Name: Silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Leer optische stimulatie met silicium nanodraden voor intra- en intercellulaire elektrische koppeling in cardiomyocyten. Deze methode biedt hoge ruimtelijke resolutie voor bio-elektronisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door het Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Om ervoor te zorgen dat de ethische normen worden nageleefd, werden alle dierprocedures met betrekking tot het isoleren van cardiomyocyten uit knaagdierenharten voor het eerst goedgekeurd door de University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Bovendien werden alle dierproeven uitgevoerd in volledige overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Chicago IACUC.
1. Bereiding van cel-SiNWs hybriden
<ol><li>Isoleer primaire cardiomyocyten (CMs) met behulp van een commerciële kit volgens de richtlijnen van de fabrikant.</li>
	<li>Bereid volledige DMEM voor op primaire celisolatie aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 1% L-glutamine.</li>
	<li>Om myofibroblast (MF's) te isoleren van de MFS-CMs suspensie, pre-plate de geïsoleerde cellen op een weefselkweekschotel (cellen geïsoleerd van 2 harten vanaf stap 1.1. per 100 mm schotel) voor 1 uur. Aangezien CMs een fibronectine of collageen behandeld oppervlak nodig hebben om zich aan te hechten, zullen alleen MF's zich hechten aan het weefselcultuuroppervlak.</li>
	<li>Aspirate de verrijkte CMs cel suspensie. Deze CMs kunnen worden gebruikt voor hetero-cellulaire koppeling experimenten zoals beschreven in sectie 3. Spoel de MF's met DMEM om eventuele resterende CMs uit de MF's schotel te elimineren.</li>
	<li>Voeg verse cultuur medium aan MF's en laat ze vermenigvuldigen totdat ze ~ 80% confluent (2-4 dagen). Verander het medium om de andere dag.</li>
	<li>Wanneer de cellen klaar zijn (80% confluent), bereid SiNWs voor op de hybridisatiestap hieronder (stap 1.7). LET OP: Hiervoor kunnen veel soorten SiNW's worden gebruikt. In dit experiment werden SiNW's gebruikt die werden gekweekt door chemische dampdepositie (CVD) met een core-shell p-i-n-junction configuratie zoals eerder beschreven16. Tijdens de CVD-groei worden de SiNW's geteeld op een siliciumwafersubstraat en worden ze uiteindelijk bewaard als siliciumchips bedekt met SiNWs.</li>
	<li>Snijd een 3 mm x 3 mm chip uit een wafer met CVD gekweekte SiNWs met behulp van een diamant scribe. Gebruik scherpe tangen om de wafer te hanteren en het oppervlak te minimaliseren dat wordt aangeraakt met de tangen, omdat dit de SiNWs kan breken.</li>
	<li>Steriliseer de chip door het te spoelen met 70% ethanol en laat de ethanol te drogen voor 30 min onder UV-licht in een bioveiligheid laminaire stroom kap.</li>
	<li>Breng de chip in een steriele microcentrifuge buis en spoel overtollige ethanol met behulp van complete cultuur media.</li>
	<li>Voeg 1 mL cultuur media en sonicate de chip in sonicatie bad voor 1-10 min. De media moeten worden troebel als SiNWs worden vrijgegeven in de media. OPMERKING: Sonicatietijd en -vermogen moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende sonicators of verschillende cellen, omdat kortere duur en lagere bevoegdheden langere SiNW's zullen opleveren.</li>
