Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

Biologische kleine hoek x-ray verstrooiing biedt structurele metingen van macromolecule en macromoleculaire complexen. Idealiter moet het te meten monster monodispersed zijn. Hoewel in sommige gevallen de grootte uitsluiting chromatografie SAXS is niet voldoende om monodispersity te produceren, een software-gebaseerde deconvolutie van de SAXS-gegevens kan worden uitgevoerd om een geïdealiseerde SAXS curve te produceren.

Volgens dit protocol kunnen een deconvolutieprogramma en het gebruiksvriendelijke Scatter-programma worden gebruikt om het Vaccinia virus DNA polymerase exominus mutanten te analyseren. Als u een achtergrondaftrekken van de chromatografiegegevens voor grootteuitsluiting wilt uitvoeren, opent u het op Java gebaseerde Scatter 4-programma en opent u het tabblad SEC. Sleep en drop de gereduceerde gegevensbestanden in het venster Gegevens neerzetten onder het venster en klik op de knop uitvoermap en open om de uitvoermap in te stellen waarin de gegevens worden opgeslagen.

Voer de voorbeeldnaam in het vak Opslaan als in en klik op traceren. Klik op de knop Details bewerken om de experimentele details te bewerken en de juiste velden in te vullen. Als u de bufferframes handmatig wilt selecteren, klikt u op Buffers instellen.

Klik en sleep om de buffer opnieuw te selecteren als een flat op de traceercurve vóór het lege volume van de chromatografiekolom voor grootte van ongeveer 100 frames en klik op setbuffer en update om het SEC-bestand opnieuw te berekenen. Klik en sleep met links om een interessegebied op het signaalplot te selecteren en klik links en sleep de kruisharen in het plot van de warmtekaart om de zoom en subset van frames te selecteren die worden gebruikt voor samenvoegen. Met een andere linkerklik markeert u de frames in de heatmap die overeenkomt met het gebied rechtsonder van de kruisharen.

Idealiter moet het frame een gebied markeren met een overwegend cyaankleur en een stabiele straal van gyration. Als u tevreden bent met de geselecteerde frames, klikt u op Samenvoegen om de afgetrokken frames samen te voegen en klikt u op het tabblad analyse om de gegevens weer te geven. Laad de gegevensset in het deconvolutieprogramma voor deconvolutie van de gegevens.

Gebruik in het configuratiescherm onder bestanden het mapsymbool om de gegevens te zoeken en alle DAT-bestanden te markeren. Een plot van geïntegreerde intensiteit versus framenummer zal worden getrokken in de serie plot. Klik onder het tabblad reeks om de curve te markeren en het pop-upvenster voor DE LC-analyse te openen.

Als u een geschikt buffergebied wilt selecteren, klikt u op Regio toevoegen om een gebied vóór de piek van het chromatogram en een gebied na de oplosmiddelfront te selecteren en op de buffer in te stellen. Pop-upvensters geven aan dat frames niet zijn geselecteerd voor de achtergrond. Als u de EFA wilt starten, klikt u met de rechtermuisknop op het gemarkeerde bestand en selecteert u EFA in het menu.

In het pop-upvenster moet de enkele waardedecompositie van de gegevensset worden waargenomen. Schakel in het selectievakje de waarden van het vak frames gebruiken in om te bevestigen dat het hele piekgebied dat moet worden gedeconvolutt, is bedekt met het intensiteitsplot. De plot met enkelvoudswaarden toont de intensiteit van de enkelvoudswaarden boven de basislijn.

Als de linker en rechter enkele vectoren niet overeenkomen, wijzigt u het significante enkelvoudsvectoraantal in twee en verplaatst u de frames totdat de linker- en rechtervoentvectoren vergelijkbaar zijn. De EFA wordt berekend, het genereren van percelen in de voorwaartse en achterwaartse richtingen voor elke vector en geven aan wanneer de componenten het oplossingsprofiel starten en verlaten voor de geselecteerde grootteuitsluitingschromatografie SAXS-gegevens. RAW zal proberen om de bereiken te identificeren.

Gebruik indien nodig de pijlen om de bereiken te wijzigen, zodat elke cirkel het begin is van een buigpunt, stijgt van of valt naar basislijn en klik vervolgens. Als u pieken wilt verminderen of elimineren, moet u ongeveer identificeren welk frame overeenkomt met de piek met behulp van de pijlspunten voor bereikbesturingselementen om de besturingselementen voor het componentbereik aan te passen. Wanneer een minimaal Chi-vierkant is bereikt, klikt u terug om een validatiecontrole uit te voeren.

Als de oorspronkelijke EFA-plots er nog steeds geldig uitzien, klikt u op volgende en slaat u EFA-gegevens op om de plots op te slaan. Klik vervolgens op Gereed om het EFA-venster te sluiten. Open vervolgens in het RAW-venster profielen in het plotpaneel om de curven weer te geven.

Klik op het tabblad Profielen van het configuratiescherm met de rechtermuisknop om de curven op te slaan als DAT-bestanden. Open voor SAXS-bepaling het tabblad spreidingsanalyse en selecteer G om het handmatige Guinier-analysegereedschap te selecteren. In het perceel, toe te voegen of te verwijderen punten zodanig dat de resten niet over een glimlach of frons functie.

De geselecteerde gegevens in de Guinier-pasvorm mogen de maximale wachtrij niet overschrijden, vermenigvuldigd met een straal van de gyratielimiet van 1,3. Klik genormaliseerd Kratky. De resulterende plot biedt een beoordeling van de structurele toestand van het macromolecuul, bolvormig, cilindrisch, wanordelijk, genormaliseerd voor massa en concentratie.

