Name: Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Leer de synthese en in vivo opname van fluorescerend gelabelde liposomen met flowcytometrie. Dit protocol toont een reproduceerbare methode voor celbiologisch onderzoek naar geneesmiddelafgifte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Michael Solga en de rest van het Flow Cytometry Core-personeel bedanken voor het leveren van flowcytometrietraining en -diensten. De auteurs willen ook Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye en Prasad Srikakulapu bedanken voor hun hulp bij liposoomvoorbereiding (SSKD, DKB), weefseloogsten (MAM, JCG) en flowcytometriekleuring en monsterverwerving (AU, PS, CM). Dit werk werd ondersteund door AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 en R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 en T32 HL007284 subsidies.

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+from+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li>
<li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286(2015).</li>
<li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR%CE%B1%2F%CE%B3+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li>
<li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+A+Fundamental+Process+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li>
<li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li>
<li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system%3A+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li>
<li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29-containing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li>
<li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594(2011).</li>
<li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li>
<li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li>
<li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li>
<li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines%3A+Recent+advances+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li>
<li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarren%2C+JSA+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , (2019).</li>
<li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li>
<li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li>
<li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621(2019).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li>
<li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een driedelig protocol om (i) liposomen te bereiden die zijn gelabeld met een fluorescerende lipidekleurstof en geladen met een anti-diabetische verbinding, tesaglitazar, (ii) liposomen toedienen aan een muis via retro-orbitale injectie, en (iii) weefsels oogsten, verwerken en kleuren om liposoomopname op cellulair niveau te detecteren door flowcytometrie. Dit protocol beoordeelt de bereiding van ongeveer 150-μm liposomen en de beoordeling van de opname in vet, bloed en de milt. Het liposoompreparaat is schaalbaar, wordt meestal bij kamertemperatuur uitgevoerd en maakt gebruik van omgekeerde fase verdamping om het laden van geneesmiddelen en het verwijderen van organische oplosmiddelen te maximaliseren. Met behulp van dit protocol kan tot 2 mg / ml tesaglitazar concentratie worden bereikt in het gezuiverde liposoommonster. De bereide liposomen kunnen meer dan een jaar in HEPES-buffer bij 4 °C worden bewaard. In onze ervaring toonden ze een minimale variatie in de gemiddelde deeltjesgrootte. Minder dan 10% van het verlies van het geneesmiddelgehalte werd spectrofotometrisch aangetoond, na ultrafiltratiescheiding van liposomen van externe geneesmiddelen met een centrifugaalfilter van 10 kDa.
Tijdens de liposoomvoorbereiding zijn er enkele kritieke stappen en factoren waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste is de volgorde van de protocolstappen belangrijk en moet deze worden nageleefd. Ten tweede moet de pH van de oplossing die wordt gebruikt bij het laden van tesaglitazar op 7,4 worden gehouden om de oplosbaarheid en effectieve belasting te maximaliseren. Ten derde zorgt een goede montage van apparatuur en filters ervoor dat de uitvoer van elke stap van de juiste grootte en zuiverheid is. Als bijvoorbeeld 100- en 200-nm-filters niet goed zijn geassembleerd, kan een meer heterogene en onjuist grote partij liposomen het gevolg zijn. Ten vierde is volledige verwijdering van Ca-acetaat voorafgaand aan het laden van geneesmiddelen nodig om de overdracht van tesaglitazar in de liposomen te maximaliseren. Om te testen op volledige verwijdering van Ca-acetaat, gebruikt u snelle sedimentatie om de liposomen te verwijderen en vervolgens Ca-acetaatniveaus in de niet-liposomale oplossing te meten. Ten vijfde is het belangrijk om de massa van alle materialen die aan het liposoompreparaat worden toegevoegd bij elke stap te wegen en te registreren. Dit zorgt ervoor dat de juiste concentraties kunnen worden berekend en de benodigde verhoudingen van materialen worden gehandhaafd. Ten slotte, als de techniek niet goed wordt uitgevoerd, kan er een ongewenst niveau van heterogeniteit zijn. Het is belangrijk om deze parameter grondig te controleren met behulp van DLS en andere benaderingen zoals elektronenmicroscopie. Als u de homogeniteit wilt verbeteren, kunt u overwegen de geselecteerde filtergrootte aan te passen of twee filters te stapelen.
