Differentiatie van monocyten in fenotypisch verschillende macrofagen na behandeling met Human Cord Blood Stem Cell (CB-SC)-Afgeleide Exosomen
12 november 2020
Exosoom toepassing is een opkomende tool voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde. We stellen een exosoom isolatieprotocol op met een hoge zuiverheid om exosomen te isoleren van nieuw geïdentificeerde stamcellen genaamd CB-SC voor mechanistische studies. We cocultuur cb-sc-afgeleide exosomen met menselijke monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in fenotypically verschillende macrofagen.
De Stem Cell Educator therapie werd ontwikkeld om diabetes type I en de andere auto-immuunziekte te behandelen. Deze methode is ontwikkeld om het molecuulmechanisme te verkennen dat ten grondslag ligt aan immuunmatigheid van de stamcelopvoedertherapie via CB-SC vrijgegeven exosomen. Dit protocol biedt richtlijnen over hoe exosomen te zuiveren uit een menselijke navelstrengbloed stamcellen culturen en bepalen hun immuun modulatie van monocyten.
Het aantonen van de procedure zal Wei Hu, een promovendus, uit mijn lab. Om te beginnen centrifuge het cb-SC-afgeleide geconditioneerde medium drie keer zoals beschreven in het tekstmanuscript, het verzamelen van de supernatant in een nieuwe 50 milliliter conische buis na elke centrifugatie. Na de derde centrifugatie filtert u de verkregen supernatant met een filter van 0,22 microliter en breng 15 milliliter media over naar elke 10 kilodaltoncentrifugaalfiltereenheid.
Centrifuges op 4, 000 x g gedurende 30 minuten om de geconcentreerde exosoom media te isoleren. Breng de geconcentreerde exosomen over naar een ultracentrifugebuis. Dan pellet de exosomen op 100, 000 x g gedurende 80 minuten op vier graden Celsius.
Gooi vervolgens de supernatant weg en zet de pelleted exosomen in 10 milliliter PBS terug. Voer een laatste ultracentrifugatie uit om de exomepel te verzamelen en opnieuw op te hangen in 200 microliters van PBS. Voeg 30 miljoen menselijke PBMCs toe aan een buis van 15 milliliter en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Resuspend de cellen in 300 microliter van koude PBS en voeg 60 microliter van CD14 microbeads toe. Meng goed en incubeer de cellen op ijs gedurende 15 minuten. Voeg nog zes milliliter koude PBS en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Dan resuspend de pelleted cellen in 500 microliters van koude lopende buffer. Plaats de scheidingskolom in de magneetafscheider en was deze drie keer met twee milliliter koudlopende buffer. Breng de geresuspended cellen over in de scheidingskolom en laat ze passeren.
Nogmaals, was de kolom drie keer met twee milliliter lopende buffer per wasbeurt. Til vervolgens de kolom van de magneetafscheider en plaats deze over een 15 milliliter centrifugebuis op ijs. Elute de CD14 positieve cellen met twee milliliter koude lopende buffer en centrifuged op 300 x g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius om de cellen pellet.
Resuspend de pellet in twee milliliter koude chemische gedefinieerde serum medium en breng 50 microliter van het in een 1,5 milliliter buis. Bevlek de verkregen cellen met 10 microliter van Krome Orange-geconjugeerde anti-menselijke CD14 monoklonale antilichamen gedurende 20 minuten. Voeg een milliliter PBS en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten om de cellen pellet.
Resuspend de cel pellet in 200 microliters van PBS en breng het in een vijf milliliter buis. Bepaal de zuiverheid van CD14+monocyten door flow cytometrie. Zaad een miljoen van de verkregen gezuiverde monocyten in een weefselkweek behandeld zes-put plaat en incubbaat voor twee uur op 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide.
Na incubatie gooi de supernatant en voeg voorzichtig twee milliliter van 37 graden voorverwarmde chemische gedefinieerde serum-vrije kweekmedium, voeg vervolgens 80 microgram van de CB-SC-afgeleide exosomen toe aan de monocytencultuur in de zes-put plaat met een totaal volume van twee milliliter. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide gedurende drie tot vier dagen. Beeld vervolgens de celmorfologie met behulp van een omgekeerde microscoop bij vergroting van 200x.
