Name: Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Ontdek FPOP voor eiwitkarakterisatie met real-time dosimetrie om eiwitinteracties en conformaties te meten. Deze methode biedt flexibiliteit in buffersystemen en verbetert de betrouwbaarheid van labelreacties voor structurele biologie en farmaceutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We erkennen onderzoeksfinanciering van het National Institute of General Medical Sciences grant R43GM125420-01to ter ondersteuning van commerciële ontwikkeling van een benchtop FPOP-apparaat en R01GM127267 voor de ontwikkeling van standaardisatie- en dosimetrieprotocollen voor hoogenergetische FPOP.

Joshua S. Sharp onthult een aanzienlijk financieel belang in GenNext Technologies, Inc., een klein bedrijf dat technologieën wil commercialiseren voor eiwitrijke analyse van de orderstructuur, waaronder hydroxylradicale eiwitvoetafdruk.

Mass spectrometrie gebaseerde structurele technieken, met inbegrip van waterstof-deuterium uitwisseling, chemische cross-linking, covalente etikettering, en native spray massaspectrometrie en ionen mobiliteit zijn snel groeiende in populariteit als gevolg van hun flexibiliteit, gevoeligheid, en het vermogen om complexe mengsels te behandelen. FPOP heeft verschillende voordelen die zijn populariteit op het gebied van massaspectrometrie gebaseerde structurele technieken heeft versterkt. Net als de meeste covalente etikette...