Bovendien is het van cruciaal belang dat controles en een antilichaampanel voor flowcytometrie worden gepland en geoptimaliseerd voordat dit protocol volledig wordt uitgevoerd (tabel 1, tabel 3). Antilichamen moeten worden getest om ervoor te zorgen dat de juiste concentraties worden gebruikt voor kleuring en dat de overlap tussen fluoroforen minimaal is. De excitatie en emissie van de kleurstof die wordt gebruikt tijdens de liposoombereiding moet ook worden meegenomen in de paneelplanning. In onze resultaten gebruikten we DiD, dat een vergelijkbare excitatie en emissie heeft als fluoroforen zoals Allophycocyanin (APC) en AlexaFluor 647. We selecteerden dus geen antilichamen geconjugeerd aan deze fluoroforen in ons antilichaampanel. Bovendien zijn isotypecontroles niet opgenomen in dit protocol. Dit komt omdat de antilichamen die voor dit protocol zijn geselecteerd, goed gevalideerde, commercieel beschikbare antilichamen zijn. Als u echter geïnteresseerd bent in het gebruik van een antilichaam dat nog niet eerder is geoptimaliseerd, overweeg dan om het antilichaam te testen tegen een isotypecontrole op de weefsels van belang voordat u het volledige experiment uitvoert.
Hoewel dit protocol laat zien hoe het bloed, de milt, het inguinale vetweefsel en de epididymale vetweefsels na de behandeling uit de muis kunnen worden geëxtraheerd en verwerkt, kan deze algemene benadering worden toegepast op andere weefsels. Afhankelijk van het weefsel van belang, kunnen verwerkings- en verteringsprotocollen moeten worden gewijzigd zoals is gepubliceerd voor de volgende weefsels: long21, lever22, peritoneale holte 3, beenmerg3,23, hersenen 24.
Een belangrijke beperking van deze methode om te overwegen is dat de opname slechts op één tijdstip per dier kan worden beoordeeld. Het kan dus voordelig zijn om dit protocol te koppelen aan andere niet-invasieve beeldvormingstechnieken of dienovereenkomstig te plannen om te zorgen voor voldoende middelen voor het uitvoeren van de beoordeling. Timing van cellulaire opname en cellulaire omschakeling zijn belangrijke factoren om te overwegen: liposomen zullen in de eerste 24 uur door het lichaam circuleren en afhankelijk van de levensduur van de cellen die liposomen opnemen of hoe ze reageren op opname, kan celdood of verdere fagocytose optreden. Onze vorige studie toonde veranderingen aan in de populatiekenmerken van DiD + -populaties op verschillende tijdstippen3. Om die reden is het evalueren van opname op eerdere tijdstippen of tijdstippen die het meest relevant zijn voor de biologie van het mechanisme van belang belangrijk. Bovendien, terwijl kwantificering van celopname in het hele weefsel kan worden uitgevoerd met dit protocol, kan flowcytometrie geen weefsellokalisatie onthullen. Het koppelen van deze aanpak aan histologische methoden kan helpen om deze beperking aan te pakken.
Over het algemeen is dit protocol een aanvulling op bestaande methodologie zoals histologie en fluorescentiebeeldvorming van het hele lichaam. Met de voortdurende vooruitgang in flowcytometrie-instrumenten en -methoden zal de ontwikkeling van grotere panelen naar steeds meer specifieke celpopulaties mogelijk worden. We stellen voor dat dit protocol wordt gebruikt in aanvulling op de bovengenoemde methoden, omdat dit de evaluatie van cellulaire opname zal verbeteren en ook de mogelijkheid biedt om de resultaten die door flowcytometrie worden waargenomen, te valideren. Bijvoorbeeld, zou blijken dat een meerderheid van de deeltjes in vetweefsel werd opgenomen door macrofagen door flowcytometrie. Immunofluorescentie van een extra aliquot van hetzelfde vetweefsel kan worden opgeslagen, gefixeerd, gesegmenteerd en gekleurd voor macrofaagmarkers om te controleren of het celtype inderdaad liposomen opneemt. Deze aanpak zou strengheid moeten toevoegen aan de uitgevoerde biodistributietests van nanodeeltjes: het valideren van celspecifieke targeting, het kwantificeren van cellulaire opname, het identificeren van off-target opname en hopelijk het verstrekken van informatie om mechanistische hypothesen te genereren voor waargenomen therapeutische uitkomsten. Dit protocol kan ook worden aangepast voor toekomstige studies met verschillende liposomen, het onderzoeken van opname in andere weefsels en het testen van nieuwe verbindingen in de setting van obesitas en dysmetabolisme of een andere ziekte waarbij nanodeeltjesafgifte een haalbare therapeutische optie is.

