Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen
30 juli 2020
Het doel van dit protocol is om fluorescerend gelabelde liposomen te synthetiseren en flowcytometrie te gebruiken om in vivo lokalisatie van liposomen op cellulair niveau te identificeren.
Ons protocol koppelt een toegankelijke methode voor het bereiden van tesaglitazar-geladen liposomen met een grondige benadering voor het beoordelen van liposomen opname op cellulair niveau. Deze techniek biedt een onbevooroordeelde methode voor het beoordelen van de opname van fluorescent gelabelde liposomen die zijn bereid met behulp van lage temperaturen en eenvoudig te verkrijgen apparatuur. Om fluorescent gelabelde liposomen geladen met calciumacetaat en tesaglitazar te bereiden, gebruikt u eerst een halve inch sonde om een ether chloroform oplossing van lipiden door sonicatie te emulgeren gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur, 20 kilohertz en 50% vermogen.
Breng de gehomogeniseerde water- en olie-emulsieoplossing onmiddellijk over in een rotatieverdamper met een speciale adapter, nanometermeter en drukregelaarklep en sluit de verdamper aan op een vacuümleiding. Om de organische oplosmiddelen te verwijderen, stelt u de rotatiesnelheid in op 100 omwentelingen per minuut en de vacuüm op 0,5 atmosfeer. Nadat een gel is gevormd en verdwenen, verhoogt u de vacuüm tot 0,9 atmosfeer en filtert u de liposoom waterige dispersie heen en weer door een 200 nanometer poreuze polycarbonaatfilter in een liposoom extruder uitgerust met twee gasdichte spuiten meerdere keren.
Na het verifiëren van de grootteverdeling door dynamisch lichtverstrooiing, gebruikt u een twee milliliter spinkolom om alle niet-opgesloten tesaglitazar uit de liposomen te verwijderen en gebruikt u een spectrofotometer om de opgesloten medicijnconcentratie te bepalen. Voeg vervolgens niet meer dan 500 microliter liposoommonster toe aan het droge kolomgelbed. Om de liposomen toe te dienen door retro-orbitale injectie, drukt u voorzichtig op de huid boven en onder het blootgestelde oog om het oog boven het vlak van het gezicht te tillen.
Breng vervolgens voorzichtig de punt van de naald in de voorste hoek van het oog aan, zorg ervoor dat de naald onder de bol zonder het aan te raken is en injecteer langzaam de liposomen in de retro-orbitale ruimte. Om het bloedmonster te oogsten, maakt u op het juiste experimentele eindpunt voorzichtig een incisie in de huid aan de rand van het caudale uiteinde van de ribbenkast van de muis en snijdt u een centimeter rechte lijn naar de kop van het dier totdat de pectoralis spieren worden blootgesteld. Op de oorspronkelijke incisieplaats maakt u twee kleine sneden loodrecht op de lijn richting de kop en snijdt u voorzichtig de pectoralis spier aan één kant van de ribbenkast in het blootgestelde gebied weg om betere toegang tot en visualisatie van de naald inbrengplaats mogelijk te maken.
Plaats de naald tussen de derde en vierde ribben en houd deze zo dicht mogelijk bij de centrumlijn van de ribbenkast en trekt u zachtjes aan de spuit om bloed te beginnen verzamelen. Wanneer zoveel mogelijk volume is verzameld, brengt u het bloed over in een microcentrifugebuisje met 10 microliters van 0,5 molair EDTA op ijs. Om de inguinale post-weefselpad van elke kant van de muis te extraheren, gebruikt u één set pincetten om het peritoneale membraan naar de rechterkant te houden en de tweede set pincetten om de rand van de huid boven het peritoneale membraan aan de andere kant vast te houden.
Trek voorzichtig de huid weg van het membraan om de lagen van elkaar te scheiden. Speld de buitenrand van de huid vast om beter toegang te krijgen tot het vetdepot en lokaliseer het inguinale vetweefsel depot langs de huid. En lokaliseer de inguinale lymfeknood in het midden van het vetdepot met behulp van pincetten en schaar om de lymfeknood te verwijderen zoals nodig.