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) is een opkomende techniek voor de bepaling van eiwittopografische veranderingen door ultrasnelle covalente modificatie van het oplosmiddel blootgestelde oppervlak van eiwitten, gevolgd door detectie door LC-MS1. FPOP genereert een hoge concentratie hydroxylradicalen in situ door UV-laserflitsfotolyse van waterstofperoxide. Deze hydroxyl radicalen zijn zeer reactief en van korte duur, verbruikt op ongeveer een microseconde tijdschaal onder FPOP voorwaarden2. Deze hydroxylradicalen verspreiden zich door water en oxideren verschillende organische componenten in oplossing tegen kinetische snelheden die over het algemeen variëren van snel (~106 M-1 s-1) tot diffusiegecontroleerde3. Wanneer de hydroxylradical een eiwitoppervlak tegenkomt, oxideert de radicaal de aminozuurzijketens op het eiwitoppervlak, wat resulteert in een massaverschuiving van dat aminozuur (meestal de netto toevoeging van één zuurstofatoom)4. De snelheid van de oxidatiereactie bij elk aminozuur hangt af van twee factoren: de inherente reactiviteit van dat aminozuur (dat afhankelijk is van de zijketen en de volgordecontext)4,5 en de toegankelijkheid van die zijketen aan de diffuserende hydroxylradica, die nauw correleert met het gemiddelde oplosmiddel toegankelijk oppervlak6,7. Alle standaard aminozuren, behalve glycine, zijn waargenomen zoals gelabeld door deze zeer reactieve hydroxylradicalen in FPOP-experimenten, zij het bij zeer uiteenlopende opbrengsten; in de praktijk worden Ser, Thr, Asn en Ala zelden gezien als geoxideerd in de meeste monsters, behalve onder hoge radicale doses en geïdentificeerd door zorgvuldige en gevoelige gerichte ETD fragmentatie8,9. Na oxidatie worden monsters gedoofd om waterstofperoxide en secundaire oxidanten (superoxide, singlet oxygen, peptidylhydrperoxiden, enz.) te verwijderen De gedoofde monsters worden vervolgens proteolytisch verteerd om mengsels van geoxideerde peptiden te genereren, waarbij de structurele informatie wordt bevroren als een chemische "momentopname" in de patronen van oxidatieproducten van de verschillende peptiden(figuur 1). Vloeibare chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC-MS) wordt gebruikt om de hoeveelheid oxidatie van aminozuren in een bepaald proteolytisch peptide te meten op basis van de relatieve intensiteiten van de geoxideerde en niet-geoxideerde versies van dat peptide. Door deze oxidatieve voetafdruk van hetzelfde eiwit te vergelijken die onder verschillende conformatieomstandigheden wordt verkregen (bijvoorbeeld ligand-gebonden versus ligand-vrij), kunnen verschillen in de mate van oxidatie van een bepaald eiwitgebied direct worden gecorreleerd met verschillen in het oplosmiddel-toegankelijke oppervlakte van dat gebied6,7. De mogelijkheid om eiwittopografische informatie te verstrekken maakt FPOP een aantrekkelijke technologie voor de hogere orde structuur bepaling van eiwitten, ook in eiwit therapeutische ontdekking en ontwikkeling10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van FPOP. Het oppervlak van het eiwit wordt covalent gewijzigd door zeer reactieve hydroxylradicalen. De hydroxylradicalen zullen reageren met aminozuurzijketens van het eiwit in een tempo dat sterk wordt beïnvloed door de oplosmiddel toegankelijkheid van de zijketen. Topografische veranderingen (bijvoorbeeld als gevolg van de binding van een ligand zoals hierboven afgebeeld) zullen aminozuren in het interactiegebied beschermen tegen reageren met hydroxylradicalen, wat resulteert in een afname van de intensiteit van gemodificeerd peptide in het LC-MS-signaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Verschillende bestanddelen die aanwezig zijn in de FPOP-oplossing (bijvoorbeeld liganden, excipiënten, buffers) hebben verschillende opruimingsactiviteit naar de hydroxylradicalen gegenereerd op de laserfotolyse van waterstofperoxide3. Op dezelfde manier kan een kleine verandering in peroxideconcentratie, laserfluence en buffersamenstelling de effectieve radicale dosis veranderen, waardoor de reproductie van FPOP-gegevens uitdagend is voor de monsters en tussen verschillende laboratoria. Daarom is het belangrijk om de hydroxylradicale dosis die beschikbaar is om te reageren met eiwitten in elk monster te kunnen vergelijken met een van de verschillende beschikbare hydroxylradicale dosimeters12,13,14,15,16. Hydroxyl radicale dosimeters handelen door te concurreren met de analyt (en met alle aaseters in oplossing) voor de pool van hydroxyl radicalen; de effectieve dosis hydroxylradicalen wordt gemeten door de hoeveelheid oxidatie van de dosimeter te meten. Merk op dat "effectieve hydroxyl radicale dosis" is een functie van zowel de initiële concentratie van hydroxyl radicaal gegenereerd en de halftijds van de radicale. Deze twee parameters zijn gedeeltelijk afhankelijk van elkaar, waardoor de theoretische kinetische modellering enigszins complex is (figuur 2). Twee monsters zouden een wild verschillende initiële halflevenshelft kunnen hebben, terwijl ze nog steeds dezelfde effectieve radicale dosis behouden door de initiële concentratie hydroxylradicalen te veranderen; ze zullen nog steeds identieke voetafdrukken genereren17. Adenine13 en Tris12 zijn handige hydroxyl radicale dosimeters omdat hun niveau van oxidatie kan worden gemeten door UV-spectroscopie in real-time, waardoor onderzoekers snel te identificeren wanneer er een probleem is met effectieve hydroxyl radicale dosis en om hun probleem op te lossen. Om dit probleem op te lossen, is een inline dosimeter die zich direct na de plaats van bestraling in het stroomsysteem bevindt die het signaal van adenine-absorptieveranderingen in real-time kan controleren, belangrijk. Dit helpt bij het uitvoeren van FPOP experimenten in buffers of een andere excipiënt met zeer uiteenlopende niveaus van hydroxyl radicale opruimcapaciteit17. Deze radicale dosering compensatie kan worden uitgevoerd in real-time, waardoor statistisch niet te onderscheiden resultaten voor dezelfde conformer door het aanpassen van de effectieve radicale dosis.