	<li>Voeg de SiNWs suspensie toe aan 5 mL cultuurmedia en zet deze op de 100 mm weefselkweekschaal met MF's. Laat de SiNWs 4 uur internaliseren en spoel de overtollige SiNWs 5x af met media. Laat gedeeltelijk geïnternaliseerde SiNWs de internalisatie voltooien door ze nog 1 uur te laten zitten voor gebruik. OPMERKING: Verschillende celtypen kunnen verschillende SiNWs-concentratie- en/of internalisatietijden nodig hebben.</li>
	<li>Bereid collageen coating oplossing door het verdunnen van collageen voorraad oplossing (3 mg/mL) met steriele 20 mM azijnzuur bij een verhouding van 1:50. Voeg 0,5 mL coatingoplossing toe aan een glazen bodemschotel van 35 mm en laat hem 1 uur in 37 °C zitten. Verwijder de oplossing en spoel de schotel af met steriele PBS.</li>
	<li>Oogst de cel-SiNWs hybriden door de cellen te behandelen met 3 mL trypsine gedurende 2 min bij 37 °C. Voeg 10 mL cultuurmedia toe en spoel de hybriden krachtig af door pipetten. Centrifugeer de cellen voorzichtig op 200 x g gedurende 5 minuten om te voorkomen dat de cellen beschadigen met de geïnternaliseerde SiNWs. Verwijder overtollige media, schort cellen op met 1 mL-media en zaai ze op de met collageen behandelde glazen bodemschaal. OPMERKING: De hybriden kunnen alleen worden gezaaid, om intracellulaire of intercellulaire koppeling te onderzoeken of met CMs om hetero-cellulaire koppeling in vitro te onderzoeken.</li>
	<li>Voer een laatste verificatie uit van de sinw-internalisatie door de cytosol (calcein-AM, 4 μM) en membraan (membraanmarkering, 2 μM) gedurende 30 minuten bij 37 °C te labelen en de cel te immeren met behulp van confocale microscopie. Omdat SiNWs sterk reflecterend zijn, kan gereflecteerd licht worden gebruikt in plaats van fluorescentie om ze te visualiseren.</li>
</ol>2. Bereiding van cellen voor intra- en intercellulaire onderzoeken
<ol><li>Bereid collageen coating oplossing zoals in 1.12</li>
	<li>Voor intracellulaire elektrische stimulatie, kweekhybriden met lage zaaidichtheid. Gebruik een standaard hemocytometer om cellen te tellen van sectie 1.11. en zaad 50.000 cellen op een 35 mm glazen bodem schotel in cultuur media. Voor intercellulaire onderzoeken, gebruik maken van hogere celdichtheden (500.000 cellen per schotel). Voor intercellulaire koppeling tussen CMs en MF's, co-cultuur van de hybriden met vers geïsoleerde CMs.</li>
	<li>Laat cellen 's nachts hechten voordat u optische stimulatie-experimenten uitvoert. Voor intercellulair onderzoek moet de cellen 48 uur bij 37 °C intercellulaire hiaatverbindingen uitdrukken voordat het experiment wordt uitgevoerd.</li>
	<li>Bereid calciumgevoelige kleurstofvoorraadoplossing voor (kan in -20 °C worden bewaard) door 50 μL DMSO toe te voegen aan 50 μg Fluo-4 AM. Bereid kleuringsoplossing voor door 1 μL kleurstof in 1 mL DMEM te verdunnen.</li>
	<li>Aspirate de cultuur medium uit cellen en voeg 1 mL van kleuring oplossing. Laat kleurstof 20-30 minuten in cellen internaliseren bij 37 °C. Spoel de kleurstof aan en spoel twee maal met steriele PBS.</li>
	<li>Voeg ten slotte 1 mL voorverwarmde fenolrode vrije DMEM Media toe en laat de intracellulaire Fluo-4 gedurende 30 minuten ontsterificeren in 37 °C.</li>
	<li>Breng cellen naar de microscoop voor beeldvorming en stimulatie.</li>
</ol>3. Optische beeldvorming en stimulatie
<ol><li>Verwarm een bevochtigde microincubator voor tot 37 °C en lucht-CO2 mengsel (95:5).</li>
