Het in kaart brengen van de structuur-functierelaties van ongeordende oncogene transcriptiefactoren met behulp van transcriptomische analyse
27 juni 2020
Intrinsiek ongeordende domeinen zijn belangrijk voor de functie van de oncogene fusietranscriptiefactor. Om deze eiwitten therapeutisch te targeten, is een meer gedetailleerd begrip van de regulerende mechanismen die door deze domeinen worden gebruikt, vereist. Hier gebruiken we transcriptomics om belangrijke structurele kenmerken van het intrinsiek ongeordende EWS-domein in Ewing-sarcoom in kaart te brengen.
Het uitvoeren van structuurfunctie-analyse op repetitieve en ongeordende transcriptiefactoren is moeilijk. Door transcriptomics te koppelen aan de juiste cellulaire context, onthult deze aanpak betere structurele functierelaties. Het gebruik van RNA-sequencing als functioneel resultaat maakt de effectieve beoordeling van alle genen die door een enkel eiwit worden gereguleerd in één experiment mogelijk, waardoor detectie van gedeeltelijke functies waarschijnlijker wordt.
Detectie van gedeeltelijke functies is bijzonder belangrijk voor oncogeen-fusietranscriptiefactoren, omdat we niet weten hoe deze eiwitten functioneren en hun sequencing kan leiden tot betere therapieën bij door fusie aangedreven kankers. Hoewel we ons zullen concentreren op de ongeordende EWS-domein in EWS/FLI is EWS betrokken bij andere fusies die disorde-domeinen bevatten met slecht gedefinieerde functies. Voor een cDNA-expressieconstructtransductie eerst, ontdooi snel het bevroren virus met cDNA-constructen in een waterbad van 37 graden Celsius en meng voorzichtig 2,5 microliter van acht milligram per milliliter polybreen in elke flacon.
Verwijder vervolgens het medium van één 50 tot 70%confluent 10 centimeter celkweekplaat per flaconconstruct en voer voorzichtig het volledige volume van twee milliliter construct langs de zijkant van de plaat. Wieg de plaat om het virus gelijkmatig over de cellen te verspreiden en plaats de plaat in een weefselkweekincubator van 37 graden Celsius gedurende twee uur, wieg de plaat elke 30 minuten om te voorkomen dat delen van de plaat uitdrogen. Aan het einde van de incubatie, voeg vijf milliliter medium toe dat is aangevuld met foetaal bovien serum, antibiotica, natriumpyruvaat en polybreen.
Na overnachtelijke incubatie in de celkweekincubator vervangt u het supernatant met selectiemedium en brengt u de cellen terug in de celkweekincubator voor een aanvullende zeven tot 10 dagen om selectie en cDNA-constructexpressie mogelijk te maken. Aan het einde van de selectieperiode, verzamel de cellen in een 15 milliliter kegelbuis voor tellen en verdeel vijf tot tien keer 10 tot de vijfde cellen in een nieuwe buis voor RNA-sequencing en twee keer 10 tot de zesde cellen in een andere nieuwe buis voor eiwitextractie. Sedimenteer de cellen door centrifugatie en suspendeer de pellets in één milliliter koude PBS of een centrifugatie van vijf minuten.
Bevriest vervolgens beide pellets en vloeibare stikstof en bewaart de cellen bij min 80 graden Celsius. Om de knockdown van eiwitten van belang en de expressie van de panelconstructies te valideren, blot de eiwitlysaatmonsters met de juiste primaire en secundaire antilichamen volgens standaard Western blot-analyseprotocollen. Om RNA-kwaliteit en -hoeveelheid te beoordelen, gebruikt u het lysisbuffer van een silica spinkolom gebaseerde extractiekit om de RNA-sequencing celmonsters te lysen en brengt u de lysaat toe op een genomische DNA-verwijderingskolom bij meer dan 13.000 omwentelingen per minuut gedurende 30 tot 60 seconden.