In dit protocol hebben we gedetailleerde procedures voor het uitvoeren van een typisch FPOP-experiment met radicale doseringscompensatie met adenine als interne optische radicale dosimeter. Met deze methode kunnen onderzoekers voetafdrukken vergelijken tussen FPOP-omstandigheden die verschillende opruimcapaciteit hebben door compensatie in real-time uit te voeren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> Figuur 2: Kinetische simulatie van op dosimetrie gebaseerde compensatie. 1 mM adenine dosimeter respons wordt gemeten in 5 μM lysozyme analyt met een 1 mM initiële hydroxyl radicale concentratie (▪OH t1/2=53 ns), en ingesteld als een doel dosimeter respons (zwart). Na de toevoeging van 1 mM van de aasgier excipiënt histidine, de dosimeter respons (blauw) afneemt samen met de hoeveelheid eiwit oxidatie op een evenredige manier (cyaan). De halftijd van de hydroxylradicalen neemt ook af (▪OH t1/2=39 ns). Wanneer de hoeveelheid hydroxylradical gegenereerde wordt verhoogd om een gelijkwaardige opbrengst van geoxideerde dosimeter in het monster te geven met 1 mM histidine-aasgier zoals bereikt met 1 mM hydroxylradical bij afwezigheid van aaseters (rood), wordt de hoeveelheid eiwitoxidatie die op dezelfde manier optreedt identiek (magenta), terwijl de hydroxylradicale halfwaardetijd nog verder afneemt (▪OH t1/2=29 ns). Aangepast met toestemming van Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>Adenine</td><td>Acros Organics</td><td>147440250</td><td>Oplosbaar in water tot 3,5 mM</td></tr><tr><td>Aperture</td><td>Edmund Optics</td><td>39-905</td><td>1000 &mu;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td></tr><tr><td>Aperture holder</td><td>Edmund Optics</td><td>53-287</td><td>25,8 mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td></tr><tr><td>Catalse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-40</td><td>Catalase uit runderlever, gevriesdroogd poeder, &ge;10.000 eenheden/mg eiwit</td></tr><tr><td>COMPex Pro laser</td><td>Coherent</td><td>1113836</td><td>COMPexPRO 102, F-Vversie, KrF laser, geen XeCl</td></tr><tr><td>Dithiotheitol (DTT)</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td>DTT, moleculaire kwaliteit (DL-Dithiothreitol)</td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Geautomatiseerde fractiecollector</td></tr><tr><td>Fused silica capillay</td><td>Molex</td><td>1068150023</td><td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &micro;m, Outer Diameter 375 &micro;m, TSP100375</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Acros Organics</td><td>119951000</td><td>L(+)-Glutamine, 99%</td></tr><tr><td>Holder for lens</td><td>Edmund Optics</td><td>03-668</td><td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>Waterstofperoxide, 30% (gecertificeerd ACS), Fisher Chemical</td></tr><tr><td>LC-MS/MS system</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>Dionex Ultimate 3000 gekoppeld aan Orbitap Fusion Tribrid massaspectrometer</td></tr><tr><td>Mas spec grade Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td></tr><tr><td>Mass spec grade formic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td>Mierenzuur, 99,0+%, Optima&trade; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td></tr><tr><td>Mass spec grade water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td></tr><tr><td>MES buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0164</td><td>MES hemisodiumzout</td></tr><tr><td>Methionine amide</td><td>Bachem</td><td>4000594.0005</td><td>H-met-NH2.HCl</td></tr><tr><td>Micro V clamp</td><td>Thor Labs</td><td>VK250</td><td>Micro V-klem met roestvrijstalen messen</td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Edmund Optics</td><td>68-638</td><td>50 mm reis gemotoriseerde stage systeem met handmatige bediening</td></tr><tr><td>Nano C18 colum</td><td>Thermo Scientific</td><td>164534</td><td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC-kolommen</td></tr><tr><td>Optical bench</td><td>Edmund Optics</td><td>56-935</td><td>18" x 18" breadboard</td></tr><tr><td>Pioneer FPOP Module System</td><td>GenNext Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td></tr><tr><td>Post holder</td><td>Edmund Optics</td><td>58-979</td><td>3" lengte, &frac14;-20 draad, Post Holder</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP331-500</td><td>Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat (kleurloze tot witte kristallen), Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-500</td><td>Natriumfosfaat monobasisch monohydraat (kleurloze tot witte kristallen), Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton</td><td>81065</td><td>100 &micro;L, Model 1710 RN SYR, Kleine verwijderbare NDL, 22s ga, 2 in, puntstijl 3</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>KD Scientific</td><td>788101</td><td>Legato&nbsp;101 spuitpomp</td></tr><tr><td>Trap C18 column</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Thermo Scientific&nbsp;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC-kolommen</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethaan</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td></tr><tr><td>UV plano convex lens</td><td>Edmund Optics</td><td>84-285</td><td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td></tr></tbody></table>