Nadat de lymfeknood is verwijderd, gebruikt u de pincetten om voorzichtig het uiteinde van het vetdepot dichtst bij het vastgespelde punt vast te grijpen en begint u kleine sneden te maken bij het bindweefselmembraan tussen het vetweefsel en de huid. Til het vetweefsel van de huid terwijl u sneden maakt voor betere toegang tot het membraan en plaats het depot in een polyethyleen buisje met HEPES buffer op ijs. Om de epididymalen vetdepots uit het caudale uiteinde van de buikholte te extraheren, gebruikt u pincetten om voorzichtig het eerste epididymale vetdepot van het dorsale uiteinde van de muis te trekken en lokaliseert u de epididymis en vas deferens die aan dit depot zijn bevestigd.
Snijd vervolgens voorzichtig tussen het vetdepot en de epididymis en vas deferens om het vetweefsel van de andere weefsels te scheiden en plaats het depot in een polyethyleen buisje met HEPES buffer op ijs. Wanneer alle weefsels zijn geoogst, gebruikt u een tot twee paar scharen om de vetweefselmonsters in 0,5 millimeter weefselfragmenten te snijden. Voeg vervolgens 1,5 milliliter van twee milligram per milliliter collageenase buffer toe aan de buisjes met vetweefsel stukken en plaats de buisjes in een schudende incubator op 37 graden Celsius en 150 omwentelingen per minuut gedurende 30 tot 45 minuten.
Na 30 minuten, gebruikt u een een milliliter pipette om de monsters meerdere keren te tritureren. Als de weefselstukken nog te groot zijn voor gemakkelijk pipetteren, plaatst u de monsters terug in de incubator voor een extra 15 minuten. Zodra de monsters volledig zijn verteerd, tritureert u de fragmenten nog eens 10 keer om de vorming van een enkele cel suspensie te garanderen en zeeft u elk monster door individuele 70 micrometer filters in één 50 milliliter buisje per monster.
Spoel elke file door met vijf milliliter FACS buffer om eventuele resterende cellen te verzamelen en zeeft u elke wassing door in de juiste buis van celmonster op ijs. Wanneer alle monsters zijn gezeefd, verzamelt u de cellen door centrifugatie en aspireert u de adipocyten supernatant van de monsters. Aspireer vervolgens voorzichtig de supernatanten en laat de stromale vasculaire fractie pellets intact, en suspendeert u de pellets in één milliliter FACS buffer per buisje.
Breng vervolgens de suspensies over in nieuwe 1,5 of 1,7 milliliter buisjes op ijs tot flow cytometrische analyse volgens standaard protocollen. Dynamische lichtverstrooiing onthult een gemiddelde liposoombediameter van 1
Overzicht
Dit protocol beschrijft de synthese van fluorescentielabelled liposomen en hun in vivo lokalisatie met behulp van flowcytometrie. Het biedt een eenvoudige methode voor het bereiden van liposomen en het beoordelen van hun cellulaire opname.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Farmacologie
Achtergrond
- Fluorescentielabelled liposomen zijn waardevolle instrumenten voor het bestuderen van cellulaire processen.
- Flowcytometrie maakt nauwkeurige analyse van de opname van liposomen in vivo mogelijk.
- Laagtemperatuurmethoden vergemakkelijken de bereiding van deze liposomen.
- Inzicht in het gedrag van liposomen kan systemen voor geneesmiddelentoediening verbeteren.
Doel van de studie
- Om tesaglitazar-geladen liposomen te synthetiseren voor cellulaire studies.
- Om de opname van deze liposomen op cellulair niveau te evalueren.
- Om een reproduceerbare methode te bieden voor de preparatie en analyse van liposomen.
Gebruikte methoden
- Sonicatie van lipidoplossingen om emulsies te creëren.
- Rotatieverdamping om organische oplosmiddelen uit liposoompreparaten te verwijderen.
- Dynamische lichtverstrooiing voor analyse van de grootteverdeling.
- Flowcytometrische analyse om de opname van liposomen in weefsels te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De gemiddelde liposoomdiameter werd gemeten op 163.2 nanometers.
- Het zeta-potentiaal van de liposomen bleek -19.2 millivolts te zijn.
- Cryogene elektronenmicroscopie bevestigde de cirkelvorm van de liposomen.
- Flowcytometrie gaf inzicht in de lokalisatie van de liposomen in vivo.