Ga vervolgens verder met silica spinkolom-zuivering en was het RNA op de kolom volgens de instructies van het kit. Eluteer vervolgens het RNA in 30 microliters elutiebuffer en analyseer minimaal 2,5 microgram RNA op een spectrofotometer bij een 260 tot 280 nanometer verhouding om de RNA-hoeveelheid en -kwaliteit te beoordelen. Gebruik Putty om het terminal te openen naar de high-performance computing omgeving en maak een analyse directory genaamd project voor fastq-bestandsanalyse.
Navigeer naar de pad naar project directory en maak een directory voor de gecomprimeerde raw fastq. gz bestanden genaamd fastq en een tweede directory genaamd trimmed. Gebruik een geschikt beveiligd bestandsoverdrachtsprogramma om de gecomprimeerde raw fastq.
gz bestanden van lokale opslag naar het pad naar project fastq directory en controleer of er een R1 en een R2 bestand voor elk monster is. Navigeer naar pad naar project fastq en gebruik de opdracht in trim galore zoals aangegeven om de lage kwaliteitslezingen uit de fastq. gz bestanden te knippen.
Navigeer naar het pad naar project directory en maak een nieuwe directory genaamd STAR output. Navigeer naar het pad naar project trim directory en gebruik de opdracht zoals aangegeven om STAR te laten lopen om de gesneden fastq. gz bestanden uit te lijnen.
Loceer de vereiste uitvoer voor de volgende stappen, die de tellingen per transcript op de aangegeven locatie bevatten en gebruik de opdracht om elke reads per gen uit tab-bestand in te lezen. Gebruik voor de eerste kolom alleen de tekens vóór de punt in de ENSEMBL gen-ID-kolom voor de gemak van downstream-verwerking. Gebruik vervolgens de opdracht om de tellingen van alle monsters samen te stellen in het dataframe genaamd totcts en sla dit nieuwe tabel van ruwe tellinggegevens op als een tab-afgescheiden tekstbestand.
Om het differentiële expressieprofiel voor elk construct te definiëren met behulp van DESeq2 voert u het experimentele DESeq2-ontwerp in en gebruikt u de DESeq-dataset van de matrixfunctie om een DESeq-dataset te construeren om de groottefactoren te schatten en om DESeq2 uit te voeren. Om de kwaliteit van de analyse te evalueren gebruikt u DESeq2 om de regularised log genormaliseerde tellingen te extraheren. Bij het extraheren van de resultaten voor elk transcriptieprofiel van de DESeq2-resultaten, voer paarsgewijze vergelijkingen uit met verwijzing naar de knockdown-conditie of de baseline-lege vector.
Verder verandert u deze resultaten met de HGNC-gensymbolen en extraheert u de gegevens uit de DESeq2-gegevens als een enkel bestand met de ENSEMBL-gen-ID, HGNC-symbool, baseMean-expressie en differentiële expressiegegevens voor alle constructies met log tweevoudige verandering en ruwe en aangepaste P-waarden. Beoordeel de succesvolle batchnormalisatie en belangstelling monstersimiliriteit en gebruik de code om de regularised log genormaliseerde tellingen te gebruiken om de monstersclustering met hoofdcomponentenanalyse en een monster-tot-monsterafstandsplot te controleren. Gebruik de regularised log genormaliseerde tellingen om de 1.000 meest variabele genen in een matrix te extraheren en gebruik een heatmap om een niet-gesuperviseerde hiërarchische clustering van de monsters uit te voeren op basis van deze genen.
Om de clusters van belang uit de dendrogram te extraheren, beslist u op welk niveau van de dendrogram clusters van belang verschijnen en stelt u K gelijk aan het aantal clusters op dat niveau. Om te bepalen welke clusters van belang zijn, tekend de heatmap opnieuw geordend per cluster en export
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van intrinsiek ongeordende domeinen in oncogeen fusie transcriptiefactoren, met een focus op het EWS-domein in Ewing-sarcoom. Door transcriptomics te gebruiken, heeft het onderzoek tot doel de regulerende mechanismen van deze ongeordende gebieden te verduidelijken.
