Isolatie en teelt van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen bij ratten
25 augustus 2020
Dit artikel presenteert een methode die volledige beenmergaanhechting en flowcytometriesortering combineert voor het isoleren, cultiveren, sorteren en identificeren van beenmerg mesenchymale stamcellen uit rattenkaken.
Studies hebben aangetoond dat de BMSC's die zijn afgeleid van schedelbotten superieure capaciteiten vertonen dan die van axiale en appendiculaire botten. Daarom worden mandibulaire BMSC's beschouwd als de voorkeursbron voor het ontwikkelen van toekomstige therapieën voor craniofaciale ziekten. Dit protocol combineert de voordelen van gehele beenmergkleuring en fluorescente celsortering om in korte tijd significante hoeveelheden gezuiverde mandibulaire BMSC's te verkrijgen.
Als u dit protocol voor de eerste keer probeert, vind ik het erg belangrijk om de anatomische structuur en de functionele beweging van de rattenmandibula te begrijpen, wat kan worden bereikt door deze video te bekijken of gerelateerde literatuur te lezen. Na het euthanaseren van de rat, plaats deze in een schone afzuigkap in een rugligging. Snijd de huid en de buccinator-spieren van de bilaterale angulus oris naar het achterste gebied van de mandibula.
Open de muil van de rat door de maxillaire en mandibulaire snijtanden met beide duimen in de tegenovergestelde richting te duwen, om de mandibulaire tanden te onthullen, die aan de mandibula zijn bevestigd. Ontkoppel volledig de buccale spieren en de pezen die aan de coracoïden en de onderrand van de mandibula zijn bevestigd. Druk vervolgens op de achterste tanden van de mandibula en draai ze naar achteren en naar beneden tot de condylen aan beide zijden duidelijk zichtbaar zijn.
Schei het mandibulaire lichaam van de schedel en reinig het aangehechte zachte weefsel op het botoppervlak met een vochtige gaasdoek. Plaats het bot in een steriele glazen schaal van 10 centimeter gevuld met voorgekoeld minimum essentieel medium alfa, of PBS op ijs, om de levensvatbaarheid te behouden. Snijd het voorste bot langs de mesiale rand van de eerste kies af van het mandibulaire lichaam, verwijder vervolgens de mandibulaire tak inclusief coracoïd en condyle langs de distale rand van de derde kies om de beenmergholte bloot te leggen.
Vul een steriele glazen schaal van 10 centimeter met 10 milliliters alpha-MEM met 10%FBS. Zuig het medium op met een steriele 10 milliliter spuit, steek vervolgens de naald in de beenmergholte en spoel het beenmerg herhaaldelijk in de schaal. Spoel de beenholte minimaal drie keer vanaf de mesiale en distale kanten van het bot, totdat het bot wit wordt.
Breng het medium met de gespoelde cellen over in een 15 milliliter centrifugeerbuisje, en centrifugeer het gedurende vijf minuten bij 800 RPM. Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen opnieuw in drie milliliter alpha-MEM met 10%FBS. Plaat de cellen in een nieuwe 10 centimeter kweekschaal en incubeer ze bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide incubator.
Zuig het kweekmedium op en was de schaal met PBS. Voeg twee milliliter 0,25% trypsine met 0,02% EDTA toe aan de schaal en verteer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens vier milliliter alpha-MEM met 10%FBS toe om de reactie te stoppen.
Breng de celsuspensie over in een 15 milliliter centrifugeerbuisje en centrifugeer het gedurende vijf minuten bij 800 RPM. Suspendeer de cellen in 120 microliters PBS met 10%FBS na centrifugatie. Breng 100 microliters van de celsuspensie over in een nieuw microcentrifugebuisje.
Blokkeer de celsuspensies met één microliter antilichaam tegen CD16 door CD32 bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten, en kleurt de cellen met PE-geconjugeerd antilichaam tegen CD45, FITC-geconjugeerd antilichaam tegen CD90 en APC-antilichaam tegen CD29, bij vier graden Celsius gedurende één uur in het donker. Gebruik de andere 20 microliters celsuspensie als ongekleurde negatieve controle. Centrifugeer de buisjes gedurende vijf minuten bij 800 RPM.
