Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

Gegevens die met behulp van deze techniek worden gegenereerd, bevorderen een goed begrip van auto-immuungevoelige muismodellen, evenals gehumaniseerde muizen, die kunnen worden gebruikt voor algemene antilichaam- of antilichaamlevenstherapieën. De beschikbaarheid van reagentia met een steeds groter wordend bereik van fluoroforen, maakt de gelijktijdige analyse van meerdere parameters op individuele cellen mogelijk en maakt de beoordeling van B-cel heterogeniteit mogelijk. Dit protocol is ontwikkeld met als doel het fenotyperen van genetisch gemanipuleerde muizen.

om te bepalen of genetische manipulatie de ontwikkeling van B-cellen zou veranderen. Hallo, ik ben Faith Harris. Ik zal de procedure vandaag demonstreren.

Begin met het aliquoteren van een miljoen van elk celtype van elk dier in een 96-well U-bottom plaat. Zorg ervoor dat er voldoende putten beschikbaar zijn voor alle monsters en controles, inclusief volledige vlek-, fluorescentie-minus-één monsters en niet-gekleurde monsters voor elke fluorofoor. Voor het beenmergrijpingspaneel en het miltrijpingspaneel, aliquot cellen in twee putten, 1 miljoen cellen per put voor elk volledig vlekmonster.

Voor de single color compensation levensvatbaarheidscontroles, voeg twee miljoen cellen elk van elk celtype toe aan individuele putten. Centrifugeer de plaat bij 845 x g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant door de plaat snel om te keren en over een gootsteen te vegen, waarbij u ervoor zorgt dat de putten niet kruisbevuilen.

Was de cellen tweemaal in 200 microliter DPBS. Centrifugeer en decanteer het supernatant na elke wasbeurt. Resuspend de cellen in 100 microliter levensvatbaarheidskleurstof verdund in DPBS in de verhouding van één tot 1000, waarbij de cellen die worden gebruikt voor een enkele kleurcompensatie worden vermeden.

Laat voor elke vlekkenset verschillende onbevlekte putten achter voor een volledig onbevlekt monster en andere controles die u mogelijk nodig hebt, evenals een extra niet-gekleurde put voor levensvatbaarheid FMO-controle. Voeg PBS toe aan deze putten. Resuspend de cellen van single color compensation levensvatbaarheidscontroles in 200 microliter verdunde levensvatbaarheidskleurstof.

Breng 100 microliter van deze cellen over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en verwarm deze gedurende vijf minuten bij 65 graden Celsius en breng de verwarmde cellen vervolgens terug naar de oorspronkelijke put met de resterende levende cellen. Incubeer de cellen bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten beschermd tegen licht. Centrifugeer na de incubatie de cellen en decanteer het supernatant door de plaat te vegen of om te keren zonder de andere putten te kruisvervuilen.

Was de cellen door resuspendatie in 200 microliter DPBS, centrifugeer en decanteer het supernatant zoals voorheen. Herhaal de DPBS-wasbeurt opnieuw. Voeg microliter FC-blok verdund met vlekbuffer toe in een verhouding van één tot 50 om een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter te krijgen.

Voeg voor peritoneale cellen vijf microliter monocytenblokker toe om de niet-specifieke kleuring te verminderen. Incubeer vervolgens de cellen bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten, beschermd tegen licht. Bereid volledige vlekmastermengsels en FMO's in de vlekbuffer voor een eindvolume van 100 microliter per miljoen cellen met behulp van de antilichaamtabellen in het tekstmanuscript.

Zonder fc-blok te verwijderen, voegt u 100 microliter volledige vlekmengsels en FMO's toe aan geselecteerde putten. Bereid enkelvoudige kleurcompensatiecontroles voor elk antilichaam en een vlekkenset voor. Volg de aanwijzingen van de fabrikant als u compensatiekralen gebruikt.

Incubeer de cellen en de kralen bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht. Centrifugeer en decanteer vervolgens het supernatant door de plaat om te keren en te vegen. Was de cellen en kralen drie keer in 200 microliter vlekbuffer en centrifugeer en decanteer het supernatant elke keer.

Resuspend de cellen en kralen in 200 microliter 2% paraformaldehyde in DPBS om de monsters te fixeren voor analyse. Incubeer de cel en kralen bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht, centrifugeer en decanteer vervolgens het supernatant door de plaat om te keren of te vegen. Resuspend de cellen en kralen in 200 microliter vlekbuffer.

Plaats een filterplaat over een schone 96-well U-bottom plaat en breng elk monster over naar een put van de filterplaat met behulp van een multipipet. Centrifugeer de filterplaat en decanteer het supernatant. Voor de beenmerg- en miltrijpingspanelen, resuspend de volledig gekleurde cellen in 100 microliter vlekbuffer.

Combineer de twee putten voor elk dier in één put. Resuspend de resterende panelen, FMO's en controles in 200 microliter vlekbuffer. Incubeer vaste cellen en kralen bij vier graden Celsius 's nachts, beschermd tegen licht.

Registreer compensatiecontroles voor elk vlekpaneel met behulp van de voorbereide enkele vlekcompensaties en stel positieve en negatieve poorten in voor elk monster. Bereken de compensatiematrix met behulp van de software. Begin met het verkrijgen van het eerste monster en zorg ervoor dat de poorten op de juiste manier zijn ingesteld.

Stel de machine in om de verschillende celgebeurtenissen voor elk monster uit te voeren en vast te leggen, zoals vermeld in het tekstmanuscript. Ga verder met gegevensanalyse met behulp van flowcytometrie-analysesoftware, volgens de gatingstrategieën in het tekstmanuscript. Flowcytometrische analyse voor karakterisering van peritoneale B-cellen in het peritoneum toont de frequenties van levensvatbare peritoneale cellen, totale B-cellen, B-1- en B-2-subsets, evenals B-1a- en B-1b-cellen bij muizen.

Wanneer beenmerg B-cellen werden geanalyseerd, werden frequenties van levensvatbare cellen, totale B-cellen, Fractie A, pre-pro-B-cellen, Fractie B, Fractie C, Fractie C'Fractie D, onrijpe Fractie E, overgangsfractie E en fractie F B-cellen in muizen bepaald. Analyse van milt B-cellen toont de frequenties van levensvatbare miltcellen, totale B-cellen, overgangs B-cellen, T1, T2, T3-cellen, volwassen B-cellen, folliculaire I-cellen, folliculaire II-cellen, precursor- en volwassen marginale zonecellen en B-1-cellen bij muizen. De frequenties van immunoglobuline kappa en immunoglobuline lambda B cellen bij muizen werden bepaald met flow cytometrische analyse van de milt.

Wanneer u dit protocol uitvoert, moet u het signaal van de ene detector die overloopt in de volgende oplossen met behulp van compensatieregelaars. Deze controles kunnen cel afzonderlijk gekleurd zijn of met commercieel verkrijgbare compensatiekralen. Aanvullende testen kunnen worden gebruikt in combinatie met flowcytometrie, zoals immunohistochemie om cellokalisatie in lymfoïde organen te visualiseren, evenals twee fotonenmicroscopie om B-celresponsen in realtime en tijd te analyseren.

Flowcytometrie-analyse van de B-celcompartimenten maakt karakterisering mogelijk van fenotypen geassocieerd met BCR en gerelateerde tekortkomingen, verstoringen van BCR-signaalmoleculen of verstoring van cytokines die de overleving van B-cellen moduleren.