real-time compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) is een op massaspectrometrie gebaseerde structurele biologietechniek die het oplosmiddel toegankelijke oppervlakte van eiwitten sondes. Deze techniek is gebaseerd op de reactie van aminozuurzijketens met hydroxylradicalen die zich vrij verspreiden in oplossing. FPOP genereert deze radicalen in situ door laser fotolyse van waterstofperoxide, het creëren van een uitbarsting van hydroxyl radicalen die is uitgeput in de orde van een microseconde. Wanneer deze hydroxylradicalen reageren met een oplosmiddel-toegankelijke aminozuurzijketen, vertonen de reactieproducten een massaverschuiving die kan worden gemeten en gekwantificeerd door massaspectrometrie. Aangezien de reactiesnelheid van een aminozuur gedeeltelijk afhangt van het gemiddelde toegankelijke oppervlak van dat aminozuur, kunnen gemeten veranderingen in de hoeveelheid oxidatie van een bepaald eiwitgebied direct worden gecorreleerd met veranderingen in de oplosmiddeltoegankelijkheid van dat gebied tussen verschillende conformaties (bijvoorbeeld ligand gebonden versus ligand-vrij, monomeer vs. aggregaat, enz.) FPOP is toegepast in een aantal problemen in de biologie, waaronder eiwit-eiwit interacties, eiwit conformatie veranderingen, en eiwit-ligand binding. Aangezien de beschikbare concentratie hydroxylradicalen varieert op basis van vele experimentele omstandigheden in het FPOP-experiment, is het belangrijk om de effectieve radicale dosis te controleren waaraan de eiwitanalyt wordt blootgesteld. Deze monitoring wordt efficiënt bereikt door het opnemen van een inline dosimeter om het signaal van de FPOP reactie te meten, met laser fluence aangepast in real-time om de gewenste hoeveelheid oxidatie te bereiken. Met deze compensatie kunnen veranderingen in eiwittopografie die conformatieveranderingen, ligandbindende oppervlakken en/of eiwit-eiwitinteractie-interfaces weerspiegelen, worden bepaald in heterogene monsters met relatief lage monsterhoeveelheden.