Naarmate de interesse in het ontwikkelen van therapieën met behulp van nanodeeltjes medicijnafgifte groeit, moeten de methoden om deeltjesdistributie en -opname voor te bereiden en te beoordelen zich blijven ontwikkelen, uitbreiden en toegankelijk zijn voor de onderzoeksgemeenschap 1,2. Dit protocol is ontwikkeld om de exacte celtypen te beoordelen die liposomen in vivo hebben opgenomen na een behandeling met DiD-gelabelde liposomen geladen met tesaglitazar, een peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor (PPAR)-α/γ agonist 3,4. In deze studies waren we in staat om te beoordelen welke celtypen direct werden beïnvloed door liposomale tesaglitazar-behandeling, de werkzaamheid van het richten op moieties en hypothesen te genereren om de behandelingsresultaten die we waarnamen te verklaren. Bovendien suggereren gevestigde biologische functies in een verscheidenheid aan celtypen dat fagocytische cellen zoals macrofagen, dendritische cellen en leverspecifieke Kupffer-cellen de meeste liposomen 5,6,7 opnemen. Met behulp van dit protocol hebben we aangetoond dat niet-klassieke fagocyten ook liposomen 3,4 kunnen opnemen.
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde methode voor het oplossen van tesaglitazar, het bereiden van liposomen door omgekeerde fase verdamping en het gebruik van calciumacetaat als lokstof voor het op afstand laden van geneesmiddelen. De gepresenteerde methoden zijn toegankelijk voor veel laboratoria en missen moeilijk te verkrijgen materialen en stappen die hoge temperaturen vereisen. Het protocol produceert liposomen van grootte die optimaal zijn voor een verhoogde circulatie in vivo8. Bovendien, zoals samengevat door Su et al., zijn tot op heden methoden om in vivo liposoomverdeling en weefselopname te evalueren bestudeerd en diepgaand getest9. Positronemissietomografie (PET), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en fluorescentie moleculaire tomografie (FMT) methoden worden toegepast om weefselspecifieke biodistributie en opname te kwantificeren 9,10,11. Hoewel deze methoden zijn geoptimaliseerd om de detectie in vivo te maximaliseren, missen ze nog steeds de mogelijkheid om de opname van liposoomen in vivo bij cellulaire resolutie te kwantificeren. Het hier gepresenteerde protocol heeft tot doel aan deze behoefte te voldoen door het gebruik van flowcytometrie. Ten slotte werd voor dit protocol de cellulaire opname beperkt tot een paar weefsels, waaronder vetweefsel. Er is een groeiende hoeveelheid literatuur die het potentieel onderzoekt voor het gebruik van nanodeeltjes om therapieën te leveren in de setting van obesitas, dysmetabolisme en ontsteking 12,13,14,15,16,17. Als zodanig vonden we het belangrijk om een protocol te delen met effectieve methoden voor het verwerken en analyseren van vetweefsel - een van de weefsels die een belangrijke rol speelt bij deze pathologieën.

<table><tbody><tr><td>1-mL spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL spuit</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge naald, steriel voor retro-orbitale injectie</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27-gauge naald, steriel voor retro-orbitale injectie</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>Clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>Anti-muis CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>Clone AFS98</td></tr><tr><td>Anti-muis CD11b PerCP Cy5.5-antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>Anti-muis CD11c APC ef780-antilichaam</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>Clone N418</td></tr><tr><td>Anti-muis CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>Clone 1D3</td></tr><tr><td>Anti-muis CD3 FITC-antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>Clone 145-2C11</td></tr><tr><td>Anti-muis CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>Clone 390</td></tr><tr><td>Anti-muis CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>Anti-muis F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>Clone BM8</td></tr><tr><td>Rundserum albumine</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>Ontzoutings spin-column</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba spin column</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dynamische lichtverstrooiing, Nicomp 370</td><td>Particle Sizing System, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX &amp; PERM Cell Permeabilisatie Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>Gaasjes</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Liposomen extruder</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Oogheelkundige glijmiddel</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz steriele</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v waterige oplossing, methanol vrij</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen fleson voor hakslager</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>Rotorend verdamper</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonificator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Warmtetherapiepomp en pad</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>Track-etched polycarbonaatmembranen</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore Polycarbonaat hydrofiele membranen</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS systeem</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Er is een groeiende interesse in het gebruik van liposomen om verbindingen in vivo te leveren, met name voor gerichte behandelingsbenaderingen. Afhankelijk van de liposoomformulering kunnen liposomen bij voorkeur worden opgenomen door verschillende celtypen in het lichaam. Dit kan de werkzaamheid van het therapeutische deeltje beïnvloeden, omdat de progressie van verschillende ziekten weefsel- en celtypespecifiek is. In dit protocol presenteren we een methode voor het synthetiseren en fluorescerend labelen van liposomen met behulp van DSPC, cholesterol en PEG-2000 DSPE en de lipidekleurstof DiD als een fluorescerend label. Dit protocol presenteert ook een aanpak voor het in vivo afleveren van liposomen en het beoordelen van celspecifieke opname van liposomen met behulp van flowcytometrie. Deze benadering kan worden gebruikt om de soorten cellen te bepalen die liposomen opnemen en de verdeling en het aandeel van liposoomopname over celtypen en weefsels te kwantificeren. Hoewel niet vermeld in dit protocol, zullen aanvullende testen zoals immunofluorescentie en eencellige fluorescentiebeeldvorming op een cytometer alle bevindingen of conclusies versterken die worden gemaakt omdat ze een beoordeling van intracellulaire kleuring mogelijk maken. Protocollen moeten mogelijk ook worden aangepast, afhankelijk van het weefsel of de weefsels van belang.

