2) voor een andere groep COC's (die op een nieuwe vitrificatieondersteuning zal worden geladen).</li>
	</ol></li>
	<li>Vitrify COC's in VS in minder dan 90 seconden.<ol>
<li>Met behulp van dezelfde kleine boring pipet, vul het met 1VS, neem de COCs van de bodem van de eerste put (ES) en verplaats ze naar het oppervlak van de tweede put (1VS).</li>
		<li>Was de pipet met 1VS.</li>
		<li>Neem de COC's en verplaats ze in een ander gebied (op de bodem) van de put; meng het medium eromheen met de pipet.</li>
		<li>Vul de pipet met 1VS in een ander gebied van de put, neem de COC's, verplaats ze en meng het medium eromheen met de pipet.</li>
		<li>Herhaal stap 2.4.4.</li>
		<li>Was de pipet met 2VS.</li>
		<li>Neem de COC's en verplaats ze op de bodem van de derde put (2VS); meng het medium eromheen met de pipet.</li>
		<li>Vul de pipet met 2VS in een ander gebied van de put, neem de COC's, verplaats ze en meng het medium eromheen met de pipet.</li>
		<li>Herhaal stap 2.4.8.</li>
		<li>Vul de pipet met 2VS in een ander gebied van de put, neem de COC's en laad ze op de strook van de vitrification-ondersteuning, zo dicht mogelijk bij de punt. Aanzuigen overtollig medium om het volume van VS zo veel mogelijk te verminderen.</li>
		<li>Onmiddellijk duik de vitrification steun in LN2, verplaatsen. Sluit het met behulp van een aantal klemmen, zorg ervoor dat het altijd blijft ondergedompeld in LN2. OPMERKING: Het behouden van de juiste timing is cruciaal vanwege cryoprotectant celtoxiciteit. Vanwege hun hoge concentratie in vitrification media, cel blootstelling moet worden gecontroleerd, ook door vlekkeloze uitvoering van de techniek21. Als monsters overvloedig zijn, overwegen ze te verdelen om ze sneller te verwerken en de hoeveelheid tijd van oocyte verzameling tot vitrificatie te minimaliseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewaar de geladen vitrificatiesteunen in een beker en bewaar ze in een opslag LN2 tank tot de opwarming. OPMERKING: Alle voorgaande stappen van het protocol kunnen ook worden toegepast in veldomstandigheden als LN2 beschikbaar is. Een droge verlader zal nodig zijn om de monsters veilig naar het lab te vervoeren en vervolgens daar heen te gaan met de volgende fasen.</li>
</ol>3. Opwarming
<ol><li>Bereid opwarmende media voor.<ol>
<li>Bereid ontdooioplossing (TS) voor met 1 M sucrose in Medium 199, met 20% FBS.</li>
		<li>Bereid verdunningsoplossing (DS) met 0,5 M sacharose in Medium 199, met 20% FBS.</li>
		<li>Bereid wasoplossing (WS) voor met Medium 199 met 20% FBS.</li>
		<li>Verwarm ts voor gebruik op tot 38 °C en DS en WS bij RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid indien nodig het kweekmedium voor op het latere gebruik van opgewarmde COC's (bijvoorbeeld in vitro rijping, IVM).</li>
	<li>Plaats het verwarmingsstadium dicht bij de stereomicroscoop en zet deze aan (38 °C). Doe het deksel van een petrischaaltje om op te warmen.</li>
	<li>Wanneer alles klaar is, breng je de vitrificatiesteunen die van de opslagtank moeten worden opgewarmd naar een doos met LN2,over en zet je de doos in de buurt van de stereomicroscoop.</li>
	<li>Bereid de "Repro plate" voor. Bereid een rij voor voor elke vitrificatie ondersteuning die moet worden opgewarmd.<ol>
<li>Voeg 300 μL DS toe aan de onderkant van de eerste put.</li>
		<li>Voeg 300 μL WS toe aan de onderkant van de tweede (d.w.z., 1WS) en derde (d.w.z., 2WS) putten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Maak een druppel TS (100 μL) op het deksel van de petrischaal.</li>
	<li>Open met klemmen één vitrificatiesteun in de LN2.</li>
	<li>Zet de TS-druppel onder de stereomicroscoop en neem met één snelle beweging de vitrificatieondersteuning van de LN2 en dompel de strip onder in de druppel, en verplaats deze totdat alle COC's loskomen. Verwijder de steun uit de druppel zodra deze leeg is, maar laat de COC's in totaal 1 minuut in TS staan (van onderdompeling tot de volgende stap).</li>
	<li>Neem een pipet vergelijkbaar met die gebruikt voor vitrification en vul het met DS. Neem de COC's uit de drop (TS) en verplaats ze naar de bodem van de eerste put (DS). Wacht 3 minuten.</li>
	<li>Was de pipet met 1WS. Neem de COC's en verplaats ze op de bodem van de tweede put (1WS). Wacht 5 minuten.</li>
	<li>Was de pipet met 2WS. Neem de COC's en verplaats ze op het oppervlak van de derde put (2WS). Wacht tot ze de bodem van de put aanraken.</li>
	<li>Herhaal stap 3.11 met behulp van een ander gebied van de put.</li>
	<li>Was de pipet met cultuurmedium en verplaats de eicellen naar de kweekschaal voor het volgende gebruik (bijvoorbeeld IVM).</li>
</ol>