Klik op het volume van de correlatie. De totale verspreide intensiteit en een geïntegreerd gebied van de totale verspreide intensiteit als functie van Q-percelen worden weergegeven als een snelle referentie voor het valideren van de kwaliteit van de verstrooiingscurve. Klik op flexibiliteit om de flexibiliteitsanalyse te starten.

Elk paneel in het pop-upvenster toont een plot waarin een machtsrechtelijke relatie tussen de compacte en de langgerekte flexibele biopolymeren wordt uitgebuit. Gebruik de schuifregelaar onder aan het vak om de weergave van de gegevens te wijzigen totdat een plateau in een van de percelen is bereikt. Klik direct na het uitvoeren van een flexibiliteitsanalyse op volume.

Er wordt een pop-up van drie grafieken gegenereerd. De Porod-Debye plot tracks waar de schuifregelaar van de flexibiliteit plot werd achtergelaten en toont de plateaued gebied gegevens. Als u het volume van het deeltje wilt berekenen, verplaatst u de begin- en eindpunten totdat de blauwe lijn op het perceel in het plateaugebied past.

Voor een onbevooroordeeld resultaat, de restanten in de Porod-Debye exponent power law fit mag geen patroon te tonen. Onder het tabblad P van R kunnen de werkelijke ruimteverdeling en de verstrooiingscurve voor het monster worden waargenomen. Idealiter moet de verdelingscurve glad zijn zonder golven en moet de x-as gewoon voorzichtig raken.

Klik met de rechtermuisknop op de voorbeeldnaam en klik op DMAX zoeken om een nieuw venster te openen. De limieten voor de maximale dimensie zijn vooraf ingesteld met het voorgestelde maximale Q-bereik, de maximale gegevenspunten die moeten worden gebruikt voor de berekening, de lagere en bovenste maximale dimensielimieten en een lagere en bovenste alfascore. Klik op start.

Er wordt een samengestelde verdeling gemaakt, samen met een voorgestelde maximale dimensie en alfaniveau. Als deze gegevens aanvaardbaar zijn, sluit u het venster om terug te keren naar het tabblad P van R, waar de wederkerige ruimteplot nu wordt bijgesneden om het voorgestelde maximale Q-bereik aan te passen. Selecteer het meer model en klik op achtergrond om het alfaniveau en de maximale dimensie in te stellen op de voorgestelde waarden in het pop-upvak.

Klik op verfijnen. Er wordt een plot voor cross-validatie geopend, waaruit blijkt of punten moesten worden afgewezen zoals aangegeven in het rood. Als er slechts een paar afgewezen punten en de verdeling ziet er goed uit, dan is het model is goed.

U drukt een rapport af op het tabblad Analyse. Klik met de rechtermuisknop om het voorbeeld te markeren en klik met de rechtermuisknop op de voorbeeldnaam. Selecteer Rapport maken in de afzonderlijke gegevensset.

Er wordt een tekstvak geopend om opmerkingen mogelijk te maken en er wordt een PDF-document gemaakt met alle gegenereerde cijfers en waarden. In deze representatieve analyse, E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant was gebonden aan DNA en lopen met behulp van grootte uitsluiting chromatografie kleine hoek x-ray verstrooiing. Er werden twee pieken waargenomen.

De eerste grote piek vertegenwoordigt het E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant DNA complex. En de tweede geeft de niet-gebonden toestand aan. Terwijl de klassieke benadering van het selecteren van frames een stabiele straal van gyration van het complex in de eerste piek biedt, wordt de tweede piek duidelijk samengevoegd en de straal van gyration over het perceel toont aan dat de tweede piek van belang geen stabiele straal van gyration toe te schrijven aan kruispiekverontreiniging heeft.

In deze analyse konden slechts vijf frames worden gebruikt die een semi-stabiele straal van gyration vertoonden. Wanneer afgetrokken, gaven ze een straal van gyration van 36,3 angstroms. Toen de pieken werden gedeconvoluteerd met behulp van EFA, werd de overeenkomstige curve voor de tweede piek bedekt met het origineel, met een duidelijke daling van het signaal naar het lawaai en de lagere straal van gyration van 34,1 angstroms.

Een Kratky plot van de gegevens blijkt dat het complex met de ingewikkelde piek is meer bolvormig, zoals bevestigd door de PR-curve die een maximale dimensie van 108,5 angstroms voor de gedeconvolutte curve geeft. De niet-gedeconvolkte gegevens voor deze analyse zijn langer langwerpig met een maximale dimensie van 120 angstroms, waarschijnlijk als gevolg van de heterogeniteit die voortvloeit uit de niet-gebonden E9 polymerase minus exonleaseuc mutant. De meest kritieke stappen zijn bij het selecteren van de enkelvoud waarden en het bereik van de gebruikte gegevens als deze sterk van invloed op de nauwkeurigheid van de deconvolutie.

De resultaten moeten niet op zichzelf worden genomen, maar verder worden beoordeeld met behulp van aanvullende technieken zoals analytische centrifugatie of multi-angle laserlichtverstrooiing om hun biologische interpretatie mogelijk te maken. In-line kolom gekoppelde SAXS in combinatie met deconvolutie en een gebruiksvriendelijke interface zoals het programma Scatter biedt is een krachtig pakket om zinvolle structurele gegevens te verstrekken, zelfs van intrinsiek moeilijke systemen.