Superresolutie live celbeeldvorming van subcellulaire structuren
13 januari 2021
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor superresolutie live-cell imaging in intact weefsel. We hebben de voorwaarden gestandaardiseerd voor beeldvorming van een zeer gevoelige volwassen stamcelpopulatie in zijn inheemse weefselomgeving. Deze techniek omvat het balanceren van temporele en ruimtelijke resolutie om de directe observatie van biologische verschijnselen in levend weefsel mogelijk te maken.
Ons protocol maakt gebruik van regelmatige fluorofoorsondes en eenvoudige monstervoorbereidingstechnieken die de afgebeelde cel in fysiologische conditie houden om een zeer dynamisch cellulair proces en gedetailleerde subcellulaire structuren te bestuderen. Deze techniek stelt ons in staat om cellulaire processen te onderzoeken met een superresolutie en onder fysiologische omstandigheden voor een langere periode zonder de speciale of tijdelijke resolutie op te offeren. Begin met het snijden van een 12 tot 14 kilodalton moleculair gewicht cutoff dialysemembraan in kleine stukjes en week de stukken met 100 microliters levend celmedium gedurende ongeveer vijf minuten.
Terwijl de membranen weken, snijdt u de buitenste ring van een buis van 50 milliliter in kleine stukjes en steriliseert u de stukken in 70% ethanol. Voor dissectie en montage van teelballen, breng tien twee tot drie dagen oude verdoofde mannelijke vliegen over in een dissectieschaal onder een ontledingsmicroscoop en gebruik fijne tang om de teelballen te verwijderen. Wanneer alle teelballen zijn verzameld, wast u de teelballen twee keer in levend celmedium en gebruikt u een pipettip om 100 tot 150 microliter levend celmedium naar de voorbereide glazen bodemschaal te verspreiden.
Gebruik fijne tangen om de vliegtesten naar het midden van de schaal over te brengen en verwijder alle behalve ongeveer 10 microliters van het medium. Plaats snel het voorge natte membraan op de teelballen en plaats twee tot drie kleine plastic gewichten op het membraan. Voeg onmiddellijk 100 tot 150 microliter vers levend celmedium toe en plaats de ring terug op de verhoogde kant van de schaal.
Plaats de afdekstrip terug op de ring en wervel een stuk tissuepapier in water voordat u het papier op de afdekstrook plaatst. Bedek vervolgens de schaal met een deksel en zet de schotel vast op het podium van een superresolutiemicroscoop. Voor kiembaanstamcelbeeldvorming opent u de beeldvormingssoftware en schakelt u het verzonden licht in.
Gebruik de 63X-doelstelling om je te concentreren op het testesweefsel en de lasers in te schakelen. Klik op Live"om kiemstamcellen te vinden. Pas de scherpstelling aan en klik op Framegrootte"om de framegrootte in te stellen op tussen 512 bij 512 en 1024 bij 1024 pixels, en op Gemiddeld"om het framegemiddelde in te stellen op een of twee.
Klik op Master Gain"om de elektronenvermenigvuldigingswinst in te stellen op minder dan 800, en Lasers"om de laserkracht in te stellen op 1%tot 2%Zoom in op de regio of cel van belang om de beeldverwervingstijd te verkorten en het bleken van foto's te verminderen en te bevestigen dat de afbeelding optimaal is geconfigureerd voordat u op Experiment starten klikt"om de timelapse-beeldopname te starten. Als Airyscan Acquisition niet optimaal is geconfigureerd"wordt weergegeven, klikt u op Optimaal"in de secties framegrootte, Z-Stack en Scangebied" en optimaliseert u het tijdsinterval, het aantal Z-segmenten en de duur van de timelapse-beeldvorming, afhankelijk van het experimentele ontwerp en type specimen. Selecteer na beeldvorming Processing, Batch" en Airyscan Processing en selecteer de afbeeldingen die moeten worden verwerkt.
Klik vervolgens op Proces uitvoeren"om de afbeeldingen met superresolutie te verkrijgen. Live cell imaging van drosophila-teelballen die alfa tubuline GFP uitdrukken in kiemcellen in een vroeg stadium met behulp van een draaiende schijfconocale microscoop, maakt visualisatie van de asymmetrische intensiteit van GFP-signalen bij twee centrosomen mogelijk, als een helderder signaal bij het moeder-centrosoom en een relatief zwakker signaal bij de dochter-centrosomen. Het verschil in helderheid wordt waarschijnlijk weerspiegeld door de temporele asymmetrie van de microtubulinucleatie, maar de gedetailleerde morfologie en hoeveelheid van de microtubuli kunnen niet worden opgelost met behulp van spinneschijf confocale microscopie.
Live cell super resolution imaging daarentegen maakt de visualisatie en kwantificering van microtubulimorfologie en getallen mogelijk. Deze verbeterde resolutie onthult ook patronen van asymmetrische microtubulinucleatie, rek en verhoogde interactie met het nucleaire membraan. Live cell imaging maakt ook de visualisatie van asymmetrische nucleaire membraan invaginatie mogelijk, maar niet van individuele microtubuli die direct de kern binnendringen.
Deze superresolutietechniek voor levende cellen maakt daarentegen de directe observatie van deze gebeurtenissen mogelijk door gelijktijdige beeldvorming van zowel microtubuli als de nucleaire lamina. Tijdens metafase kunnen beide zuster centromeren als één signaal worden gedetecteerd met behulp van draaiende schijfmicroscopie, hoewel de centrale bevestiging van de microtubuli niet kan worden waargenomen. Daarentegen maakt live beeldvorming met superresolutie visualisatie van de microtubuli centromeeraanhechting in vroege profase mogelijk.