	<li>Gebruik een microscoop met een collimated laserlijn gekoppeld aan het lichtpad voor calcium beeldvorming en optische stimulatie. OPMERKING: Een scanning confocale microscoop is de meest eenvoudige optie vanwege de puntstimulatie mogelijkheden. Echter, deze procedure kan worden gedaan met behulp van een standaard florescentie microscoop door het koppelen van een collimated laserstraal in de oneindigheid ruimte van het licht pad met behulp van een bundel splitter. Elke microscoop doelstelling is zo ontworpen dat een collimated laser doorgegeven zal worden gericht op een diffractie beperkte laser plek op het brandpuntsvlak. De lasergolflengte moet dicht bij het excitatielicht zijn, dus het zal worden gereflecteerd door de dichroic spiegel en doorgegeven door het excitatiefilter.</li>
	<li>Visualiseer de SiNWs en bepaal de stimulatiesite met behulp van brightfield microscopie, uitgezonden licht of reflecterend licht. Vervolgens u het lichtpad opnieuw configureren naar de fluorescentiemodus, met behoud van het stimulatiepunt op de vooraf gedefinieerde locatie van de SiNW.</li>
	<li>Valideer het optimale stimulatievermogen en de pulslengte voor elk SiNW-formaat en celtype, om fotothermale schade aan gestimuleerde cellen te minimaliseren. Voer voor een typisch stimulatieprotocol een basisregistratie van 2-10 s uit van de intracellulaire calciumactiviteit. Breng vervolgens een enkele laserpuls van 1-10 mW vermogen en 1-10 ms duur (wat overeenkomt met 30-300 kW/mm2)om de SiNW te stimuleren, en neem de resulterende calciumgolf voor nog eens 2-10 s. OPMERKING: Het is essentieel om de optische kracht en pulslengte voor elke SiNW-grootte en cellen te optimaliseren. Dit is nodig om fotothermale schade aan de gestimuleerde cellen te minimaliseren.</li>
	<li>Breng de opgenomen films van de optische stimulatie, indien nodig, voor verdere analyse.</li>
</ol>4. Videoverwerking
<ol><li>Visualiseer veranderingen in fluorescentie fluorescentie met behulp van de "dF over F" macro17 beschikbaar voor ImageJ18, die de verandering in fluorescentie telt voor elke pixel berekent, en normaliseert door de gemiddelde waarde van de rustbasislijn. Converteer de uitvoer (floating point format) naar 8 bits voor verdere verwerking.</li>
	<li>Verwerk de dF/F-film verder met behulp van deselectievemediane filter " Verwijderen " die beschikbaar is in ImageJ. Definieer parameters om pixels te verwijderen waarvan de waarde meer dan 10 boven de mediaanwaarde in een straal van 2 pixels ligt en vervang die pixelwaarde door de mediaan.</li>
	<li>Bereken de optische stroom in elk frame via het Lucas-Kanade algoritme, zoals geïmplementeerd in de Matlab Computer Vision toolbox. De uitvoer van deze functie was een vectorveld met de x- en y-componenten van de optische stroom op elk punt in elke afbeelding (code is beschikbaar in aanvullend bestand 1). OPMERKING: De gemiddelde optische stroom binnen een cel, <ν>, komt overeen met de ontwikkeling van calciumflux binnen een cel. Het differentieel van de optische stroom, Δ<ν> biedt het tijdstip waarop calciumsignalering werd geactiveerd, door te bepalen waar het signaal werd gemaximaliseerd. Bovendien is de omvang van Δ<ν> maximaal gecorreleerd aan de snelheid waarmee het calciumgolffront door de cel vordert.</li>
	<li>Bereken de intercellulaire snelheid van calciumtransmissie volgens de volgende vergelijking. vCa2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ), waar tmax, j en t max, ik zijn de tijden van activering voor cellen j en i, respectievelijk, en r ij is de afstand tussen de centroids van de cellen.</li>
</ol>