Liposoom productie
De resultaten die hier zijn gepubliceerd, zijn vergelijkbaar met die in ons eerder gepubliceerde werk 3,4,20. Met behulp van het hier gepresenteerde protocol verwachten we liposomen van ongeveer 150-150-160 nm groot te produceren. DLS toont een gemiddelde liposoomdiameter van 163,2 nm en een zetapotentiaal van -19,2 mV (figuur 1A). Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) beeldvorming onthult circulaire liposomen (figuur 1B) en het DLS-diagram onthult een relatief kleine standaardafwijking van de gemiddelde diameter (figuur 1C).
Positieve liposoombinding vereist een met PBS behandelde controle
Eerdere studies van onze groep die dit protocol gebruikten, onderzochten welke celsubsets in vetweefsel SVF, milt en bloed gebonden aan liposomen na een week in vivo toediening 3,4. Met behulp van een met PBS behandelde muis werden peritoneale holte- en miltcellen gekleurd met hetzelfde antilichaampaneel dat werd gebruikt op monsters van met liposomen behandelde muizen. Weefsels werden geoogst na een week van behandelingen (figuur 2A). De monsters van de met PBS behandelde muis dienden als een DiD FMO waarmee positieve DiD-poorten konden worden gemaakt (figuur 2B,C). Een positieve poort kan worden gemaakt met behulp van DiD-positief signaal, maar monsters zonder DiD-signaal moeten ook worden gebruikt om te controleren of de positieve poort geen DiD-negatieve monsters bevat.
Titraties zijn nodig om fluorescentiesignalen te optimaliseren
Voorafgaand aan het uitvoeren van een volledig experiment moeten verschillende omstandigheden, waaronder de concentratie van fluorescerend geconjugeerde antilichamen die worden gebruikt tijdens celkleuring en van lipidekleurstof die wordt gebruikt tijdens liposoombereiding, worden geoptimaliseerd. Flowcytometers hebben een bovengrens van detectie voor fluorescentie-intensiteit, dus te veel kleurstof opgenomen in de liposomen zal leiden tot niet-kwantificeerbare niveaus van DiD-signaal in monsters die door de cytometer lopen. Bovendien kan te veel DiD in de liposomen leiden tot hoge niveaus van niet-specifieke kleurstofoverdracht, wat de cellulaire opnameresultaten kan vertekenen. Figuur 3 rapporteert resultaten van een experiment waarbij concentraties lipidekleurstof werden getitreerd om de concentratie te identificeren die een optimaal signaal zou produceren binnen het detectiebereik van de gebruikte flowcytometer. Dit werd uitgevoerd op de weefsels die van belang waren voor het laatste experiment: bloed (figuur 3A), inguinaal vet SVF (figuur 3B) en epididymaal vet SVF (figuur 3C). De voor de test geselecteerde concentraties waren 10 mg DiD (Hoog, rood), 1 mg DiD (Midden, blauw) of 0,1 mg DiD (Laag, grijs) per 1 ml liposomen. De hoogste concentratie die in de liposomen werd gebruikt, was te hoog en overtrof het kwantificeerbare bereik van de cytometer in alle drie de weefsels (figuur 3A\u2012C, rood). De laagste concentratie DiD vertoonde enig signaal (figuur 3 A\u2012C, grijs), maar een duidelijke populatie buiten de met PBS behandelde cellen (figuur 3A\u2012C, zwart) werd niet waargenomen. Bij kwantificering toonde het rekenkundig gemiddelde van de DiD MFI voor elk weefsel en elke concentratie een duidelijk onderscheid tussen PBS-controles en de middelste concentratie van DiD (figuur 3D). Dus, zoals aangegeven in het protocol, selecteerden we de middelste concentratie (figuur 3, blauw) om te gebruiken in ons liposoompreparaat.
Het gebruik van multi-antilichaampaneel maakt identificatie van liposoomopname door verschillende celsubsets mogelijk
Met behulp van het paneel in tabel 3 werden cellen gekleurd met antilichamen tegen markers voor macrofagen, B-cellen, T-cellen, dendritische cellen, monocyten en endotheelcellen (figuur 4). Voor elk weefseltype zijn iets andere gatingstrategieën vereist, maar de meeste van dezelfde celtypen kunnen in elk type worden geïdentificeerd. Enkele uitzonderingen zijn endotheelcellen, die normaal niet in het bloed worden aangetroffen, en monocyten, die meestal vaker in het bloed voorkomen dan andere weefsels. Zodra populaties zijn geïdentificeerd, kan de totale grootte van elke celpopulatie en de frequentie waarmee ze DiD + zijn, worden gekwantificeerd. Verdere berekeningen kunnen worden uitgevoerd om de DiD + -populatie te karakteriseren: welk percentage van DiD + -cellen zijn macrofagen, endotheelcellen, enz. Let op, dit zijn voorbeelden van gatingstrategieën, maar niet de enige manier om de monsters te analyseren. De analyse wordt bepaald door het geselecteerde panel en de beschikbare flowcytometer(s).