<ol><li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+social+implications+of+embryo+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li>
<li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li>
<li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li>
<li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li>
<li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia+and+mammalian+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li>
<li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li>
<li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li>
<li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).</li>
<li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+The+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73(2007).</li>
<li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification%2C+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li>
<li>Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li>
<li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329(2019).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture%3A+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li>
<li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature%2C+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li>
<li>Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li>
<li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cryobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncofertility+-+Fertility+preservation+for+Cancer+Survivors%22%5BJournal%5D)">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li>
<li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li>
<li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li>
<li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li>
<li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos%3A+current+problems+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li>
<li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li>
<li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+%28Felis+catus%29+in+reproductive+season%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li>
<li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viability+of+Serval+%28Leptailurus+serval%29+and+Pallas+Cat+%28Felis+manul%29+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Oocyte cryopreservatie is een cruciale kiemplasma behoud techniek, vooral in taxa waar veel soorten worden bedreigd, zoals Felidae familie. In dit manuscript werd een eenvoudig en veldvriendelijk protocol voor de vitrificatie van onrijpe katoocyten gepresenteerd. Laboratoriummedia, ondersteuning van het minimale volume vitrification en opgeleid personeel zijn de belangrijkste factoren voor het succes van deze methode, die het mogelijk maakt om consequent en herhaaldelijk levensvatbare eicellen te verkrijgen, zoals blijkt...