<ol><li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioelectric+controls+of+cell+proliferation%3A+ion+channels%2C+membrane+voltage+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li>
<li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions%3A+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li>
<li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497(2016).</li>
<li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116(2017).</li>
<li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li>
<li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li>
<li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li>
<li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).</li>
<li>Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).</li>
<li>Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li>
<li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte%3A+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li>
<li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091(2019).</li>
<li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Researach%22%5BJournal%5D)">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li>
<li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+%3A+Active+players+in+%28atrial%29+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Herzschrittmacherther+Elektrophysiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li>
<li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li>
<li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li>
<li>Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

We hebben hier een eenvoudige manier aangetoond om intracellulaire elektrische stimulatie van cellen uit te voeren. In deze demonstratie gebruikten we MF's die werden gefhybridiseerd met SiNWs, vervolgens co-gekweekt met CMs. In het algemeen hebben de meeste zich vermenigvuldigende cellen de neiging om SiNWs te internaliseren, waardoor het gebruik van deze methode met vele andere celtypen mogelijk is. Bovendien, terwijl we de intracellulaire stimulatie van cellen hebben aangetoond, kunnen dezelfde principes worden gebrui...

Alle biologische organismen gebruiken elektriciteit, in de vorm van ionen, om het cellulaire gedrag te reguleren. Celmembranen bevatten verschillende soorten specifieke ionenkanalen waardoor het passieve en actieve transport van ionen mogelijk is. Deze ionen regelen de functies van prikkelbare cellen, zoals neuronale activiteit en skelet- en hartspiercontractiliteit. Bio-elektriciteit speelt echter ook een belangrijke rol in niet-prikkelbare cellen, waarbij veel cellulaire functies worden geregeld, zoals celproliferatie1, neuro-immuniteit2,3,4en stamceldifferentiatie5.
In de afgelopen decennia heeft het gebied van de bio-elektrische sector een toenemende belangstelling getrokken, wat heeft bijgedragen aan de ontwikkeling van tal van technologieën voor bio-elektronische interfaces. Microelectrode patchpipets zijn de gouden standaard van intracellulaire opname en stimulatie6. In deze methode wordt een glazen pipet getrokken onder specifieke omstandigheden om een scherpe rand te vormen met een poriegrootte van enkele micron. Deze pipet is gevuld met een buffer en de pipet maakt direct contact van de buffer met het intracellulaire volume mogelijk. Dit resulteert in een bio-elektrische interface die extreem hoge signaal-ruisverhoudingen, nauwkeurige controle over cellulaire elektrische activiteit en extreem hoge temporele resolutie oplevert. Hoewel deze methode is een zeer krachtig instrument, die onlangs werd opgeschaald naar een nano-pipet configuratie7, het wordt geassocieerd met een aantal belangrijke technische beperkingen. Het cytosol verdunningseffect 8 ,evenalsmechanische trillingen, beperkt zijn nut tot korte termijn ondervragingen, en het vereist dure gespecialiseerde apparatuur en een hoog niveau van technische vaardigheid. Bovendien beperkt de omvangrijkheid het aantal cellen dat tegelijkertijd kan worden geregistreerd of gestimuleerd, en vanwege de invasieve werking ervan kan het niet opnieuw worden geconfigureerd tijdens een experiment. Om deze beperkingen te overwinnen, werden micro-elektroden arrays ontwikkeld, maar de grootte van de elektroden beperkt de ruimtelijke resolutie en intracellulaire toegang. Nanoelectrode arrays maken intracellulaire opname en stimulatie mogelijk, maar vereisen schurende elektrovissing om toegang te krijgen tot de cytosol9,10. Bovendien zijn al deze methoden substraatgebonden en zijn dus beperkt tot in vitro celculturen, of tot externe oppervlakkige cellen, zonder toegang tot cellen die zich in een 3-dimensionaal (3D) weefsel bevinden.
Optogenetica11 wordt veel gebruikt om deze 3D- en in vivo-beperkingen aan te pakken. Optogenetische methoden zijn echter gebaseerd op de verstoringen van lichtgeactiveerde plasmamembraanionkanalen die op het plasmamembraan worden verdeeld, waardoor de 3D ruimtelijke resolutie12 en intracellulaire vermogens worden beperkt.
We hebben onlangs aangetoond dat silicium nanodraden (SiNWs) kan worden gebruikt om intracellulaire bio-elektrische ondervraging uit te voeren met submicron ruimtelijke resolutie met verschillende niet-excitable cellen, namelijk cardiale myofibroblasten en oligodendrocyten13. Bovendien gebruikten we deze SiNW's om ex-vivo celspecifieke ondervragingen uit te voeren binnen een 3D-hartweefsel, om te onderzoeken hoe hartcellen elektrisch in vivo14koppelen. Een groot voordeel van deze methodologie is de eenvoud; het vereist geen genetische modificatie of omvangrijke instrumentatie. Veel cellen zullen spontaan fotoresponsieve SiNWs internaliseren zonder dat er sonicatie of elektroporatienodig is 15. Bovendien zullen ze spontaan ontsnappen aan de endosomale inkapseling en een naadloze integratie vormen met de cytosol en intracellulaire organellen13,15. Deze cel-SiNWs composieten, genoemd cel-silicium hybriden, bezitten de dynamische, zachte en veelzijdige aard van de oorspronkelijke cel, evenals de optoelectric mogelijkheden van de SiNWs. Na hybridisatie kan de cel-SiNW hybride worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en worden gebruikt voor verschillende toepassingen zoals intracellulaire bio-elektrische stimulatie; het bestuderen van intercellulaire bio-elektrische koppeling in vitro; en voor in vivo celspecifieke ondervraging. Aangezien een effectieve stimulatie co-lokalisatie van hoge optische vermogensdichtheden en SiNWs vereist, kan men een hoge ruimtelijke resolutie bereiken, zowel in 2D als in 3D. In dit protocol beschrijven we in detail de methodologie, evenals hoe de resultaten kunnen worden geanalyseerd. De focus ligt op het intra- en intercellulair onderzoek in vitro, maar de in vivo implementatie van deze methodologie kan direct worden gebruikt voor vele andere biologische scenario's.

```html
<table><tbody><tr><td>35 mm Glass bottom dishes</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Spinning Disk Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange Plasma membrane Stain</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe Diamond Scribing Pen</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human Protein, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, cell permeant</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>
```

silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts kunnen siliciumnanodraden (SiNWs) spontaan internaliseren, waardoor ze een aantrekkelijk doelwit zijn voor bio-elektronische toepassingen. Deze cel-silicium hybriden bieden loodloze optische modulatie mogelijkheden met minimale verstoring van normaal celgedrag. De optische mogelijkheden worden verkregen door de fotothermale en foto-elektrische eigenschappen van SiNWs. Deze hybriden kunnen worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en vervolgens worden toegepast op verschillende biologische scenario's. We laten hier zien hoe deze hybriden kunnen worden gebruikt om de elektrische koppeling van hartcellen te bestuderen en te vergelijken hoe myofibroblasts met elkaar koppelen of met cardiomyocyten. Dit proces kan worden bereikt zonder speciale apparatuur buiten een fluorescerende microscoop met gekoppelde laserlijn. Ook getoond is het gebruik van een op maat gemaakte MATLAB routine die het mogelijk maakt de kwantificering van calcium voortplanting binnen en tussen de verschillende cellen in de cultuur. Myofibroblasts blijken een tragere elektrische respons te hebben dan die van cardiomyocyten. Bovendien vertoont de myofibroblast intercellulaire voortplanting iets langzamer, hoewel vergelijkbare snelheden als hun intracellulaire snelheden, wat wijst op passieve voortplanting door gapverbindingen of nanobuisjes. Deze techniek is zeer aanpasbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op andere cellulaire arena's, voor zowel in vitro als in vivo of ex vivo onderzoeken.

Het vermogen van deze methode om directe toegang tot de intracellulaire cytosol mogelijk te maken, hangt af van de spontane internalisering van de SiNW in de cellen. Hoewel SiNWs spontane internalisatie zal ondergaan in vele celtypen15, zullen sommige cellen, zoals cardiomyocyten en neuronen, de SiNWs moeten worden behandeld om hun internalisatie19mogelijk te maken. In dit protocol beschrijven we het internalisatieproces van p-i-n SiNWs met een diameter van 200-300 nm en ~1...