Vergelijking van de zware keten peptide voetafdruk van de adalimumab biosimilar in fosfaat buffer en bij verhitting bij 55 °C voor 1 uur tonen interessante resultaten. Student t-test wordt gebruikt voor de identificatie van peptiden die aanzienlijk worden veranderd in deze twee voorwaarden (p ≤ 0,05). De peptiden 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 en 414-420 tonen aanzienlijke bescherming tegen oplosmiddel wanneer het eiwit wordt verwarmd tot aggregaten(figuur 5)<sup class="xr...

Snelle fotochemische oxidatie van eiwitten is een opkomende techniek voor de structurele karakterisering van eiwitten. Verschillende oplosmiddel additieven en liganden hebben verschillende hydroxyl radicale opruimeigenschappen. Om de eiwitstructuur in verschillende omstandigheden te vergelijken, is real-time compensatie van hydroxylradicalen die in de reactie worden gegenereerd nodig om reactieomstandigheden te normaliseren.

Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

De methode vergemakkelijkt het meten van eiwitbevestiging en eiwitinteracties. De buffersamenstelling, monsterzuiverheid en eiwitconcentratievereisten zijn flexibel waardoor de methode uitdagende structurele problemen kan aanpakken. Deze techniek maakt een compressie van monsters in een breed scala van verschillende buffersystemen.Met behulp van onze dosimetriemethode kunnen onderzoekers in realtime controleren hoe goed hun etiketteringsreacties werken. Een toepassing van deze technologie is in de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat het onderzoekers in staat stelt om op grote schaal verschillende formuleringen van geneesmiddelen te testen en hoe ze de eiwitstructuur beïnvloeden. Ter voorbereiding van de FPOP optische bank.Zet eerst de laser aan en zet de laser op externe trekker, constante energie en geen gasvervanging. Wanneer de laser heeft opgewarmd zet de laser energie per puls tussen 80 tot 120 milligram per puls en gebruik een butaan fakkel om zachtjes branden de polyimide codering van de capillaire op de plek waar de inline dosimeter zal het absorberend signaal te lezen op 265 nanometer na blootstelling aan laser. Gebruik een lintvrij doekje en methanol om het puin voorzichtig van de capillaire af te vegen en de gereinigde capillaire door het bundelpad van de laser en in de inline dosimeter te plaatsen.Druk op de hendel aan de bovenkant van de inline dosimeter om het scharnier te openen en de magnetische houders te verwijderen. Plaats de capillaire in de machinegroef van de inline dosimeter met behulp van de magnetische houders om de capillaire op zijn plaats te houden en sluit het dosimeterscharnier over de capillaire druk op het scharnier totdat de hendel op zijn plaats wordt vergrendeld. Klik op de startflitsknop in de dosimetriesoftware om de excimerlaser af te vuren en stel de vooraf ingestelde herhalingssnelheid in tussen 10 en 20 Hertz in de dosimetriesoftware met de laservlaag beweegt het gemotoriseerde stadium door zijn bewegingsbereik, zodat de bundel gecentreerd blijft op het diafragma en dat het silhouet van de capillaire overal kan worden waargenomen.Spoel vervolgens de capillaire met water op 20 microliters per minuut gedurende ten minste een minuut en klik op startgegevens plus auto nul in de dosimetersoftware tot nul van de dosimeter naar het water voordat u met de gegevensverzameling begint. Voor het uitvoeren van een FPOP experiment voeg twee microliters van waterstofperoxide tot 18 microliters van FPOP oplossing en gebruik een pipet om voorzichtig mengen van de oplossing snel verzamelen van de oplossing aan de onderkant van de buis door centrifugatie en onmiddellijk gebruik maken van een gasdichte spuit om de oplossing te laden in een spuitpomp. Klik op startpomp en start gegevens in de dosimeter software om de stroom op de spuitpomp te starten op de juiste stroomsnelheid en gebruik de inline dosimeter om de real-time adenine lezing te controleren totdat het absorberende signaal op 265 nanometer stabiliseert het verzamelen van het monster in een afvalcontainer.Om te beginnen met het afvuren van de laser op de vooraf ingestelde herhalingssnelheid eindenergie klik op de start flitser knop in de dosimeter software en gebruik maken van de inline dosimeter om de real-time adenine lezing te controleren. Het verschil in de absorptie op 265 nanometer met de laser uit en de laser op zal de delta absorbents op 265 nanometer lezing. Om ervoor te zorgen dat vergelijkbare hydroxylradicalen beschikbaar zijn om te reageren met eiwitten in verschillende monsters.Vergelijk de deltaabsorberen bij 265 nanometer met de inline dosimeter met de wens delta absorptiets bij 265 nanometer meting verkregen uit eerdere experimenten of controles. Als de meting zich op het gewenste niveau bevindt, verzamelt u het monster onmiddellijk na laser of straling in de blusbuffer. Ter compensatie van de effectieve radicale dosis om de absorbantie metingen egaliseren veranderen de waterstofperoxide concentratie, verander de laser energie per puls of verander het brandpuntsvlak van de focus lens om de laser fluence te verhogen.Om een meer dan 10 milli absorptie-eenheid verandering in de delta absorbents lezen remake het monster met min of meer waterstofperoxide en herhaal het monster zoals aangetoond. Om een kleine verandering in de absorptiemeting in real time te maken, gebruikt u de 50 millimeter gemotoriseerde fase om de positie van de scherpstellens aan te passen om het brandpuntsvlak van de invallende straal aan te passen. Om de effectieve hoeveelheid hydroxylraderen in het monster te meten nadat laserstraling de adenine delta-absorptiests op 265 nanometer in real time monitort met een inline UV-capillaire detector met behulp van de gemotoriseerde fase om de lenspositie aan te passen totdat de deltaabsorberen bij 265 nanometer lezen gelijk is aan de gewenste meting.Uit een vergelijking van de zware keten peptide-voetafdruk van de adilumabbiosimilar in fosfaatbuffer en na een uur verwarmen bij 55 graden Celsius blijkt dat de aangegeven peptidegebieden significante bescherming tegen oplosmiddelen aantonen wanneer het eiwit wordt verwarmd tot aggregaat. Het gebruik van een inline dosimeter in real time om het verschil in adenine absorptiets voor en na laser of straling te monitoren geeft aan dat een vergelijkbare verandering in het adenine absorptieniveau wordt waargenomen in de MES-buffer in vergelijking met fosfaatbuffer. Terwijl de gemiddelde oxidatie van de peptiden lager is in aanwezigheid van MES-buffer in vergelijking met fosfaatbuffer.Echter, als de laser fluence wordt verhoogd tot een gelijke adenine dosimetrie respons hebben de gemiddelde peptide oxidatie waarden zijn bijna hetzelfde na FPOP en MES buffer en fosfaat buffer. Als de dosimetrie lezing wordt beïnvloed door de laser fluence peroxide concentratie evenals de radicale aasgier. Zorg ervoor dat de dosimetrierespons tussen de steekproefenquête dicht bij elkaar staat.Site gerichte mutagenesis wordt vaak gebruikt om locaties beschermd in FPOP sonde. Dit stelt onderzoekers in staat om te bepalen of veranderingen te wijten zijn aan Alistair. Deze techniek vergemakkelijkt de vergelijking van eiwitten in verschillende buffers of formuleringen waardoor onderzoekers het effect van verschillende additieven op eiwitbevestiging kunnen bepalen.

