Kwantificering van circulerend varkensspecifiek DNA in het bloed van een Xenotransplantatie Model

Xenotransplantatie is een haalbare methode om te behandelen Echter, effectieve monitoring van de immuunafstoting van xenotransplantatie is een probleem voor artsen en de onderzoekers. Dit protocol is een eenvoudige, handige, lage kosten en minder invasieve methode om de immuunafstoting van de xenotransmutatie te controleren. Deze techniek kan worden gebruikt in xenotransplantatie veld, met inbegrip van pig-to-human eilandje transplantatie, niertransplantatie, levertransplantatie en harttransplantatie.

Begin met het overbrengen van 500 microliter bloedmonsters in verschillende microcentrifugebuizen. Voeg 20 microliter protease K en 500 microliter lysisbuffer toe aan de buizen. Dan grondig schudden ze te mengen.

Zet de buizen in een waterbad op 56 graden Celsius gedurende 10 minuten, schudden ze twee tot drie keer tijdens de incubatie totdat de oplossing duidelijk wordt centrifuge ze kort om de vloeibare kralen te verwijderen uit de binnenwand van de buis covers. Voeg vervolgens 500 microliter watervrije, ethylalcohol toe en schud grondig. Breng het mengsel over naar de adsorptiekolom.

Centrifuge de kolom vervolgens gedurende twee minuten en gooi de restvloeistof weg. Voeg 800 microliter spoeloplossing toe aan elke adsorptiekolom en centrifuge gedurende één minuut. laat de kolommen op kamertemperatuur gedurende enkele minuten om de resterende spoeloplossing te drogen.

Breng de absorptiekolommen over naar een schone centrifugaalbuis. Voeg 50 microliters elutiebuffer toe aan het midden van de adsorptiefilms en plaats ze twee tot vijf minuten op kamertemperatuur en vercenter ze gedurende één minuut. Bereid de PCR master mix volgens manuscript aanwijzingen, voeg dan 23 microliter van de mix in elke 0,6 milliliter micro centrifuge buis.

Voeg twee microliter genomisch DNA toe aan elke buis en zorgvuldig Cabot. Meng en vercentrifuge vervolgens kort. Plaats de buizen in een PCR cycler en start de versterking.

Wanneer de reactie klaar is uit te voeren Agarose elektroforese. Voeg 1,2 gram Agarose toe in een kolf met honderd millimeter TAE en kook het vijf minuten in de magnetron. Zodra de Agarose is afgekoeld tot ongeveer 70 graden Celsius, voeg vijf microliters van nucleïnezuur kleurstof in de kolf, langzaam, giet het in de plaat en laat het op kamertemperatuur totdat het stolt in een gel.

Voeg vijf microliter van elk monster en 2-Log DNA Ladder of DNA Marker 1, in de putten van de Agarose gel en elektroforese op 120 miljoen pier totdat de banden zijn gescheiden. Visualiseer de gel met een ultraviolette imager. Na het uitvoeren van transformatie zoals beschreven in de tekst manuscript, controleer de plasmiden door dubbele beperking enzym spijsvertering met EcoR I en Bam HI. Scheid de verteerde producten met 1%Agarose elektroforese en stel de gel bloot aan UV-licht.

Verdun de geconcentreerde plasmid met het fragment van varkens-DNA tot twee keer 10 tot de 11e exemplaren per milliliter voor de startstandaardoplossing, Met behulp van dubbel gedestilleerd water. Om een standaardcurve vast te stellen, bereidt u een qPCR-mastermix voor, zoals beschreven in het tekstmanuscript en voegt u 40 microliter van de mix toe aan elke buis van een strook met acht buizen. Voeg 10 microliter standaard DNA van verschillende concentraties toe, dop de buizen vervolgens kort en centrifuge ze.

Plaats de buizen in de qPCR-machine en voer de versterking uit. Gebruik EDTA buizen om bloedmonsters van ongeveer 400 microliters te verzamelen van de pig-to-monkey slagader patch modellen, of 100 microliters van de pig-to-mouse celtransplantatie modellen. Breng de monsters vervolgens over op 1,5 milliliter centrifugebuizen.

Verwijder de bloedcellen uit de bloedmonsters door centrifugatie bij lage temperatuur en hoge snelheid. Breng de supernatant over op een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter en verwijder het celpuin door middel van centrifugatie op 16.000 keer G gedurende 10 minuten. Breng de supernatant over naar een nieuwe 1,5 milliliter centrifugebuis en haal het circulerende DNA eruit met behulp van een commercieel serum tijdens de circulatie van DNA-extractiekit.

Condenseer het volume circulerend DNA tot 40 microliter en bewaar het bij negatieve 20 graden Celsius. Voer qPCR uit om het circulerende varkensspecifieke DNA te kwantificeren. Varkensspecifieke primers werden ontworpen en gebruikt om circulerend varkensspecifiek DNA te kwantificeren door qPCR, in varkens-tot-muisceltransplantatiemodellen en pig-to-monkey slagaderpatch, transplantatiemodellen.

Agarose elektroforese werd gebruikt om versterkte DNA-fragmenten te isoleren. Met behulp van PCR werden de primers-specifiek voor versterkt varkens genomic DNA geïdentificeerd. Vervolgens werden soortenspecificiteiten van deze primers in het cohort van aap of menselijk genomisch DNA of in het cohort van muisgenomic DNA bevestigd.

Tot slot werden twee soorten-specifieke primers, gebruikt om varkens-DNA te versterken in de varkens-tot-aap slagader patch en varken aan muis, celtransplantatie modellen. Het belangrijkste om te onthouden tijdens een poging dit protocol, is dat besmetting van alle soorten moet worden voorkomen. Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers om nieuwe vragen binnen xenotransplantatie te verkennen, omdat het een eenvoudige goedkope en niet-invasieve methode is om de immuunafstoting van xenotransplantatie te controleren.