Cryopreservatie is uitgegroeid tot een belangrijke stap van geassisteerde reproductietechnieken (ART's). Bij mensen, het maakt het behoud van de vruchtbaarheid of uitstel van het ouderschap om medische of persoonlijke redenen. Bij dieren is het noodzakelijk om afstand en tijd in geplande paringen te overwinnen, vooral bij boerderijdieren en huisdieren, of om genetisch materiaal van waardevolle onderwerpen in instandhoudingsprogramma's te behouden, met name bij bedreigde diersoorten. Gamete cryopreservatie is de beste keuze wanneer de te fokken personen nog niet zijn gekozen of om ethische problemen in verband met het invriezen van embryo's te voorkomen, vooral in de menselijke geneeskunde1. Spermatozoa zijn relatief eenvoudig te bewaren en geven bevredigende resultaten na ontdooien, maar eicellen, vanwege hun structurele kenmerken, misschien complexer op te slaan. Inderdaad, de lage oppervlakte /volume verhouding, evenals de aanwezigheid van de zona pellucida rond de ooplasma, beperkt de beweging van cryoprotectiva en water over de cel2. Bovendien worden ze bij huisdieren, waaronder feliden, gekenmerkt door een lipiderijk cytoplasma, waarvan wordt gedacht dat ze gevoeliger zijn voor cryopreservatie3.
De meeste feliden worden bedreigd, en de binnenlandse kat wordt gebruikt als een model om protocollen te ontwikkelen voor het behoud van kiemplasma dankzij de beschikbaarheid van gonaden van routine ovariectomie. Bij wilde dieren kunnen geslachtsklieren worden verkregen na electieve operaties of (vaker) postmortem,en onrijpe (kiemvellen) kunnen worden opgehaald. Hormonale stimulatie gericht op het verkrijgen van volwassen (metafase II) eicellen is niet zo gebruikelijk als in de menselijke ARTs vanwege de ethische kwesties en de soort- en individueel-specifieke reactie op behandelingen4.
Daarom is de ontwikkeling van cryopreservatie strategieën is gericht op onvolwassen gameten, die meestal kan worden opgehaald na de onverwachte of plotselinge dood van zeldzame individuen. Vanuit biologisch oogpunt zijn er enkele verschillen in de cryopreservatie van onrijpe of volwassen gameten, elk met zijn voordelen. Ten eerste is DNA beter beschermd in onrijpe eicellen, waarvan de kiemvezel chromosomen bevat die zijn omgeven door een nucleair membraan, terwijl de meiotische as van metafase II-eicellen kwetsbaarder zou kunnen zijn voor cryoinjuries5. Ten tweede kunnen koud-geïnduceerde cytoskeletschade de rotatie van de as, de extrusie van het polaire lichaam, de pronucleaire migratie en cytokinese beïnvloeden, wat verschillende effecten kan hebben volgens de ontwikkelingsfase van oocyten, die meioseprogressie of post-fersiegebeurtenissen beïnvloedt. Tot slot, en misschien wel het belangrijkste, terwijl volwassen eicellen klaar zijn om bevrucht te worden, vertrouwen onrijpe gameten op de steun van de omliggende cumuluscellen om door nucleaire en cytoplasmamische rijping te gaan6, en dit is de reden waarom hele cumulus-eicellencomplexen (COC's) worden gehuild. Echter, het verlies van cumulus cellen en / of het verlies van functionele verbinding tussen de gamete en de omliggende somatische cellen zijn waarschijnlijk het meest nadelige effect van cryopreservatie van onrijpe COCs.
Onder cryopreservatie technieken, vitrification is er een die gemakkelijker kan worden toegepast in het veld voorwaarden. In vergelijking met langzame (of gecontroleerde snelheid) bevriezing, vitrification is sneller en vereist geen specifieke apparatuur, zoals een programmeerbare vriezer. Om te voldoen aan de drie fundamentele principes van vitrificatie (d.w.z. hoge viscositeit, verbonden met hoge cryoprotectantconcentratie, kleine volumes en ultrasnelle temperatuurdaling), zijn verschillende media en steunen speciaal ontwikkeld en gebruikt bij katten voor zowel onrijpe als volwassen eicellen. Beginnend met eenvoudige rietjes7,werden de apparaten toen ontwikkeld om het doel "Minimum volume" te bereiken. Cryoloop8, open pulled straws (OPS)9, plastic goten (gemodificeerd stro)10 en cryotubes11 zijn gebruikt, totdat een efficiënter apparaat (dat wil zeggen, Cryotop) werd gebruikt11, verbetering van de overleving en meiose hervatting. Cryotop (Supplemental Figuur 1) is een commercieel beschikbare ondersteuning die is uitgegroeid tot de keuze open systeem voor vitrification. Ontwikkeld voor de vitrificatie van menselijke eicellen en embryo's, het bestaat uit een kleine film strip bevestigd aan een harde plastic houder, beschermd door een plastic buis dop tijdens opslag12. Dankzij de bruikbaarheid en de extreme vermindering van het vitrificatievolume (zo weinig als 0,1 μL), wat ook leidt tot extreem snelle koel- en opwarmingspercentages, is deze vitrificatiesteun steeds vaker toegepast in verschillende soorten, waaronder de huiskat, waarbij deze is gebruikt met een verscheidenheid aan media13,14,15,16,17.
Het doel van dit manuscript is om een collectie-vitrification-warming protocol te beschrijven, met kleine wijzigingen van de oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke eicellen, die laboratorium-en-klare media en commerciële ondersteuning voor een minimum volume vitrification gebruikt en kan gemakkelijk worden toegepast in het veld omstandigheden voor de cryopreservatie van onrijpe katachtige COC's.