Conclusies
- Het protocol synthetiseert en karakteriseert succesvol fluorescentielabelde liposomen.
- Flowcytometrie is een effectieve methode voor het analyseren van de opname van liposomen.
- Deze aanpak kan worden toegepast in verdere studies naar geneesmiddelentoediening en celbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol stelt biofarmaceutische R&D-teams in staat om de weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescentie-gelabelde liposomen kwantitatief te beoordelen, wat bijdraagt aan targetvalidatie en mechanische risicoreductie bij lipidgebaseerde geneesmiddelafgifte. Door een reproduceerbare methode te bieden om de distributie van liposomen over verschillende celtypen te meten, biedt het inzicht voor de optimalisatie van formuleringen en vermindert het het risico op uitval tijdens de preklinische ontwikkeling. Deze aanpak vergroot het voorspellende vertrouwen bij het selecteren van liposomen met de gewenste biodistributieprofielen voor therapeutische toepassingen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de biodistributie van lipide nanodeeltjes mogelijk om hypothesen over weefselspecifieke targeting te valideren.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve flowcytometrie-uitlezingen om mechanistische aannames over liposoom-celinteracties te stroomlijnen en risico's te beperken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door liposomen te identificeren met een preferentiële opname in ziekte-relevante celpopulaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarstaan van de assay: Genereert gestandaardiseerde single-cell suspensies uit vet- en lymfoïde weefsels voor een consistente meting van de liposoomopname.
- Kwantitatieve output: Maakt frequentie- en proportieanalyse van DiD-positieve cellen in verschillende weefsels mogelijk middels flowcytometrie gating-strategieën.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het screenen van meerdere liposoomformuleringen door de kleurconcentratie aan te passen en de signaalscheiding ten opzichte van PBS-controles te valideren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Faciliteert de beoordeling van liposoomopname in metabolisch actieve weefsels zoals vetdepots, wat relevant is voor modellen van metabole ziekten.
- Translationele continuïteit: Verbindt in vivo toediening met ex vivo weefselverwerking en flowcytometrische analyse voor mechanisch inzicht.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Maakt vergelijking van de liposoomopname tussen verschillende formuleringen mogelijk om go/no-go-criteria bij de identificatie van lead-verbindingen te onderbouwen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege screening van formuleringen tot preklinische validatie, en levert kwantitatieve gegevens over de cellulaire opname die bijdragen aan de optimalisatie van lead-verbindingen en de selectie van formuleringen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van liposoomtropisme door de opname in specifieke stromale vasculaire fracties en lymfeklierenpopulaties te kwantificeren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve flowcytometrie-outputs om liposoombatches en kleurlaadcondities te vergelijken.
- Analytics: Biedt metrieken voor DiD-fluorescentie-intensiteit en populatiefrequentie om een vergelijkende analyse van de liposoomprestaties mogelijk te maken.
- Translationeel onderzoek: Koppelt in vivo-afgifte aan ex vivo-weefseldissociatie en single-cell-analyse voor mechanistische risicoreductie.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van liposoomformuleringen over meerdere ziektemodellen en weefseltypen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in de biodistributie van liposomen door directe kwantificering van de cellulaire opname.
- Operationele waarde: Standardiseert weefselverwerking en flowcytometrie-analyse voor reproduceerbare vergelijkingen tussen experimenten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door empirische gegevens over liposoom-celinteracties te verschaffen, waardoor uitval in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van liposoomkandidaten mogelijk op basis van weefselspecifieke opnameprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de bereiding van lipide nanodeeltjes, retro-orbitale injectie en technieken voor weefseldissociatie.
- Afhankelijk van flowcytometrie-instrumentatie die in staat is om DiD-fluorescentie te detecteren en zwak positieve populaties te onderscheiden.
- Vereist standaardisatie van de collagenase-digestie en filtratiestappen om consistente opbrengsten van enkelcellen over verschillende weefsels te garanderen.
- Vereist optimalisatie van de DiD-concentratie (1 mg/mL aanbevolen) om signaalverzadiging te voorkomen terwijl de detectiegevoeligheid behouden blijft.
- Beperkt door de toegankelijkheid en levensvatbaarheid van weefsel tijdens enzymatische dissociatie, in het bijzonder voor fragiele lymfoïde of adipose monsters.