enabling-real-time-compensation-fast-photochemical-oxidations

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the time-resolved Förster resonance energy transfer or TR-FRET assay to determine endogenous protein phosphorylation with the help of donor and acceptor fluorophores tagged on antibodies specific to a test protein. This technique is designed to measure the phosphorylation of test proteins in cell lysates.

Time-Resolved Forster Resonance Energy Transfer for Monitoring Protein Phosphorylation in Cells

This video demonstrates the technique of fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) to study protein homo-oligomerization. Fluorescently-labeled proteins in a sample are dimerized using an agent when studying protein oligomerization using FFS. Using a confocal microscope, as the proteins move in and out of the small observation volume, the analysis of the fluctuations in the brightness of the fluorescent molecules is performed to determine the oligomeric state of the proteins.

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Homo-Oligomerization

Belangrijke stappen van eiwitfunctie, met name conformationele veranderingen in de ruggengraat en protonoverdrachtreacties, vinden vaak plaats op de microseconden tot milliseconden tijdschaal. Deze dynamische processen kunnen worden bestudeerd door middel van tijdopgeloste step-scan Fourier-transform infraroodspectroscopie, met name voor eiwitten waarvan de functie wordt geactiveerd door licht.

Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Dit protocol beschrijft een fluorescentie schommelingen spectroscopie gebaseerde aanpak om te onderzoeken van interacties tussen eiwitten bemiddelen cel interacties, d.w.z. eiwitten gelokaliseerd in cel kruispunten, rechtstreeks in levende cellen. Wij bieden gedetailleerde richtsnoeren op kalibreren van het instrument, data-acquisitie en analysemethoden, inclusief correcties mogelijk artefact bronnen.

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

Hier karakteriseren we eiwitstructuur en interactiesites in levende cellen met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell fast fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Dit protocol presenteert een methode om inline radicale dosimetrie en een plasma lichtbron te gebruiken om flash oxidatie eiwit footprinting uit te voeren. Deze methode vervangt de gevaarlijke UV-laser om de reproduceerbaarheid van snelle fotochemische oxidatie van eiwitstudies te vereenvoudigen en te verbeteren.

Laservrije hydroxyl radicale eiwitvoetafdruk om structurele analyse van eiwitten in hogere orde uit te voeren

Een nieuw statisch platform wordt gebruikt om eiwitstructuur en interactielocaties in de inheemse celomgeving te karakteriseren met behulp van een eiwitvoetafdruktechniek genaamd in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (IC-FPOP).

Platform Incubator met beweegbare XY Stage: een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Eiwitthioloxidatie heeft significante implicaties onder normale fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. We beschrijven de details van een kwantitatieve redox proteomics-methode, die gebruik maakt van harsondersteunde vangst, isobare etikettering en massaspectrometrie, waardoor locatiespecifieke identificatie en kwantificering van reversibel geoxideerde cysteïneresiduen van eiwitten mogelijk wordt.

Harsondersteunde vangst in combinatie met isobare tandemmassalabellabeling voor multiplexed kwantificering van eiwitthodoxe oxidatie

Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.

Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Ontdek FPOP voor eiwitkarakterisatie met real-time dosimetrie om eiwitinteracties en conformaties te meten. Deze methode biedt flexibiliteit in buffersystemen en verbetert de betrouwbaarheid van labelreacties voor structurele biologie en farmaceutisch onderzoek.

Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie (Video) | JoVE Journal

Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

Meer video's verkennen