<table><tbody><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td>/</td></tr><tr><td>Automatische pipetten &amp; tips</td><td>/</td><td>/</td><td>Nodig om 20, 100, 240 en 300 &micro;L af te pipetten</td></tr><tr><td>Chirurgische scalpels</td><td>/</td><td>/</td><td>Maat 10 is meestal ok</td></tr><tr><td>Bunsen beker</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Klemmen</td><td>/</td><td>/</td><td>Sommige kleine (Mosquito klemmen) voor eierstofisolatie, enkele grotere (Klemmer klemmen) om in vloeibare stikstof te werken</td></tr><tr><td>Cryotop</td><td>Kitazato (distributeur: MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.CR</td><td>Distributeurs en catalogusnummer kunnen in verschillende landen veranderen</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>/</td></tr><tr><td>Ethyleenglycol (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9129</td><td>/</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>/</td></tr><tr><td>Glazen Pasteur pipetten</td><td>/</td><td>/</td><td>Aangeraden lengte 230 mm (100+130)</td></tr><tr><td>Gobelets</td><td>/</td><td>/</td><td>Afhankelijk van de canisters van de opslagtank</td></tr><tr><td>Verwarmingsfase</td><td>/</td><td>/</td><td>Alle verwarmingsfasen zijn ok, zolang ze 38&ordm;C kunnen aanhouden</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td>/</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>/</td></tr><tr><td>Penicilline G natrium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td>/</td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td>/</td></tr><tr><td>Repro plaat</td><td>Kitazato (distributeur: MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.K-2</td><td>Distributeurs en catalogusnummer kunnen in verschillende landen veranderen</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>/</td><td>/</td><td>Zolang de operator de oöcyten kan selecteren, zijn andere stereomicroscopen ok</td></tr><tr><td>Opslagtank</td><td>/</td><td>/</td><td>Elke regelmatig gevulde tank is ok</td></tr><tr><td>Streptomycine sulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td>/</td></tr><tr><td>Styrofoam/stikstofbestendige doos</td><td>/</td><td>/</td><td>Alle dozen die vloeibare stikstof kunnen bevatten zijn ok, zolang de operator comfortabel is. Kitazato doos wordt "Cooling Rack" genoemd</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td>/</td></tr><tr><td>Timers</td><td>/</td><td>/</td><td>Alle timers die tot 9 minuten ingesteld kunnen worden, zijn ok</td></tr></tbody></table>

minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In de instandhoudingsprogramma's van wilde dieren is gamete banking cruciaal om genetische hulpbronnen van waardevolle individuen en zeldzame soorten te beschermen en het behoud van de biodiversiteit te bevorderen. In felids, de meeste soorten worden bedreigd met uitsterven, en binnenlandse rassen worden gebruikt als een model om de efficiëntie van protocollen voor kiemplasma bankieren te verhogen. Onder oocyte cryopreservatie technieken, vitrification is meer en meer populair in de menselijke en veterinaire ondersteunde voortplanting. Cryotop vitrification, dat in eerste instantie werd ontwikkeld voor menselijke eicellen en embryo's, heeft aangetoond zeer geschikt te zijn voor kattenoraad. Deze methode biedt verschillende voordelen, zoals de haalbaarheid in het veld omstandigheden en de snelheid van de procedure, die nuttig kunnen zijn wanneer meerdere monsters moeten worden verwerkt. De efficiëntie is echter sterk afhankelijk van de vaardigheden van de operator en intra- en interlaboratoriumstandaardisatie zijn nodig, evenals personeelstraining. Dit protocol beschrijft minimale volume vitrificatie van onrijpe katachtige eicellen op een commerciële ondersteuning in een stap voor stap veld-vriendelijk protocol, van eicel collectie tot opwarming. Volgens het protocol, behoud van eicelintegriteit en levensvatbaarheid bij opwarming (tot 90%) kan worden verwacht, hoewel er nog ruimte is voor verbetering in de post-opwarming van de rijping en de embryonale ontwikkelingsresultaten.

Na cat oocyte vitrification en opwarming volgens het huidige protocol (Figuur 1 en Supplemental Figuur 1), de overgrote meerderheid van de gameten overleven. Na vitrificatie, onder andere technieken, kan de levensvatbaarheid worden geëvalueerd op de optische microscoop als morfologische integriteit22 of met het gebruik van vitale vlekken. Een van de laatste is fluoresceïne diacetaat / propidium jodide (FDA / PI), die het mogelijk maakt de identificati...

Dit manuscript beschrijft een protocol voor de minimale volume vitrification van onrijpe katoocyten met laboratorium-gemaakte media op commerciële steunen. Het dekt elke stap van eicelisolatie van ex vivo gonaden tot vitrificatie en opwarming.

Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Dit protocol is nuttig voor het behoud op lange termijn van de katachtige eicellen door middel van een cryopreservatie techniek bekend als met vitrification, die cruciaal is voor de vruchtbaarheid en de biodiversiteit behoud bij diersoorten. De belangrijkste voordelen van vitrificatie zijn de snelheid, omdat het kan worden voltooid in minder dan 17 minuten en de haalbaarheid ervan in het veld omstandigheden als vloeibare stikstof beschikbaar is. De huiskat is een levensvatbaar model voor wilde bedreigde katachtigen.De ontwikkeling en optimalisatie van cryopreservatie protocollen zou het mogelijk maken de oprichting van gamete biobanken voor katachtige instandhouding programma's. Begin met het bereiden van een Repro vitrification plaat met drie kegelvormige putten in één rij. Voeg 20 microliter van evenwichtsoplossing toe aan de eerste put en 300 microliter van vitrificatieoplossing aan de tweede en derde putten.Om de cumulus eicellen complexen, of COCs, gebruik maken van een kleine boring pipet om een of meer complexen over te brengen naar de bodem van de eerste put. Voeg langzaam 20 microliter van evenwichtsoplossing aan de grens van de daling toe en wacht drie minuten, voeg dan n