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figuur 1: Voorbeeldkenmerken van geprepareerde liposomen. (A) De grootte en het zeta-potentieel zijn gemeten zoals hierboven beschreven en zijn in tabelvorm gerapporteerd. Elke parameter wordt gepresenteerd als het gemiddelde ± de standaarddeviatie. (B) Cryo-EM werd gebruikt om de geprepareerde liposomen in beeld te brengen. De witte schaalbalk is 50 nm lang. (C) DLS werd gebruikt om een histogram van de diameter van liposomen in dit preparaat te genereren. Deze figuur is overgenomen uit Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve DiD-kleuring van met PBS of liposoom behandelde muizen. (A) Experimenteel schema voor PBS- en liposoombehandelingen. PBS of liposomen werden in de loop van een week drie keer geïnjecteerd. Weefsels werden geoogst op dag 8 van de behandeling. (B, C) Representatieve stromingsplots onthullen positieve DiD-kleuring in liposoom-behandelde (C), maar niet PBS-behandelde (B) muizen. FSC, voorwaartse verstrooiing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figuur 3: Titratie van DiD in liposomen. Liposomen werden bereid met drie verschillende concentraties DiD en geïnjecteerd in muizen. Grijs geeft de lage concentratie aan bij 0,1 mg DiD per 1 ml liposomen, blauw geeft de middelste concentratie aan bij 1 mg DiD/ml liposomen en rood geeft de hoge concentratie aan bij 10 mg DiD/ml liposomen. Een met PBS behandelde muis werd gebruikt als negatieve controle (zwart). Bloed (A, cirkel), inguinaal vet (B, triange) en epididymaal vet (C, vierkant) werden 24 uur na injectie geoogst en verwerkt om een eencellige suspensie te isoleren. Deze monsters werden uitgevoerd op een flowcytometer tot het niveau van detecteerbare DiD. Weefselspecifieke histogrammen met overlays van elke behandelingsgroep worden gepresenteerd om de fluorescentie-intensiteit per concentratie (A\u2012C) aan te tonen. Het rekenkundig gemiddelde van DiD werd ook gekwantificeerd voor elk weefsel en elke concentratie en uitgezet (D). SSC = zijverstrooiing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figuur 4: Representatieve flowcytometrie-analyse van celsubsets in vetweefsel SVF, bloed en milt. (A\u2012C) Schematische representatie van gatingstrategie om celsubsets en DiD+ -cellen in vet-SVF (A), milt (B) en bloed (C) te identificeren. Afkortingen: FSC = forward scatter; LD = levend/dood; L-DC's = lymfoïde dendritische cellen; M-DC's = myeloïde dendritische cellen; SSC = zijverstrooiing. Deze figuur is overgenomen uit Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Beheersen</td>
			<td>Doel</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Muis behandeld met PBS of zoutoplossing</td>
			<td>Gebruik de cellen van deze muis voor de volgende flowcytometriecontroles:</td>
		</tr><tr><td>1. Onbevlekte cellen</td>
		</tr><tr><td>2. Levende/dode enkele vlek</td>
		</tr><tr><td>3. Cellen gekleurd met het volledige paneel, maar missen de liposoomfluorescentie om het positieve liposoomsignaal tijdens de analyse te bepalen</td>
		</tr><tr><td>Deze muis/muizen zullen ook worden gebruikt om te bepalen of liposomen in vivo effecten hebben, omdat u in uw experiment een niet-liposoomcontrole zult hebben.</td>
		</tr><tr><td>Onbelaste liposomen</td>
			<td>Als u een verbinding in uw liposomen laadt, moet een deel van uw liposoombatch worden gesynthetiseerd zonder de verbinding. Dit verklaart alleen eventuele in vivo effecten van de liposomen.</td>
		</tr><tr><td>DiD alleen</td>
			<td>Omdat DiD ook kan worden opgenomen door celmembranen, zal het toewijzen van sommige muizen om vrije kleurstof te ontvangen in een hoeveelheid die gelijk is aan die in de liposomen, helpen rekening te houden met eventuele achtergrondmembraankleuring.</td>
		</tr><tr><td>Fluorescentie-minus-één (FMO) controles</td>