Dit protocol beschrijft het gebruik van silicium nanodraden voor intracellulaire optische bio-modulatie van cellen in een eenvoudige en eenvoudig uit te voeren methode. De techniek is zeer aanpasbaar aan diverse celtypes en kan zowel in vitro als in vivo toepassingen worden gebruikt.

Silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Deze techniek maakt intracellulaire bio-elektrische ondervraging met extreem hoge ruimtelijke resolutie en celspecificiteit met alleen standaard optische microscopie. Deze methode vergemakkelijkt stimulatie en elektrische ondervraging van cellen en specifieke locaties in de cellen en kan zowel in vitro als in 3D ex vivo weefselpreparaten worden uitgevoerd. Deze techniek maakt het mogelijk om veel cellulaire arena's zoals hart- of hersencellen te onderzoeken, evenals de elektrische communicatie tussen al onze niet-prikkelbare cellen.Om myofibroblasten te isoleren van een myofibroblast cardiomyocyte suspensie, pre-plate de geïsoleerde cellen op een 100 millimeter weefsel cultuur schotel voor een uur, als cardiomyocyten behoefte aan een vezel nek en behandeld oppervlak te hechten. Verzamel aan het einde van de incubatie de verrijkte cardiomyocyte met supernatant voor downstream co-cultuur. Spoel de myofibroblasten met DMEM om eventuele resterende cardiomyocyten te elimineren en voer de cellen met vers kweekmedium voor een extra twee tot vier dagen incubatie.Wanneer de cellen bereiken 80%-samenvloeiing, gebruik dan een diamant schrijver om een drie bij drie millimeter chip gesneden uit een wafer met chemische damp depositie gekweekte silicium nanodraden. En gebruik scherpe tangen om de chips in 70% ethanol te spoelen. Na het spoelen drogen, droog de chips gedurende 30 minuten onder ultraviolet licht in een bio-safety laminaire stroomkap, alvorens de chips over te brengen naar een steriele microcentrifuge buis.Gebruik een complete cel cultuur medium spoeling om de resterende ethanol te verwijderen, voordat sonicating de chips in een milliliter van verse cultuur medium in een sonicatie bad voor een tot 10 minuten. De supernatant moet troebel worden als de nanodraden worden vrijgegeven. Meng de Silicon nanowire suspensie in vijf milliliter vers kweekmedium en zaad de nanodraadoplossing op de schotel van myofibroblasten.Na vier uur in de celkweek incubator, spoel de schotel vijf keer met verse cultuur medium om alle ongeinternaliseerde nanodraden te verwijderen en blijven de cellen uitbroeden voor nog een uur om een gedeeltelijk geïnternaliseerde nanodraden volledig worden opgenomen. Voeg vervolgens 500 microliters vers bereide collageen coating oplossing aan een 35 millimeter glazen bodem schotel. Na een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius spoel je de schotel af met steriele PBS en oogst je de Silicon nanowire myofibroblast hybriden, met drie milliliter trypsine, gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius.Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met 10 milliliter cultuurmedium, spoel krachtig door pipetteren en centrifugeer niet meer dan 200 G om beschadiging van de cellen te voorkomen. Dan opnieuw opschorten de hybride cel pellets in een milliliter van vers medium, en zaad van de cellen op de collageen gecoate glazen bodem schotel. Om de interneisatie van de nanodraad te verifiëren, labelt u de cellen met fluorescerende cytosol- en membraankleurstoffen, volgens standaardprotocollen, en gebruikt u een confocale microscoop om de cellen in beeld te brengen.Aangezien siliciumnanodraden zeer reflecterend zijn, kan gereflecteerd licht worden gebruikt in plaats van fluorescentie voor hun visualisatie. Voor het opzetten van een myofibroblast silicium nanowire hybride cardiomyocyte co-cultuur, zaad het juiste aantal van elk celtype op een collageen gecoate glazen bodem schotel. En kweek de cellen op 37 graden Celsius gedurende 48 uur, zodat de cellen intercellulaire kloofknooppunten kunnen vormen.Op de dag van het experiment, vervang de