Functionele beoordeling van BRCA1-varianten met CRISPR-gemedieerde basiseditors

Door puntmutaties efficiënt te induceren met behulp van de CRISPR-gemedieerde cytosinebasissen-editor, kan de functionaliteit van BRCA1-varianten worden geïdentificeerd, wat belangrijk is voor ziektepreventie en -diagnose. Het voordeel van deze techniek is dat het endogeen uitgedrukte BRCA1 direct muteert, wat de beperking van functionele evaluatie overwint met behulp van exogeen uitgedrukte BRCA1. Identificatie van het verlies van functiemutaties van BRCA1 kan worden gebruikt om de kans te voorspellen op het ontwikkelen van kankers geassocieerd met BRCA1-mutaties, zoals borst-, eierstok-, prostaat- en alvleesklierkanker.

Het kan ook worden gebruikt voor het vinden van potentiële medicijndoelen door te zoeken naar essentiële genen waarvan de levensvatbaarheid wordt verminderd door functionele uitputting. Om te beginnen, verkrijg de BRCA1 genoomsequentie van GenBank bij NCBI en doorzoek de 20 basispaardoellocaties met de aangrenzende motiefsequentie van de protospacer, NGGNCCN, rond de mutatie van belang. De mutatie van belang moet zich binnen vier tot acht nucleotiden in het PAM-distale uiteinde van de RNA-doelsequenties van de gids bevinden.

Bestel twee gratis oligonucleotiden per gids RNA. Voeg voor de voorwaartse oligonucleotiden CACCG toe aan het 5'einde van de geleidingssequentie en voeg voor de omgekeerde oligonucleotiden OC toe aan het 5'end en C aan het 3'end. Na ontvangst van de oligonucleotiden, resuspendeer ze in gedestilleerd water tot een uiteindelijke concentratie van 100 micromolar.

Meng de twee complementaire oligonucleotiden tot een uiteindelijke concentratie van 10 micromolar met T4 ligatiebuffer en verwarm ze gedurende vijf minuten tot 95 graden Celsius en koel ze vervolgens af tot kamertemperatuur voor gloeien. Verteerd pRG2 met behulp van het restrictie-enzym Bsa1 gedurende een uur bij 37 graden Celsius, voer het verteerd product vervolgens uit op een 1%agarosegel en zuiver de juiste maatband. Ligate de gegloeide oligonucleotide duplex naar het vector-DNA met behulp van de gekochte DNA-ligase volgens het protocol van de fabrikant en zet ze om in DH5-alfa competente cellen.

Voeg de transformatiemiddelen toe aan een agarplaat met 100 microgram per milliliter ampicilline en incubeer de plaat 's nachts bij 37 graden Celsius. Zuiver plasma-DNA van verschillende transformanten en analyseer hun guide RNA-sequenties door Sanger-sequencing met primers die primen bij de U6-promotor. Zaai vijf keer 10 tot de vijfde HAP1-BE3 cellen per put in 24-put platen een dag voorafgaand aan de transfectie en kweek ze om 70 tot 80% samenvloeiing voor transfectie te bereiken.

Transfect BRCA1 targeting guide RNA's met behulp van de gekochte transfectiereagentia volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik één microgram BRCA1-targetinggids RNA's om CG naar TA-conversie op BRCA1-doellocaties te induceren en vervolgens de cellen elke drie tot vier dagen te incuberen bij 37 graden Celsius en subcultuur. Oogst de celkorrels drie, 10 en 24 dagen na de transfectie om de efficiëntie van basisbewerking te analyseren.

Extraheer genomisch DNA met behulp van de genomische DNA-zuiveringskit. Ontwerp de eerste PCR-primers om BRCA1-doellocaties te versterken. Hoewel er geen beperking is op de grootte van het eerste PCR-product, wordt een productgrootte van minder dan één kilobase aanbevolen om een specifieke regio efficiënt te versterken.

Ontwerp de tweede PCR-primers in het eerste PCR-product, rekening houdend met de grootte van de amplicon volgens de leeslengte van de NGS. Om essentiële sequenties voor NGS-analyse te koppelen, voegt u extra sequenties toe aan de 5'ends van de tweede PCR-primers. Versterk de BRCA1-doellocaties op het genomische DNA verkregen uit de drie tijdspunten met behulp van high-fidelity polymerase.

Gebruik voor de eerste PCR-reactie 100 nanogram genomisch DNA voor versterking gedurende 15 cycli. Gebruik voor de tweede PCR-reactie één microliter van het eerste PCR-product voor versterking gedurende 20 cycli. Voer vijf microliters van het tweede PCR-product uit op 2%agarose-gel en bevestig de grootte.

Bevestig vervolgens de essentiële sequenties voor NGS-analyse door het tweede PCR-product te versterken met behulp van de primers die in het teksthandschrift worden vermeld. Versterk elk monster met behulp van verschillende primersets. Gebruik één microliter van het tweede PCR-product voor maximaal 30 cycli van versterking met een high-fidelity polymerase.

Voer vijf microliters van het PCR-product uit op 2%agarose-gel om de grootte te bevestigen en het amplicon te zuiveren met behulp van een commerciële PCR-opruimkit. Meng elk monster in gelijke hoeveelheden om een NGS-bibliotheek te maken. Kwantificeer de NGS-bibliotheek met behulp van een spectrofotometer en verdun deze tot een concentratie van één nanomol met behulp van resuspensiebuffer of 10 millimol Tris-HCl bij pH 8,5.

Bereid 100 microliter van de bibliotheek verdund tot de juiste belastingsconcentratie. Als controle combineerde PhiX met het verdunde monster. Laad de bibliotheek op de cartridge en voer NGS uit volgens het protocol van de fabrikant.

Verkrijg meer dan 10.000 reads per doelamlicon voor een diepgaande analyse van de efficiëntie van basisbewerking. Dit protocol werd gebruikt om een functionele beoordeling uit te voeren van endogene BRCA1-varianten gegenereerd door CRISPR-gebaseerde cytosinebasiseditors. CAS-9 en guide RNA's werden omgezet in HAP1-cellijnen om BRCA1 te verstoren en mutatiefrequenties werden geanalyseerd.

Mutatiefrequenties daalden significant in de loop van de tijd in HAP1-cellijnen, wat erop wijst dat BRCA1 een essentieel gen is voor de levensvatbaarheid van cellen in deze cellen. Om te onderzoeken of CG naar TA vervangende varianten de functie van BRCA1 beïnvloeden, werden de DNA-plasmiden en codeergeleider RNA's die elke mutatie konden induceren, getransfecteerd om HAP1-BE3-cellijnen te hebben. En de substitutiefrequenties werden geanalyseerd.

De relatieve substitutiefrequenties van 3598C tot T, een pathogene variant die een onzinmutatie induceert, namen dramatisch af. Terwijl die van 4527C tot T, een goedaardige variant die een onzinmutatie induceert, met de tijd gelijk bleven. Er werd vastgesteld dat de substitutiefrequenties van nucleotide van deze drie varianten op een tijdsafhankelijke manier daalden.

Aangezien het noodzakelijk is om een hoge initiële mutatiefrequentie te verkrijgen om de verandering in cel levensvatbaarheid duidelijk te herkennen met het verstrijken van de datum, is het een prioriteit om geoptimaliseerde transfectieomstandigheden vast te stellen. Deze procedure kan worden toegepast voor het verifiëren van andere onbekende genetische varianten zoals BRCA VUS. Het kan aanwijzingen geven voor de pathogeniteit van patiënt-afgeleide onbekende varianten en hun behandeling.