			<td>Dit zijn cellen die gekleurd zijn met alle antilichamen in uw paneel, op één na. Zoals # 3 in het bovenstaande vak, helpt dit bij het bepalen van het echte positieve signaal voor dat antilichaam tijdens de analyse</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Besturingselementen die in dit protocol moeten worden gebruikt.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Oplossing</td>
			<td>Onderdelen</td>
			<td>Geschatte benodigde hoeveelheid per batch/muis</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Liposoompreparatie</td>
		</tr><tr><td>Calciumacetaat</td>
			<td>1 M calciumacetaat in H2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES-buffer</td>
			<td>10 mM HEPES in H2O, pH 7,4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar in HEPES</td>
			<td>in 10 mM HEPES</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Weefseloogst, -verwerking en -kleuring</td>
		</tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde oplossing (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO4 in gedestilleerd H2O</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-Heparine</td>
			<td>0,1 mM heparine in PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES-buffer</td>
			<td>20 mM HEPES in PBS</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Digestiebuffer</td>
			<td>2 mg/ml collagenase type I in HEPES-buffer</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>AKC lysis buffer</td>
			<td>0,158 M NH 3 Cl,10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA in ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>FACS-buffer</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 in PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Fc Block (verdund)</td>
			<td>1:50 Fc Blok in FACS buffer</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Fixatiebuffer</td>
			<td>2% paraformaldehyde in PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Oplossingen om voor te bereiden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Een</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Extracellulaire kleuring (2x antilichaammix)</td>
		</tr><tr><td>Antigeen</td>
			<td>Fluorofoor</td>
			<td>Ab-volume per 100 μL-test</td>
			<td>Totaal benodigde volume:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Kolom C x 1,2 x totaal # monsters</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5,5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μL/test) x (1,2) x (# monsters)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# monsters)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μL/test) x (1,2) x (# monsters)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μL/test) x (1,2) x (# monsters)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>Bv605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>enz...</td>
		</tr><tr><td>CD11C</td>
			<td>APC EF780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Om uw antilichaammix te maken, combineert u de antilichamen berekend in kolom D met FACS-buffer of Brilliant Violet Staining Buffer * tot een eindvolume van (50 μL x 1,2 x Total # monsters)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Live/Dead kleuring (1x)</td>
		</tr><tr><td>Levend/Dood</td>
			<td>Fluorofoor</td>
			<td>L/D volume per 200 uL test</td>
			<td>Totaal benodigde volume:</td>
		</tr><tr><td>Levend/Dood</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Kolom C x 1,2 x totaal # monsters</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Intracellulaire kleuring (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigeen</td>
			<td>Fluorofoor</td>
			<td>Ab-volume per 50 μL-test</td>
			<td>Totaal benodigde volume:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>Fitc</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Kolom C x 1,2 x totaal # monsters</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Brilliant Violet Staining Buffer moet worden gebruikt als er meer dan één antilichaam geconjugeerd aan een Brilliant Violet fluorofoor in uw paneel wordt gebruikt.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Voorbeeld antilichaampaneel en berekeningen van kleurmengsels om te gebruiken voor stromingskleuring.

