Real-Time Compensatie mogelijk maken in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van veranderingen in eiwittopografie

De methode vergemakkelijkt het meten van eiwitbevestiging en eiwitinteracties. De buffersamenstelling, monsterzuiverheid en eiwitconcentratievereisten zijn flexibel waardoor de methode uitdagende structurele problemen kan aanpakken. Deze techniek maakt een compressie van monsters in een breed scala van verschillende buffersystemen.

Met behulp van onze dosimetriemethode kunnen onderzoekers in realtime controleren hoe goed hun etiketteringsreacties werken. Een toepassing van deze technologie is in de ontwikkeling van geneesmiddelen, omdat het onderzoekers in staat stelt om op grote schaal verschillende formuleringen van geneesmiddelen te testen en hoe ze de eiwitstructuur beïnvloeden. Ter voorbereiding van de FPOP optische bank.

Zet eerst de laser aan en zet de laser op externe trekker, constante energie en geen gasvervanging. Wanneer de laser heeft opgewarmd zet de laser energie per puls tussen 80 tot 120 milligram per puls en gebruik een butaan fakkel om zachtjes branden de polyimide codering van de capillaire op de plek waar de inline dosimeter zal het absorberend signaal te lezen op 265 nanometer na blootstelling aan laser. Gebruik een lintvrij doekje en methanol om het puin voorzichtig van de capillaire af te vegen en de gereinigde capillaire door het bundelpad van de laser en in de inline dosimeter te plaatsen.

Druk op de hendel aan de bovenkant van de inline dosimeter om het scharnier te openen en de magnetische houders te verwijderen. Plaats de capillaire in de machinegroef van de inline dosimeter met behulp van de magnetische houders om de capillaire op zijn plaats te houden en sluit het dosimeterscharnier over de capillaire druk op het scharnier totdat de hendel op zijn plaats wordt vergrendeld. Klik op de startflitsknop in de dosimetriesoftware om de excimerlaser af te vuren en stel de vooraf ingestelde herhalingssnelheid in tussen 10 en 20 Hertz in de dosimetriesoftware met de laservlaag beweegt het gemotoriseerde stadium door zijn bewegingsbereik, zodat de bundel gecentreerd blijft op het diafragma en dat het silhouet van de capillaire overal kan worden waargenomen.

Spoel vervolgens de capillaire met water op 20 microliters per minuut gedurende ten minste een minuut en klik op startgegevens plus auto nul in de dosimetersoftware tot nul van de dosimeter naar het water voordat u met de gegevensverzameling begint. Voor het uitvoeren van een FPOP experiment voeg twee microliters van waterstofperoxide tot 18 microliters van FPOP oplossing en gebruik een pipet om voorzichtig mengen van de oplossing snel verzamelen van de oplossing aan de onderkant van de buis door centrifugatie en onmiddellijk gebruik maken van een gasdichte spuit om de oplossing te laden in een spuitpomp. Klik op startpomp en start gegevens in de dosimeter software om de stroom op de spuitpomp te starten op de juiste stroomsnelheid en gebruik de inline dosimeter om de real-time adenine lezing te controleren totdat het absorberende signaal op 265 nanometer stabiliseert het verzamelen van het monster in een afvalcontainer.

Om te beginnen met het afvuren van de laser op de vooraf ingestelde herhalingssnelheid eindenergie klik op de start flitser knop in de dosimeter software en gebruik maken van de inline dosimeter om de real-time adenine lezing te controleren. Het verschil in de absorptie op 265 nanometer met de laser uit en de laser op zal de delta absorbents op 265 nanometer lezing. Om ervoor te zorgen dat vergelijkbare hydroxylradicalen beschikbaar zijn om te reageren met eiwitten in verschillende monsters.

Vergelijk de deltaabsorberen bij 265 nanometer met de inline dosimeter met de wens delta absorptiets bij 265 nanometer meting verkregen uit eerdere experimenten of controles. Als de meting zich op het gewenste niveau bevindt, verzamelt u het monster onmiddellijk na laser of straling in de blusbuffer. Ter compensatie van de effectieve radicale dosis om de absorbantie metingen egaliseren veranderen de waterstofperoxide concentratie, verander de laser energie per puls of verander het brandpuntsvlak van de focus lens om de laser fluence te verhogen.

Om een meer dan 10 milli absorptie-eenheid verandering in de delta absorbents lezen remake het monster met min of meer waterstofperoxide en herhaal het monster zoals aangetoond. Om een kleine verandering in de absorptiemeting in real time te maken, gebruikt u de 50 millimeter gemotoriseerde fase om de positie van de scherpstellens aan te passen om het brandpuntsvlak van de invallende straal aan te passen. Om de effectieve hoeveelheid hydroxylraderen in het monster te meten nadat laserstraling de adenine delta-absorptiests op 265 nanometer in real time monitort met een inline UV-capillaire detector met behulp van de gemotoriseerde fase om de lenspositie aan te passen totdat de deltaabsorberen bij 265 nanometer lezen gelijk is aan de gewenste meting.

Uit een vergelijking van de zware keten peptide-voetafdruk van de adilumabbiosimilar in fosfaatbuffer en na een uur verwarmen bij 55 graden Celsius blijkt dat de aangegeven peptidegebieden significante bescherming tegen oplosmiddelen aantonen wanneer het eiwit wordt verwarmd tot aggregaat. Het gebruik van een inline dosimeter in real time om het verschil in adenine absorptiets voor en na laser of straling te monitoren geeft aan dat een vergelijkbare verandering in het adenine absorptieniveau wordt waargenomen in de MES-buffer in vergelijking met fosfaatbuffer. Terwijl de gemiddelde oxidatie van de peptiden lager is in aanwezigheid van MES-buffer in vergelijking met fosfaatbuffer.

Echter, als de laser fluence wordt verhoogd tot een gelijke adenine dosimetrie respons hebben de gemiddelde peptide oxidatie waarden zijn bijna hetzelfde na FPOP en MES buffer en fosfaat buffer. Als de dosimetrie lezing wordt beïnvloed door de laser fluence peroxide concentratie evenals de radicale aasgier. Zorg ervoor dat de dosimetrierespons tussen de steekproefenquête dicht bij elkaar staat.

Site gerichte mutagenesis wordt vaak gebruikt om locaties beschermd in FPOP sonde. Dit stelt onderzoekers in staat om te bepalen of veranderingen te wijten zijn aan Alistair. Deze techniek vergemakkelijkt de vergelijking van eiwitten in verschillende buffers of formuleringen waardoor onderzoekers het effect van verschillende additieven op eiwitbevestiging kunnen bepalen.