Gooi de supernatant weg en suspendeer de cellen in 0,5 milliliter PBS met 10%FBS. Voeg 10 microliters van 0,01 milligram per milliliter DAPI toe, 10 minuten voorafgaand aan de analyse. Gebruik 40 nanometer filters geplaatst op centrifugeerbuisjes om de cellen te filteren, en analyseer vervolgens de cellen op een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder.
Verwijder eerst dode cellen uit het totale celtelling door DAPI negatieve cellen te gat, vervolgens gat voor CD29 positief, CD90 positief, CD45 negatief, in de geselecteerde cellen als gerichte mBMSC's. Verzamel de gesorteerd mBMSC's in een 15 milliliter centrifugeerbuisje met vijf milliliter alpha-MEM met 10%FBS. Centrifugeer de buisjes gedurende vijf minuten bij 800 RPM en verwijder de verzamelbuffer.
Voeg een milliliter vers medium toe om de cellen op te schorsen, en plaat ze vervolgens in een zes centimeter kweekschaal. Met dit protocol hechtte een groot deel van de cellen zich op de derde dag na de eerste kweek aan de schaal. Na nog eens drie tot vier dagen van kweek bereikte de celconfluence 70 tot 80% Fluorescerende celsortering werd gebruikt om mBMSC's te zuiveren, die ongeveer 81,1% vertegenwoordigden in de P0 cellen.
Na het kweken van P2 mBMSC's in een zes-puttenplaat gedurende een week, werden een significant aantal kolonievormingseenheden waargenomen. Om de multi-lijn differentiatiecapaciteit van de mBMSC's te beoordelen, werden ze geïnduceerd in osteo-chondro- en adipo-lijnen. Verhoogde activiteit van ALP, rode calcificieknobbels onder alizarinrode kleuring en verhoogde expressie van osteogene specifieke genen Runx2, Alp, Bsp en Ocn, wezen op osteogene inductie.
Oil-red-O kleuring werd gebruikt om adipogenese te identificeren. Talrijke lipiderijke vacuolen waren evident na negen dagen van inductie. Bovendien was de expressie van adipogene specifieke genen Ppar-gamma-1 en Cebpa verhoogd.
De monsters toonden positieve kleuring voor Alcian blauw tijdens microscopisch onderzoek van chondrogene differentiatie. Bovendien toonde immunokleuring met anti-type II collageen antilichaam een verhoogde accumulatie van kraakbeenmatrix. Het waarborgen van de levensvatbaarheid van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode die gehele beenmergadherentie combineert met flowcytometrie-sortering voor het isoleren, kweken, sorteren en identificeren van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van rattenkaken. Mandibulaire BMSCs worden beschouwd als een voorkeursbron voor de ontwikkeling van therapeutica voor craniaofaciale aandoeningen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamcelonderzoek
- Craniofaciale Biologie
Achtergrond
- BMSC's uit kraniofaciale beenderen vertonen superieure mogelijkheden in vergelijking met die uit andere beenderen.
- Inzicht in de anatomie en beweging van de onderkaak van de rat is cruciaal voor dit protocol.
- De methode is erop gericht om efficiënt aanzienlijke aantallen gezuiverde mandibulaire BMSC's te verkrijgen.
- Relevante literatuur en video's kunnen het begrip van de procedure vergroten.
Doel van de studie
- Het isoleren en kweken van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van rattenmandibels.
- Het bieden van een betrouwbaar protocol voor onderzoekers in therapeutische behandelingen voor craniofaciale aandoeningen.
- Het benadrukken van de anatomische overwegingen die nodig zijn voor een succesvolle isolatie.
Gebruikte methoden
- Techniek voor adhesie van volledig beenmerg.
- Flowcytometrie-sortering voor celzuivering.
- Preparatie van rattonken na euthanasie.
- Incisietechnieken voor toegang tot de onderkaak.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van aanzienlijke aantallen mandibulaire BMSCs.