Het doel van dit protocol is om fluorescerend gelabelde liposomen te synthetiseren en flowcytometrie te gebruiken om in vivo lokalisatie van liposomen op cellulair niveau te identificeren.

Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Ons protocol koppelt een toegankelijke methode voor het bereiden van tesaglitazar-geladen liposomen met een grondige benadering voor het beoordelen van liposomen opname op cellulair niveau. Deze techniek biedt een onbevooroordeelde methode voor het beoordelen van de opname van fluorescent gelabelde liposomen die zijn bereid met behulp van lage temperaturen en eenvoudig te verkrijgen apparatuur. Om fluorescent gelabelde liposomen geladen met calciumacetaat en tesaglitazar te bereiden, gebruikt u eerst een halve inch sonde om een ether chloroform oplossing van lipiden door sonicatie te emulgeren gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur, 20 kilohertz en 50% vermogen.Breng de gehomogeniseerde water- en olie-emulsieoplossing onmiddellijk over in een rotatieverdamper met een speciale adapter, nanometermeter en drukregelaarklep en sluit de verdamper aan op een vacuümleiding. Om de organische oplosmiddelen te verwijderen, stelt u de rotatiesnelheid in op 100 omwentelingen per minuut en de vacuüm op 0,5 atmosfeer. Nadat een gel is gevormd en verdwenen, verhoogt u de vacuüm tot 0,9 atmosfeer en filtert u de liposoom waterige dispersie heen en weer door een 200 nanometer poreuze polycarbonaatfilter in een liposoom extruder uitgerust met twee gasdichte spuiten meerdere keren.Na het verifiëren van de grootteverdeling door dynamisch lichtverstrooiing, gebruikt u een twee milliliter spinkolom om alle niet-opgesloten tesaglitazar uit de liposomen te verwijderen en gebruikt u een spectrofotometer om de opgesloten medicijnconcentratie te bepalen. Voeg vervolgens niet meer dan 500 microliter liposoommonster toe aan het droge kolomgelbed. Om de liposomen toe te dienen door retro-orbitale injectie, drukt u voorzichtig op de huid boven en onder het blootgestelde oog om het oog boven het vlak van het gezicht te tillen.Breng vervolgens voorzichtig de punt van de naald in de voorste hoek van het oog aan, zorg ervoor dat de naald onder de bol zonder het aan te raken is en injecteer langzaam de liposomen in de retro-orbitale ruimte. Om het bloedmonster te oogsten, maakt u op het juiste experimentele eindpunt voorzichtig een incisie in de huid aan de rand van het caudale uiteinde van de ribbenkast van de muis en snijdt u een centimeter rechte lijn naar de kop van het dier totdat de pectoralis spieren worden blootgesteld. Op de oorspronkelijke incisieplaats maakt u twee kleine sneden loodrecht op de lijn richting de kop en snijdt u voorzichtig de pectoralis spier aan één kant van de ribbenkast in het blootgestelde gebied weg om betere toegang tot en visualisatie van de naald inbrengplaats mogelijk te maken.Plaats de naald tussen de derde en vierde ribben en houd deze zo dicht mogelijk bij de centrumlijn van de ribbenkast en trekt u zachtjes aan de spuit om bloed te beginnen verzamelen. Wanneer zoveel mogelijk volume is verzameld, brengt u het bloed over in een microcentrifugebuisje met 10 microliters van 0,5 molair EDTA op ijs. Om de inguinale post-weefselpad van elke kant van de muis te extraheren, gebruikt u één set pincetten om het peritoneale membraan naar de rechterkant te houden en de tweede set pincetten om de rand van de huid boven het peritoneale membraan aan de andere kant vast te houden.Trek voorzichtig de huid weg van het membraan om de lagen van elkaar te scheiden. Speld de buitenrand van de huid vast om beter toegang te krijgen tot het vetdepot en lokaliseer het inguinale vetweefsel depot langs de huid. En lokaliseer de inguinale lymfeknood in het midden van het vetdepot met behulp van pincetten en schaar om de lymfeknood te verwijderen zoals nodig.Nadat de lymfeknood is verwijderd, gebruikt u de pincetten om voorzichtig het uiteinde van het vetdepot dichtst bij het vastgespelde punt vast te grijpen en begint u kleine sneden te maken bij het bindweefselmembraan tussen het vetweefsel en de huid. Til het vetweefsel van de huid terwijl u sneden maakt voor betere toegang tot het membraan en plaats het depot in een polyethyleen buisje met HEPES buffer op ijs. Om de epididymalen vetdepots uit het caudale uiteinde van de buikholte te extraheren, gebruikt u pincetten om voorzichtig het eerste epididymale vetdepot van het dorsale uiteinde van de muis te trekken en lokaliseert u de epididymis en vas deferens die aan dit depot zijn bevestigd.Snijd vervolgens voorzichtig tussen het vetdepot en de epididymis en vas deferens om het vetweefsel van de andere weefsels te scheiden en plaats het depot in een polyethyleen buisje met HEPES buffer op ijs. Wanneer alle weefsels zijn geoogst, gebruikt u een tot twee paar scharen om de vetweefselmonsters in 0,5 millimeter weefselfragmenten te snijden. Voeg vervolgens 1,5 milliliter van twee milligram per milliliter collageenase buffer toe aan de buisjes met vetweefsel stukken en plaats de buisjes in een schudende incubator op 37 graden Celsius en 150 omwentelingen per minuut gedurende 30 tot 45 minuten.Na 30 minuten, gebruikt u een een milliliter pipette om de monsters meerdere keren te tritureren. Als de weefselstukken nog te groot zijn voor gemakkelijk pipetteren, plaatst u de monsters terug in de incubator voor een extra 15 minuten. Zodra de monsters volledig zijn verteerd, tritureert u de fragmenten nog eens 10 keer om de vorming van een enkele cel suspensie te garanderen en zeeft u elk monster door individuele 70 micrometer filters in één 50 milliliter buisje per monster.Spoel elke file door met vijf milliliter FACS buffer om eventuele resterende cellen te verzamelen en zeeft u elke wassing door in de juiste buis van celmonster op ijs. Wanneer alle monsters zijn gezeefd, verzamelt u de cellen door centrifugatie en aspireert u de adipocyten supernatant van de monsters. Aspireer vervolgens voorzichtig de supernatanten en laat de stromale vasculaire fractie pellets intact, en suspendeert u de pellets in één milliliter FACS buffer per buisje.Breng vervolgens de suspensies over in nieuwe 1,5 of 1,7 milliliter buisjes op ijs tot flow cytometrische analyse volgens standaard protocollen. Dynamische lichtverstrooiing onthult een gemiddelde liposoombediameter van 1