Zorg ervoor dat u een membraan over de teelballen plaatst om ervoor te zorgen dat ze niet bewegen of zweven tijdens de beeldvorming en om de microscoopinstellingen te optimaliseren om het bleken van foto's en fototoxiciteit te voorkomen. Er zijn veel manieren waarop deze methode kan worden toegepast, zoals het onderzoeken van eiwitdynamica, lineaire stress of cellulaire afweer en processen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol presenteert een methode voor superresolutie-imaging van levende cellen in intact weefsel, gericht op het bestuderen van dynamische cellulaire processen binnen een populatie volwassen stamcellen in hun natuurlijke omgeving. Het biedt een balans tussen temporele en spatiale resolutie om biologische fenomenen in levend weefsel effectief te observeren.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Microscopie
- Live-cell imaging
Achtergrond
- Belang van het handhaven van fysiologische condities tijdens beeldvorming
- Uitdagingen bij het observeren van dynamische cellulaire processen
- Vergelijking met traditionele microscopietechnieken
Gebruikte methoden
- Live-cell imaging met superresolutie
- Drosophila-testes als biologisch systeem
- Gebruik van fluorofoor-probes en spinning disc confocale microscopie
Belangrijkste resultaten
- Verbeterde visualisatie van de dynamiek en morfologie van microtubuli
- Onthulling van asymmetrische microtubule-nucleatie en interacties met het kernmembraan
- Maakte observatie van centromeer-aanhechting tijdens de metafase en profase mogelijk
Conclusies
- Deze studie demonstreert de effectiviteit van superresolutie-beeldvorming voor het observeren van cellulaire dynamiek.
- De methode draagt significant bij aan het begrip van cellulaire processen in de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Superresolutie-live-cell-imaging in intact weefsel maakt hoogwaardige observatie van dynamische subcellulaire processen onder fysiologische omstandigheden mogelijk, waardoor een kritisch hiaat in targetvalidatie en mechanistishe risicoreductie wordt opgevuld. Door de ruimtelijke en temporele resolutie te behouden zonder dat er gespecialiseerde probes of een hoge belichting nodig zijn, ondersteunt deze methode betrouwbare fenotypische screening en assayontwikkeling in ziekte-relevante systemen. De compatibiliteit met endogene fluoroforen met lage intensiteit breidt de toepasbaarheid uit naar vroege discovery-workflows, waarbij targetbetrouwbaarheid en predictieve waarde van essentieel belang zijn.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe visualisatie van target-interactie en subcellulaire lokalisatie in de natuurlijke weefselcontext mogelijk, waardoor mechanische ambiguïteit wordt verminderd.
- Operationele waarde: Ondersteunt hypothesetesten van proteïnedynamiek en complexvorming zonder fixatie-artefacten.
- Translationele waarde: Vergemakkelijkt de beoordeling van target-betrouwbaarheid in ziekterelateerde modellen, zoals stamcelniches.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve resultaten van microtubulimorfologie, nucleatiepatronen en organelininteracties voor assaystandaardisatie.
- Operationele waarde: Maakt time-lapse imaging mogelijk met een lage fototoxiciteit, wat longitudinale screeningscampagnes ondersteunt.
- Translationele waarde: Genereert reproduceerbare high-content data die geschikt zijn voor hit-validatie en lead-optimalisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en preklinische stadia door cellulaire processen in intact weefsel onder bijna-fysiologische omstandigheden te observeren.
- Operationele waarde: Behoudt de weefselmorfologie en cellulaire functie voor langdurige beeldvorming, wat longitudinale studies ondersteunt.
- Translationele waarde: Maakt observaties mogelijk die gerelateerd zijn aan biomarkers, zoals remodellering van de kernmembraan en centrosoom-asymmetrie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode laat zich integreren in vroege discovery-workflows door superresolutie-readouts te bieden die beslissingen over targetvalidatie en leadidentificatie informeren vóórdat er in preklinisch onderzoek wordt geïnvesteerd.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesegestuurd onderzoek naar cytoskeletdynamiek en nucleocytoplasmatische interacties in levend weefsel mogelijk.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-resultaten die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en de evaluatie van compound-effecten.
- Analytiek: Genereert superresolutie-datasets die het aantal microtubuli, elongatiesnelheden en de ruimtelijke organisatie kwantificeren voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van subcellularen observaties naar fenotypen op weefselniveau in stamcelniches.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar imaging-platform dat toepasbaar is over verschillende celtypen en ziektemodellen zonder dat probe-engineering vereist is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door subcellulaire mechanismen op te lossen die onzichtbaar zijn voor diffractiegelimiteerde microscopie.
- Operationele waarde: Zorgt voor standaardisatie via immobilisatie van monsters, beeldvorming met lage laserintensiteit en workflows voor batchverwerking.
- Strategische waarde: Vermindert uitval in een laat stadium door de getrouwheid van targetvalidatie te verbeteren in fysiologisch relevante contexten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door mechanistische risicoreductie van cytoskeletale en nucleoskeletale targets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van levend weefsel, superresolutie-microscopie en beeldbewerkingspijplijnen.
- Is afhankelijk van toegang tot superresolutiesystemen met Airyscan of gelijkwaardige mogelijkheden en kamers voor omgevingscontrole.
- Maakt standaardisatie van monsterpreparatie, montage en mediumsamenstelling tussen gebruikers en locaties noodzakelijk.
- Omvat aanpassingen voor variërende weefselfragiliteit, autofluorescentie en genetische toegankelijkheid buiten de testis van Drosophila.
- Wordt beperkt door de noodzaak voor genetische tagging van targets met compatibele fluoroforen, zoals EGFP of mCherry, op endogene loci.