- Demonstratie van de effectiviteit van de gecombineerde methode.
- Inzichten in de anatomische structuur die de procedure ondersteunt.
- Potentiële toepassingen in therapieën voor craniofaciale aandoeningen.
Conclusies
- Het protocol biedt een efficiënte methode voor het isoleren van BMSCs.
- Kennis van de anatomie is essentieel voor een succesvolle toepassing.
- Mandibulaire BMSCs zijn veelbelovend voor toekomstige therapeutische ontwikkelingen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De isolatie van hoogzuivere mesenchymale stamcellen uit craniofaciaal beenmerg ondersteunt de validatie van targets in de regeneratieve geneeskunde door een biologisch relevante celbron te bieden met een superieur differentiepotentieel. Deze methode maakt de snelle generatie van proliferatieve mBMSCs mogelijk voor preklinische studies, wat het mechanistische de-risking van craniofaciale therapeutische kandidaten faciliteert. Toegang tot goed gekarakteriseerde stamcellen verbetert het voorspellend vertrouwen in vroege discovery door menselijke weefselresponsen te modelleren in een ziekterellevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de biologie van mesenchymale stamcellen in een specifiek craniofaciale context mogelijk voor het testen van hypothesen met betrekking tot targets.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare bron van gezuiverde mBMSC's via adhesie en fluorescence-activated sorting voor consistente experimentele inputs.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt functionele validatie van stemness door middel van multi-lineage differentiatie naar osteogene, adipogene en chondrogene trajecten.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, passage-gecontroleerde mBMSCs die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling in screening op cytotoxiciteit, migratie of differentiatie.
- Operationele waarde: Levert hoge celgetallen op met een zuiverheid van >80% na P0-sortering, wat schaalbare plate-based assays mogelijk maakt.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantificeerbare read-outs zoals ALP-activiteit, lipidevacuolen en matrixkleuring voor lineage-specifieke fenotypische screening.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van een ziekte-relevant systeem (kaakbeen) om regeneratie van craniofaciaal weefsel en interacties in de micro-omgeving te modelleren.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale kweek (P2) voor het beoordelen van het kolonievormend vermogen en het proliferatiepotentieel op de lange termijn.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert studies die zijn afgestemd op biomarkers via gevalideerde oppervlaktemarkers (CD29+CD90+CD45−) voor translationele continuïteit.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, door in elke fase mechanistisch informatieve cellen te leveren.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen over het gedrag van de stamcelniche en lineage-committement met behulp van gezuiverde primaire cellen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde, adherente culturen met kwantificeerbare differentiatie-uitkomsten.
- Analytica: Biedt flowcytometrie-gebaseerde kwantificatie en immunofluorescentie-uitlezingen voor objectieve vergelijking tussen condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via aangetoonde tri-lineage differentiatie die relevant is voor het herstel van craniofaciaal weefsel.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare isolatieworkflow die toepasbaar is op meerdere craniofaciale ziektemodellen en screeningcampagnes.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het doelwit door mechanistische ambiguïteit in door stamcellen gemedieerde herstelpaden te verminderen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de celbron via gedefinieerde adhesie- en sorteerstappen, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege beoordeling van cellulaire responsen in een fysiologisch relevant model mogelijk te maken.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van regeneratieve kandidaten voor het kraniofaciale gebied met behulp van gevalideerde stamcelfunctionaliteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in knaagdieranatomie, aseptisch spoelen van het beenmerg en fluorescentie-geactiveerde cel sortering.
- Afhankelijk van steriele weefselkweekapparatuur, centrifuges, een flowcytometer en omgekeerde microscopen voor validatie.
- Maakt standaardisatie van enzymatische digestietijden, antilichaamkleuringsprotocollen en gating-strategieën tussen verschillende operators noodzakelijk.
- Houdt rekening met aanpassingen bij vertaling naar andere botbronnen of soorten vanwege anatomische variabiliteit.
- Beperkt door de behoefte aan vers weefsel en korte verwerkingstijden na euthanasie om de celviabiliteit te behouden.