cultuur supernatant met een milliliter van cultuur medium aangevuld met vers bereide calcium gevoelige kleurstof, voor een 20 tot 30 minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de plaat twee keer met steriele PBS, voordat u de cellen behandelt met een milliliter voorverwarmde fenolrode vrije DMEM. Laat vervolgens de intracellulaire calciumkleurstof gedurende 30 minuten ontsterificeren bij 37 graden Celsius, voordat u basislijnafbeeldingen verwerft.Voor optische beeldvorming en stimulatie verwarmt u een bevochtigde micro-incubator op een microscoop met een collimated laserlijn gekoppeld aan het lichtpad, voor calciumbeeldvorming en optische stimulatie tot 37 graden Celsius en een koolstofdioxidemengsel van 5% per bel. Wanneer de microscoop klaar is, plaats de myofibroblast hybride cardiomyocyte co-cultuur in de micro-incubator en visualiseer de nanodraden door heldere veldmicroscopie om een geschikte stimulatieplaats te lokaliseren. Wanneer een site is geïdentificeerd, herconfigureert u het lichtpad naar de fluorescentiemodus, met behoud van het stimulatiepunt op de vooraf gedefinieerde locatie van de nanodraad, en valideert u de optimale stimulatiekracht en pulslengte voor elk silicium nanodraadformaat en celtype.Verkrijg een opname van twee tot tien seconden van de intracellulaire calciumactiviteit bij aanvang, voordat u de nanodraad stimuleert met een enkele laserpuls van één tot 10 melowatts vermogen en een duur van één tot tien milliseconden, waarbij de resulterende calciumgolf nog twee tot 10 seconden wordt opgenomen. Aan het einde van het experiment brengen de opgenomen films van de optische stimulatie naar het juiste softwareprogramma, voor extra analyse. Met behulp van standaard fase contrast optica, samenvloeiing cellen zijn gemakkelijk te bekijken door licht microscopie.Silicium nanodraden, echter, zijn nauwelijks zichtbaar, waardoor hun locaties onmogelijk te definiëren door deze methode. Super opleggen van licht en donkere veld beelden, echter, maakt visualisatie van de Perry nucleaire regeling van het licht reflecterende silicium nanodraden. Confocale microscopie kan worden gebruikt om fluorescerende marker gekleurd cytosol en plasmamembranen te visualiseren, waardoor de intracellulaire locatie van de siliciumnanodraden duidelijker wordt.Met behulp van standaard microscopie kan een helder veldbeeld worden verkregen om de locatie van de te stimuleren siliciumnanodraad te identificeren. Een korte baseline video van de spontaan kloppende cardiomyocyten en de resten myofibroblasten kan dan worden verworven. Na stimulatie kan de calciumvermeerdering binnen de co-cultuur worden geregistreerd.Het tijdstip waarop de verschillende cellen opgewonden raken, kan worden bepaald door het punt waarop de verandering in de gemiddelde optische stroom zijn maximum bereikt. De optische stroom kan vervolgens worden berekend om te helpen bij de identificatie van het tijdstip van activering binnen elk celgebied. De intracellulaire snelheden kunnen voor elke cel worden bepaald met behulp van Khaimah-grafieken, waarbij de helling van de lijn de omgekeerde van de intracellulaire voortplantingssnelheid weergeeft.Hier kan bijvoorbeeld een samenvatting worden waargenomen van de verschillende inter- en intracellulaire snelheden gemeten voor de celinteracties binnen één co-cultuur. Deze methode kan worden gebruikt voor in vivo studies door het injecteren van de cel Silicium hybriden rechtstreeks in het weefsel en met behulp van 3D ex vivo preparaten om de in vivo elektrische bedrijf te bestuderen.

silicon-nanowires-optical-stimulation-for-investigations-intra

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit protocol laat zien hoe voltage-gevoelige kleurstoffen optische registratie van de elektrische activiteit in staat stellen uit intacte neurale netwerken, zoals de plexuses van de cavia enterische zenuwstelsel, met een instelbare resolutie die varieert van enkele cellen om multi-ganglion circuit.