Belangrijkste Onderdeel van het Onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Transcriptionele Regulatie
Achtergrond
- Oncogeen fusie transcriptiefactoren bevatten vaak intrinsiek ongeordende domeinen.
- Het begrijpen van hun regulerende mechanismen is cruciaal voor het ontwikkelen van gerichte therapieën.
- Transcriptomics kan structuur-functierelaties in deze eiwitten onthullen.
- Gedeeltelijke functiedetectie is essentieel voor het begrijpen van hun rol bij kanker.
Doel van het Onderzoek
- Om structurele kenmerken van het EWS-domein in Ewing-sarcoom in kaart te brengen.
- Om de therapeutische targeting van oncogeen fusie transcriptiefactoren te verbeteren.
- Om het begrip van de regulerende mechanismen van ongeordende domeinen te vergroten.
Gebruikte Methoden
- RNA-sequencing om gen-regulatie door het EWS-domein te beoordelen.
- cDNA-expressieconstruct transductie in celculturen.
- Western blot analyse voor eiwitvalidatie.
- DESeq2 voor analyse van differentiële expressie.
Belangrijkste Resultaten
- Identificatie van belangrijke structurele kenmerken van het EWS-domein.
- Succesvolle validatie van knockdown en expressie van constructies.
- Inzichten in de genregulerende netwerken beïnvloed door het EWS-domein.
- Opstellen van een raamwerk voor toekomstige studies naar ongeordende domeinen.
Conclusies
- Intrinsiek ongeordende domeinen spelen een belangrijke rol in de functie van oncogeen transcriptiefactoren.
- Transcriptomics is een krachtig hulpmiddel voor het onthullen van structuur-functierelaties.
- De bevindingen kunnen de ontwikkeling van gerichte therapieën voor fusie-gedreven kankers informeren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Mapping structure-function relationships of disordered oncogenic transcription factors using transcriptomic analysis addresses a critical challenge in target validation for fusion-driven cancers. This approach enables comprehensive functional interrogation of protein domains that lack defined structure, supporting predictive confidence in early discovery and mechanistic de-risking. The method informs portfolio decisions by clarifying which structural features are essential for oncogenic activity and therapeutic targeting.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of disordered domain contributions to oncogenic function.
- Supports biological de-risking by linking structural mutations to transcriptional outcomes.
- Facilitates identification of critical target features for therapeutic intervention.
- Improves predictive confidence in target selection for fusion-driven malignancies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cellular systems for downstream transcriptomic and phenotypic screening.
- Delivers quantitative gene expression outputs for robust assay standardization.
- Enables reproducible detection of partial or loss-of-function phenotypes across constructs.
- Supports scalable screening of domain variants for functional impact.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic signatures with disease-relevant gene networks in Ewing sarcoma.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical model validation.
- Enables risk-adjusted advancement of targets with confirmed functional relevance.
- Supports identification of novel gene sets for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This transcriptomic mapping approach integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting iterative hypothesis testing and target prioritization.
- Discovery Biology: Links structural mutations to global gene regulation, clarifying mechanistic drivers of oncogenicity.
- Screening: Provides quantitative, reproducible gene expression profiles for construct comparison.
- Analytics: Enables differential expression, clustering, and principal component analyses to distinguish functional classes.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant gene sets and phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for structure-function mapping of other disordered transcription factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes transcriptomic and phenotypic readouts for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by clarifying essential target features.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of fusion-driven targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transcriptomics, bioinformatics, and functional genomics.
- Demands access to high-throughput sequencing and computational infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-batch normalization and quality control for reproducibility.
- Adaptable to other fusion proteins with disordered domains, pending construct availability.
- Dependent on robust phenotypic assays to complement transcriptomic outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:55
In Vitro Construct Panel Setup
2:07
Cell Collection
2:47
Construct Expression Validation and Correlative Phenotypic Assay Setup
3:50
Alignment and Transcript Counting Pipeline
5:32
Differential Expression
7:40
Results: Representative Disordered Oncogenic Transcription Factor Structure-Function Relationship Mapping
9:31
Conclusion