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

This video discusses the fluorescence leakage assay to study the interactions of cell-penetrating peptides with cell membranes using cell membrane mimics — large unilamellar vesicles, or LUVs, encapsulated with a fluorescent dye and a quencher.

Fluorescence Leakage Assay to Study Cell-Penetrating Peptide Interaction with Membrane

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Het gebruik van fluoroforen voor in vivo beeldvorming kan sterk beperkt worden door opsonisatie, snelle klaring, lage detectiegevoeligheid en cytotoxische effecten op de gastheer. Encapsulatie van fluoroforen in liposomen door filmhydratie en extrusie leidt tot fluorescentiekwelving en bescherming, wat in vivo beeldvorming met hoge detectiegevoeligheid mogelijk maakt.

Fluorescentie-blussen van een liposomaal ingekapseld nabij-infrarood Fluorofoor als een instrument voor In Vivo Optical Imaging

De heterogene intra-tumorale accumulatie van liposomen is in verband gebracht met een abnormale tumormicro-omgeving. Hierin worden methoden gepresenteerd om de tumormicrocirculatie te meten door middel van perfusiebeeldvorming en verhoogde interstitiële vloeistofdruk (IFP) met behulp van een beeldgestuurd robotsysteem. Metingen worden vergeleken met de intra-tumorale accumulatie van liposomen, bepaald met behulp van volumetrische micro-CT-beeldvorming.

Ruimtelijke Metingen van perfusie, interstitiële vloeistof druk en liposomen accumulatie in solide tumoren

Ex vivo geheel-orgaan beeldvorming is een snelle werkwijze voor het bepalen van de relatieve concentraties van fluorescent gelabelde verbindingen binnen en tussen weefsels of behandelingsgroepen. Omgekeerd kwantitatieve fluorescentie histologie, terwijl arbeidsintensiever, maakt de kwantificering van de absolute weefselconcentraties van gelabelde moleculen.

Het gebruik van Ex Vivo Whole-orgel imaging en kwantitatieve Tissue histologie van de Bio-verdeling van fluorescent gelabelde moleculen te bepalen

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Live-cel imaging is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van dynamische processen. Het onderzoek van vaste cellen biedt alleen statische afbeeldingen, die tot verkeerde interpretaties en verwarring over het proces leiden kunnen. Dit werk presenteert een methode om te studeren opname, drug release en intracellulaire lokalisatie van liposomaal nanodeeltjes in levende cellen.

Met behulp van In Vitro Live-cel Imaging om te verkennen chemotherapeutica geleverd door lipide gebaseerde nanodeeltjes

Dit protocol beschrijft de fabricage van liposomen en hoe deze kunnen worden geïmmobiliseerd op een oppervlak en afzonderlijk worden afgebeeld op een massale parallelle manier met behulp van fluorescentiemicroscopie. Dit zorgt voor de kwantificering van de grootte en compositorische inhomogeniteit tussen enkele liposomen van de populatie.

Een kwantitatieve fluorescentiemicroscopie gebaseerde enkelvoudige liposoom test voor het opsporen van de compositorische Inhomogeniteit tussen individuele liposomen

We beschrijven protocollen voor het beoordelen van de mate van transductie door cel-penetrerende peptiden met behulp van ex vivo imaging systemen, gevolgd door paraffine inbedding, sectie, en confocale fluorescerende microscopie met behulp van cardiale targeting peptide als voorbeeld. In ons protocol kan één dier worden gebruikt om beide soorten beeldvormingsbeoordeling van dezelfde organen te verkrijgen, waardoor het aantal dieren dat nodig is voor studies met de helft wordt gehalveerd.

In Vivo Beeldvorming van transduction efficiëntie van cardiale targeting Peptide

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Leer de synthese en in vivo opname van fluorescerend gelabelde liposomen met flowcytometrie. Dit protocol toont een reproduceerbare methode voor celbiologisch onderzoek naar geneesmiddelafgifte.

Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen (Video) | JoVE Journal

Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

Meer video's verkennen