Optische opnemen van elektrische activiteit in Guinee-pig Enteric Netwerken met behulp van voltage-gevoelige kleurstoffen

Volwassen geboren neuronen die ChR2 kunnen worden gemanipuleerd in slice elektrofysiologische voorbereidingen om hun bijdrage aan de functie van olfactorische neurale circuits te onderzoeken.

Met behulp van betaalbare LED-arrays voor Photo-stimulatie van neuronen

We beschrijven methoden voor grootschalige opname van meerdere afzonderlijke eenheden en lokale veld potentieel in zich gedragen knaagdieren met siliconen sondes. Drive fabricage, sonde gehechtheid aan het station en de sonde implanteren worden geïllustreerd in voldoende details voor het gemakkelijk reproduceren.

Grootschalige Opname van Neuronen door Movable Silicon Probes in Behaving Knaagdieren

This video demonstrates the use of an extracellular matrix-coated microfluidic chip to differentiate neural stem and progenitor cells or NPCs through electrical stimulation. After seeding and adhering to the coated region, NPCs grow, and the application of a direct current  triggers their differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.

Electrical Stimulation-Induced Differentiation of Neural Stem and Progenitor Cells

Infrarood zenuwstimulatie is voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie in een reeks zenuw types, waaronder die gepaard gaan met het gehoorsysteem. Dit protocol beschrijft een patch clamp methode voor het bestuderen van het mechanisme van infrarood zenuwstimulatie in een kweek van primaire auditieve neuronen.

Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

Dit protocol beschrijft hoe de tijdelijke verwarming die geassocieerd is met de optische absorptie van gouden nanostaafjes, kan worden gebruikt om differentiatie en intracellulaire calciumactiviteit in neuronale cellen te stimuleren. Deze resultaten openen mogelijk nieuwe toepassingen in neurale prothesen en fundamentele studies in de neurowetenschappen.

Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen

Een methode voor stimulatie van in-vitro celcultuur elektrische activiteit met zichtbaar licht, gebaseerd op het gebruik van organische halfgeleidende polymeren, wordt beschreven.

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Neuronale kweken zijn een goed model voor het bestuderen van de opkomende hersenstimulatie technieken via hun effect op enkele neuronen of een populatie van neuronen. Hier voorgesteld zijn verschillende methoden voor het stimuleren van neuronale kweken patroon door een elektrisch veld rechtstreeks bad elektroden geproduceerd of geïnduceerd door een in de tijd variërend magnetisch veld.

Externe excitatie van neuronen Met behulp van elektrische en magnetische velden in een-en twee-dimensionale culturen

Hier presenteren we de fabricagemethode van een optrode-systeem met optische vezels voor lichtafgifte en een elektrode-array voor neurale opname. In vivo experimenten met transgene muizen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen, tonen de haalbaarheid van het systeem voor gelijktijdige optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie.

Optrode Array voor gelijktijdige optogenetische modulatie en elektrische neurale opname

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Dit protocol schetst geavanceerde materiaalfabricage en ex vivo rattenhartmethoden voor optische en elektrische bidirectionele bio-interfacing, waardoor nauwkeurige hartstimulatie, registratie en infarctmodellering voor bio-elektronicaonderzoek mogelijk zijn.

Bidirectionele elektrische en opto-elektronische interfaces in gezonde en ischemische ex vivo rattenharten

Leer optische stimulatie met silicium nanodraden voor intra- en intercellulaire elektrische koppeling in cardiomyocyten. Deze methode biedt hoge ruimtelijke resolutie voor bio-elektronisch onderzoek.

Silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling

Meer video's verkennen