minimum-volume-vitrification-of-immature-feline-oocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit manuscript beschrijft een experimentele aanpak om paardocyten morfologisch en biochemisch te karakteriseren. Specifiek illustreert het onderhavige werk hoe u onrijpe en volwassen paardocyten verzamelt door middel van ultrageluidgeleide ovumopname (OPU) en hoe u chromosoom-segregatie, spindemorfologie, globale histonacetylering en mRNA-expressie kunt onderzoeken.

Analyse van Chromosoom Segregatie, Histon Acetylatie, En Spindel Morfologie In Paard Oocyten

Hier worden twee protocollen gepresenteerd voor de inkapseling van varkensocyten in 3D-kweekomstandigheden. In de eerste worden cumulus-eicellencomplexen (COC's) ingekapseld in fibrin-alginaatkralen. In de tweede zijn ze ingesloten met gefluoreerde ethyleenpropyleenpoederdeeltjes (microbioreactoren). Beide systemen zorgen voor optimale omstandigheden om hun 3D-organisatie te onderhouden.

Proteolytisch afgebroken alginaat hydrogels en hydrofobe microbioreactoren voor porcine Oocyte Inkapseling

Oöcyt cryopreservatie wordt erkend door verschillende internationale wetenschappelijke verenigingen als de gouden standaard voor vruchtbaarheidsbehoud bij postpubertale vrouwen. De aangewezen klinische en laboratoriumstrategieën verzekeren maximumeffectiviteit, efficiency, en veiligheid van vruchtbaarheidsbehoudsbehandelingen.

Vruchtbaarheidsbehoud door oöcyt vitrificatie: klinische en laboratoriumperspectieven

Het protocol is gericht op het bieden van een standaardmethode voor de vitrificatie van volwassen en juveniele schapenoöcyten. Het omvat alle stappen van de bereiding van de in vitro rijpingsmedia tot de post-opwarmingscultuur. Oöcyten worden in het MII-stadium ge verglaasd met behulp van Cryotop om het minimale essentiële volume te garanderen.

Vitrificatie van in vitro gerijpte oöcyten verzameld uit volwassen en prepubertale eierstokken bij schapen

Een toegewijd team kan Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser-patiënten de mogelijkheid bieden om gecontroleerde ovariële stimulatie en cryopreservatie van eicellen uit te voeren op het moment van laparoscopische vaginoplastiek.

Laparoscopische oöcyten ophalen en cryopreservatie tijdens vaginoplastiek voor de behandeling van mayer-rokitansky-kuster-hauser syndroom

Een protocol voor de vitrificatie van eierstokweefsel, als een alternatieve cryopreservatiemethode voor het veelgebruikte langzame invriesprotocol, wordt gepresenteerd.

Verglazing van het weefsel van de eierstokschors om een glazige staat van aggregatie te bereiken

Dit protocol schetst gestandaardiseerde methoden om follikelvloeistof, somatische cellen en onrijpe eicellen te isoleren en te verwerken uit IVF-procedures, waardoor moleculaire en cellulaire analyses van hoge kwaliteit mogelijk zijn. Deze benaderingen ondersteunen translationeel onderzoek naar vruchtbaarheid, reproductieve veroudering en ovariële disfunctie met behulp van materialen die doorgaans in de klinische zorg worden weggegooid.

Verzameling van menselijke follikelvloeistof, follikelsomatische cellen en onrijpe eicellen van personen die in-vitrofertilisatie ondergaan

Dit protocol beschrijft procedures voor in-vitro rijping van muis-oocyten, in-vitrofertilisatie en daaropvolgende embryokweek tot het blastocyststadium.

Muize-oocyt in vitro rijping, bevruchting en kweek van pre-implantatie embryo's

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

Hier presenteren we een protocol voor de karakterisering van muis antral eicellen gebaseerd op nucleolair organisatie.

Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization

Leer minimale volume vitrificatie van onvolwassen kattenoöcyten voor vruchtbaarheidsbehoud en biodiversiteitsconservering. Dit protocol optimaliseert cryopreservatie met laboratoriumgemaakte media.

Minimale volume vitrificatie van onvolwassen feline oocyten

Meer video's verkennen