Voeg een milliliter pbs-gebaseerde celdissociatie buffer om de cellen los te maken door pipetting op en neer en oogst de resterende cellen met een cel schraper. Verzamel de cellen door vijf minuten lang te centrifugeren op 1, 690 x g en ze opnieuw op te stellen in 200 microliters van PBS. Voeg vijf microliter van FC blocker toe om de niet-specifieke binding te blokkeren en voeg vervolgens de antilichamen toe.
Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg een milliliter PBS toe aan de geïncubeerde cellen en centrifugeer ze gedurende 10 minuten op 300 x g. Resuspend de pellet in 200 microliters van PBS en voeg vijf microliter propidium jodide per monster.
Breng de cellen over naar een nieuwe stroombuis van vijf milliliter en voer stroomcytometrie uit om de niveaus van cd14, CD80, CD86, CD163, CD206 en CD209-expressie te evalueren. Het fenotype en de zuiverheid van CB-SCs werden onderzocht door stromingscytometrie met CB-SC geassocieerde markers. De analyse toonde hoge niveaus van CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 en galectine 9 uitdrukking maar geen uitdrukking van CD34 werd waargenomen.
Flow cytometrie analyse bevestigt ook de expressie van exoom specifieke markers, CD9, CD 81, en CD63 op CB-SC-afgeleide exosomen. De groottemorfologie van exosomen werd gekenmerkt door TEM en de grootteverdeling werd bepaald door DLS. Westelijke vlek bewijst verder de uitdrukking van de exoom bijbehorende teller Alix zonder uitdrukking van de ER geassocieerde marker, calnexin.
De directe interactie van Dio-gelabelde CB-SC-Exo met PBMC werd waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie. Om beter te definiëren welke celpopulatie interactie had met de wijzerplaat met het label CB-SC-Exo, werden verschillende celcompartimenten afgesloten met celspecifieke markers, zoals CD3 voor T-cellen, CD11C voor myeloïde dendritische cellen, CD14 voor monocyten, CD19 voor B-cellen en CD56 voor NK-cellen. Monocyten waren voornamelijk het doelwit van de CB-SC-afgeleide exosomen omdat ze hogere mediane fluorescentieintensiteiten vertoonden dan die van andere immuuncellen.
De exosoom behandelde monocyten onderscheidden zich met succes in spindelachtige morfologieën. Er was een upregulation in het niveau van M2 geassocieerde markers, zoals CD163, CD206, en CD209 na de behandeling met CB-SC-afgeleide exosomen. De fenotypische vergelijking tussen conventionele M2-macrofagen en de door CB-SC geïnduceerde M2-macrofagen vertoonde geen significante verschillen.
De belangrijkste stap in dit protocol is het toevoegen van CB-SC-afgeleide exosomen aan de monocyte van cultuur in zes-put plaat en uitbroeden voor drie tot vier dagen, die nodig zijn om de cel differentiatie naar andere type 2 macrofagen met spindel-achtige morfologie. Vervolgens gaan we de molecule componenten in cb-SC-afgeleide exosomen die hebben bijgedragen aan de inductie van differentiatie van monocyt in type 2 macrofagen te verkennen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het isoleren van hoogzuivere exosomen uit navelstrengbloed-afgeleide stamcellen (CB-SC) voor mechanistische onderzoeken. Het onderzoek verkent de immunomodulerende effecten van CB-SC-afgeleide exosomen op humane monocyten, wat leidt tot hun differentiatie in verschillende macrofaagfenotypen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Regeneratieve geneeskunde
- Stamcelonderzoek
- Immunologie
Achtergrond
- Exosomen zijn opkomende instrumenten in de geneesmiddelenontwikkeling.
- CB-SC zijn nieuwe stamcellen met potentiële therapeutische toepassingen.
- Inzicht in immuunmodulatie is cruciaal voor therapieën gericht op auto-immuunziekten.
- Stem Cell Educator-therapie is gericht op de behandeling van diabetes type I en andere auto-immuunaandoeningen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol vast te stellen voor de isolatie van exosomen uit CB-SC.
- Om de immuunmodulerende eigenschappen van uit CB-SC afgeleide exosomen te onderzoeken.
- Om menselijke monocyten te differentiëren tot macrofagen met behulp van deze exosomen.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie van geconditioneerd medium afgeleid van CB-SC.
- Filtratie van het supernatant met een 0,22 µm filter.
- Gebruik van 10 kilodalton centrifugale filtereenheden voor exosoomzuivering.
- Cocultuur van exosomen met humane monocyten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van hoogzuivere exosomen uit CB-SC.
