Driedimensionale motorische zenuw organoïde generatie

Dit protocol vergemakkelijkt onderzoek naar de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en de ziekte van axonbundels met behulp van motorische zenuworganoïden afgeleid van humane iPS-cellen buiten het lichaam. Door eenvoudigweg neuronale sferoïden en op maat gemaakte microcultuurchips te kweken, kunnen spontaan unidirectionele axonbundels worden gegenereerd en worden gebruikt voor verschillende downstream experimenten. Motorische zenuworganoïden kunnen de screening en testen van medicijnen voor motorneuronziekten, inclusief LS, vergemakkelijken door een meer fysiologisch model te bieden dat eerdere in vitro-systemen zijn.

In een afzuigingskast en met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, doseert u drie milliliter SU-8 2100 op een met aceton gereinigde siliciumwafer en plaats de wafer in het midden van een spin coater. Bevestig de wafer met vacuüm en laat de wafer 10 seconden draaien op 500 omwentelingen per minuut om de SU-8 gelijkmatig over het oppervlak van de wafer te bedekken, draai vervolgens de wafer 30 seconden op 1.500 omwentelingen per minuut met een versnelling van 300 omwentelingen per seconde om een laag fotoresist van 150 micron dik te verkrijgen op de wafer. Na zacht bakken, plaats de fotomasker op de maskeraligner en stel de wafer bloot aan ultraviolet licht gedurende 60 seconden.

Na het bakken op een hotplate, ontwikkel de wafer gedurende 10 tot 20 minuten in fotoresistontwikkelaar met agteruitbeweging op een orbitale shaker, ververs de ontwikkelingsoplossing eenmaal tijdens het proces. Om de onderste laag van de chip voor weefselkweek voor te bereiden, giet vers bereide PDMS op de wafer tot de gewenste dikte en ontgast het mengsel in een vacuümkamer. Bak de PDMS in een oven gedurende ten minste drie uur bij 60 graden Celsius.

Na afkoeling, gebruik een mes om de uitgeharde PDMS van de wafer te snijden, gebruik vervolgens onuitgeharde PDMS met bakken om een ​​medium reservoir aan de onderste PDMS-laag te hechten om de geassembleerde PDMS weefselkweekchip te verkrijgen. Om de PDMS-chip voor de vorming van motorische zenuworganoïden voor te bereiden, steriliseer de chip en een microscoopglas van 76 bij 52 millimeter in een petrischaal met 70%ethanol gedurende ten minste een uur. Plaats de chip aan het einde van de incubatie op het natte microscoopglas.

Nadat de chip 's nachts is opgedroogd, zou deze aan het glas moeten hechten. Plaats een druppel van 30 microliter verdund basement membraanmatrix in DMEM/F12 aan één kant van de inlaat van het kanaal en zuig de oplossing aan de andere kant van de inlaat af om het oppervlak van het microkanaal met de matrix te bedekken. Incubeer vervolgens de PDMS-chip met de coatingoplossing in een petrischaal gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Om 3D iPS-celdifferentiatie in motorneuronen te induceren, zaait u vier keer 10 tot de vierde iPS-cellen per put in het juiste aantal putten van een 96-puts U-bodem plaat in 100 microliter feeder en serumvrij celkweekmedium gesupplementeerd met 10 micromolar Y-27632. De volgende dag, vervangt u het supernatant in elke put met 100 microliter KSR-medium gesupplementeerd met 10 micromolar SB431542 en 100 nanomolar LDN-193189. Op dag twee en drie, vervangt u de supernatanten met 100 microliter KSR-medium gesupplementeerd met 10 micromolar SB431542, 100 nanomolar LDN-193189, vijf micromolar DAPT, vijf micromolar SU5402, één micromolar retinoïnezuur en één micromolar smoothened-agonist.

Op dag vier en vijf, vervangt u de supernatanten met een mengsel van 75%KSR-medium en 25%N2-medium gesupplementeerd met 10 micromolar SB431542, 100 nanomolar LDN193189, vijf micromolar DAPT, vijf micromolar SU5402, één micromolar retinoïnezuur en één micromolar smoothened-agonisten. Op dag zes en zeven, vervangt u de supernatanten met een mengsel van 50%KSR-medium en 50%N2-medium gesupplementeerd met vijf micromolar DAPT, vijf micromolar SU5402, één micromolar retinoïnezuur en één micromolar smoothened-agonist. Op dag acht en negen, vervangt u de supernatanten met een mengsel van 25%KSR-medium en 75%N2-medium gesupplementeerd met vijf micromolar DAPT, vijf micromolar SU5402, één micromolar retinoïnezuur en één micromolar smoothened-agonist.

Op dag tien en elf, vervangt u de supernatanten met N2-medium gesupplementeerd met vijf micromolar DAPT, vijf micromolar SU5402, één micromolar retinoïnezuur en één micromolar smoothened-agonist. Op dag twaalf, vervangt u de supernatanten in elke put met 100 microliter rijpingsmedium gesupplementeerd met 20 nanogram per milliliter hersenafgeleid neurotrofe factor per put. Om de vorming van motorische zenuworganoïden te induceren, vervangt u de coatingoplossing in de PDMS-chip met 150 microliter rijpingsmedium gesupplementeerd met 20 nanogram per milliliter hersenafgeleid neurotrofe factor en gebruikt u een micropipettip met een brede boring om voorzichtig motorische neuronen sferoïden uit een put van de 96-puts plaat in de inlaat van het microkanaal van de chip toe te voegen.

Plaats een kleine reservoir van steriel water nabij de weefselkweekchip in de schaal om mediumverdamping te voorkomen en plaats de schaal in een incubator van 37 graden Celsius en 5%kooldioxide. Elke twee tot drie dagen, vervangt u de helft van het uitgeputte kweekmedium vanuit het midden van het medium reservoir met vers rijpingsmedium gesupplementeerd met 20 nanogram per milliliter hersenafgeleid neurotrofe factor. Axonen zullen vanuit de motorische neuronensferoïde in het kanaal groeien, spontaan in een periode van twee tot drie weken samenstellend tot een enkel bundje om een ​​motorische zenuworganoïde te vormen.

Motorneuronen differentiëren binnen 12 tot 14 dagen in 3D-differentiatieprocedures. Belangrijk is dat meer dan 60%van de cellen de motorneuronmarker HB9 uitdrukt tijdens de differentiatie en ongeveer 80%van de cellen in de motorneuronensferoï