Geautomatiseerde productie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale en dopaminerge neuronen met geïntegreerde live-cel monitoring

Het algemene doel van deze studie is om te laten zien hoe geautomatiseerde procedures voor het kweken en differentiëren van menselijke IPS-cellen in neuronale afstammingen, evenals hun geautomatiseerde beeldvorming te implementeren. Gestandaardiseerde geautomatiseerde procedures zorgen voor een lage experimentele variatie en zorgen tegelijkertijd voor een hoge fenotypische reproduceerbaarheid. Bovendien kan het systeem worden aangepast voor de ontwikkeling van nieuwe protocollen.

Het aantonen van de procedures zijn Joachim Tager en Elisangela Bressan, post-docs van ons lab. Klik in de grafische gebruikersinterface van het geautomatiseerde systeem op de procesweergave van het resource-instrument en selecteer het resourceinstrumentproces. Klik op instrumentproces uitvoeren en voer de run HEPA-kap en herlaadprocessen uit.

Selecteer de te laden resources, open de deur en laad de celkweekplaten en wegwerptips in de juiste posities, zoals aangegeven door de pop-upafbeeldingen. Ontsmet vervolgens de deur met 70% ethanol voor het sluiten en voer het ontsmettingsproces uit. Het systeem wordt gedurende 30 minuten gesteriliseerd door UV-straling.

Om de platen te laden met cultuur medium of dissociatie reagens, voer de run HEPA kap stap en open de deur van de vloeistof handling station. Na ontsmetting met 70% ethanol, plaats de reservoirs op het dek naar de toegewezen positie en de-deksel hen. Sluit de deur van het vloeistofbehandelingsstation en voer vervolgens het InitHepaHood resource instrument proces uit om de HEPA-kap uit te drijven.

Als u een geautomatiseerde cultuurmethode wilt uitvoeren, klikt u in de agendaweergave van de grafische gebruikersinterface op processtap toevoegen en selecteert u de celregel die in het experiment moet worden gebruikt. Gebruik de wizard om het project te selecteren en de te gebruiken batch te markeren. Klik op de pijlpunt rechts en navigeer naar de volgende pagina van de wizard om de processtap te selecteren die moet worden uitgevoerd.

Plan op de laatste pagina van de wizard het experiment en stel de juiste parameters in die nodig zijn voor het uitvoeren van de methode. Klik vervolgens op OK. Na het laden van een 50 milliliter buis met de menselijke IPS cel suspensie, laden gecoate kweekplaten voor het ontvangen van de cellen op de plank en het zaaien van platen uit buizen methode uit te voeren. Om de cellen in de Brightfield imaging cytometer te tellen, bereid je automatisch een 384-goed telplaat met celophang op het dek voor en gebruik je de robotarm om de 384-goed tellende plaat van het dek naar de Brightfield imaging cytometer over te brengen.

Na het tellen brengt het systeem de plaat terug naar zijn oorspronkelijke positie en brengt het een gecoate kweek- of testplaat van de plank naar het pipetdek. Het systeem zal dan zaad van de cellen in de gebruiker gedefinieerde aantal en volumes die geschikt zijn voor de plaat en mix door pipetting. Na het zaaien wordt de plaat gedurende 10 seconden bij 500 omwentelingen per minuut naar de schudmachine op het dek verplaatst voor celdistributie voordat deze naar de koolstofdioxide-incubator wordt overgebracht.

Als u de geautomatiseerde samenvloeiing wilt beoordelen, voert u de methode voor de controlevloeivloeiing uit en selecteert u een batch die ten minste één kweekplaat en geen testplaten bevat. Voer in de sectie parametersdetails iPSCf_2020 in voor het verwerven van afbeeldingen in de instellingen voor beeldanalyse. Het systeem zal dan de overdracht van de eerste plaat van de incubator naar de Brightfield imaging cytometer en beeld van de cel samenvloeiing.

Als u de celcultuur of de testplaatmedia wilt veranderen, voert u de methode cultuurplaats in de media uit en selecteert u een batch met alleen kweekplaten. Het systeem brengt de platen over naar het dek en kantelt de platen om aspiratie van de supernatant mogelijk te maken. De supernatant wordt naar de afvalinzamelingsmodule gegooid en de tips weggegooid en aan elke plaat worden 12 milliliter vers medium toegevoegd.

Het systeem zal dan opnieuw deksel van de platen en de platen terug te keren naar de cel cultuur incubator. Als alternatief, om medium van testplaten te veranderen, voer media verandering van testplaten methode. Als u de cellen subcultiveert, voert u de subteelt van de methode van aanhangende cellen uit en selecteert u de batch met de kweekplaten die subteelt nodig hebben.

Na het weggooien van het medium, zal het systeem de cellen een keer wassen met acht milliliter PBS per plaat voordat het acht milliliter van 0,5 millimolar EDTA aan de cellen toevoegt. Na acht minuten op het dek met kanteloptie wordt de EDTA vervangen door 12 milliliter vers medium per plaat. Het systeem zal de platen schudden op 2.000 omwentelingen per minuut gedurende een minuut om de kolonies los te maken voordat de cellen tritureren met vijf cycli van pipet om de kolonies op te splitsen in 50 tot 80 micron klonters.

De cellen worden vervolgens overgebracht naar een buis van 50 milliliter op het dek voordat ze in een één-op-zeven-gesplitste verhouding worden ingezaaid. Voor geautomatiseerd hoog gehalte, hoge doorvoercelbeeldvorming, voert u de beeldvormingsmethode uit en selecteert u een batch die ten minste één testplaat en geen kweekplaten bevat. Het systeem zal dan een testplaat overbrengen naar de geautomatiseerde confocale microscoop voor beeldvorming.

Zorg ervoor dat u de juiste batch- en plaat-id's selecteert tijdens het uitvoeren van de vereiste processtappen. De hiPSC culturen moeten dagelijks worden gecontroleerd op groei en geanalyseerd voor hun percentage van samenvloeiing in de Brightfield imaging cytometer. Na het doorgeven en handmatige of geautomatiseerde systeemcultuur vertonen de cellen een typische stamcel- en pluripotentiemarkeringsexpressie.

Neuronen gedifferentieerd in het geautomatiseerde cultuursysteem tonen een vergelijkbare morfologie en neuronale netwerkorganisatie aan neuronen die handmatig worden gecultiveerd. Na zes dagen van differentiatie zijn automatisch gedifferentieerde corticale neuronen positief voor neuron-specifieke klasse III bèta-tubuline en bovenste corticale laagmarkeringsexpressie. Na acht dagen, de cellen ook uitgedrukt microtubuli-geassocieerde eiwit 2, de neurale cel hechting molecuul, en synapsine I, evenals corticale neuron markers.

Zeer lage of geen expressie van deze markers wordt waargenomen in hiPSC. Dit systeem kan ook worden gebruikt om een live cel geautomatiseerde neurite uitgroei test die het mogelijk maakt neurotische lengtes worden gemeten over 11 dagen van differentiatie vast te stellen zonder handmatige tussenkomst. Met behulp van de geautomatiseerde cultuur systeem om middelgrote veranderingen uit te voeren over een 65-daagse cultuurperiode vergemakkelijkt hiPSC differentiatie in midbrain dopaminerge neuronen met de verwachte cellulaire organisatie en morfologie.

Naast de neurite uitgroei, andere geautomatiseerde fenotypische testen die relevant zijn voor het bestuderen van neurodegeneratie, bijvoorbeeld, TDP-43 translocatie RNA foci en alpha-synuclein fibril opname, kan worden onderzocht met behulp van deze hoge doorvoer, hoge inhoud formaat.