- Exosomen induceerden differentiatie van monocyten naar verschillende macrofaagfenotypen.
- Aangetoonde immuunmodulerende effecten van CB-SC-afgeleide exosomen.
- Voorzien van een gedetailleerd protocol voor toekomstige studies naar toepassingen van exosomen.
Conclusies
- Exosomen uit CB-SC zijn veelbelovend voor therapeutische toepassingen.
- Verder onderzoek is nodig om hun volledige potentieel voor immuunmodulatie te verkennen.
- Dit protocol kan bijdragen aan de voortgang van onderzoek in de regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol maakt mechanistisch onderzoek naar exosoom-gemedieerde immuunmodulatie mogelijk, wat doelwitvalidatie in onderzoek naar auto-immuunziekten ondersteunt. Door aan te tonen hoe CB-SC-afgeleide exosomen de differentiatie van monocyten naar M2-macrofagen stimuleren, biedt het een ziekterelevant systeem voor het verminderen van risico's bij immunomodulerende kandidaten. De aanpak biedt voorspellende waarde voor het screenen van verbindingen die exosoom-gemedieerde fenotypische overschakeling nabootsen of remmen in de vroege ontdekkingsfase.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar exosoom-gemedieerde mechanismen bij de fenotypische conversie van monocyten naar M2-macrofagen.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd co-kweekmodel om de immunomodulerende activiteit van extracellulaire vesicles te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten via flowcytometrie voor de expressie van M2-markers (CD163, CD206, CD209) om de potentie van exosomen te evalueren.
- Operationele waarde: Stelt een reproduceerbare assay vast voor de opname van exosomen en monocyten-differentiatie met behulp van gezuiverde CD14+ cellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterellevant systeem om immuunmodulatie te modelleren die relevant is voor diabetes type 1 en auto-immuunziekten.
- Operationele waarde: Ondersteunt de preklinische continuïteit door exosoombehandeling te koppelen aan meetbare fenotypische en functionele macrophage-uitkomsten.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen de vroege ontdekkingsfase om immunomodulerende mechanismen te beoordelen voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor therapieën die gericht zijn op de herprogrammering van immuuncellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over exosoom-gemedieerde differentiatie van immuuncellen en padmodulatie in monocyten.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor het beoordelen van exosoom-geïnduceerde veranderingen in markers voor macrofaagpolarisatie.
- Analytica: Maakt een zij-aan-zijvergelijking van M2-markerexpressieniveaus mogelijk om immunomodulerende effecten over verschillende exosoombatches of condities te kwantificeren.
- Translationeel onderzoek: Verbindt exosoomactiviteit met macrofaagfenotypes die worden waargenomen in de context van auto-immuunziekten, wat helpt bij risico-gecorrigeerde voortgang.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van immunomodulerende extracellulaire blaasjes uit diverse stamcelbronnen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van immunomodulerende kandidaten via gedefinieerde readouts voor monocyt-naar-M2-differentiatie.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde isolatie- en co-culture-workflow die reproduceerbaarheid tussen laboratoria en exosoombatches waarborgt.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door target engagement en fenotypische conversie in primaire menselijke immuuncellen te kwantificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van exosoomgebaseerde of exosoom-mimetische therapieën mogelijk op basis van de effectiviteit van macrofaagdifferentiatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Expertise in stamcelkweek, exosoomzuivering via ultracentrifugatie en monocytenisolatie met behulp van magnetische scheiding.
- Toegang tot ultracentrifuges, flowcytometrie en fluorescentiemicroscopie voor exosoomkarakterisering en fenotypische analyse.
- Standaardisatie van de monocytenzuiverheid (>90% CD14+) en de exosoomdosering (80 µg/mL) voor consistente differentiatieresultaten.
- Overwegingen voor aanpassing aan andere primaire immuunceltypen of monocyten-donoren die relevant zijn voor specifieke ziekten.
- Beperkingen omvatten variabiliteit in de exosoomopbrengst uit CB-SC-kweken en de afhankelijkheid van serumvrije condities om storende vesicle-bronnen te vermijden.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Isolation of CB-SC-derived Exosomes
2:03
Isolation of Human CD14-positive Monocytes
4:07
Treatment of Monocytes with CB-SC-derived Exosomes
6:08
Characterization, Interaction and Effects of the CB-SC-derived Exosomes on the Human Peripheral Blood Mononuclear Cells
8:27
Conclusion
