Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Dit protocol maakt een gelijktijdige verwerving van meerdere embryo's binnen één beeldsessie mogelijk. Terwijl voorbeeldvoorbereiding is aangepast voor multi-point acquisitie met behulp van een high content analyzer, kunnen monsters die met dit protocol zijn bereid, worden afgebeeld op elke omgekeerde microscoop die multi-point acquisitie kan gebruiken. Om te beginnen, organiseren twee rijen van 15 tot 20 embryo's op een schone sectie van grote plaat met behulp van een ei picker tool.

Lijn de embryo's aan hun ventrale kant in dezelfde oriëntatie met betrekking tot voorste en achterste uiteinden. Plak een spacer op een coverslip en streep 10 microliters van heptane lijm vaststelling van de blootgestelde coverslip glas inzet. Terwijl de lijm droogt, gebruik dan een scheermesje om een rechthoek rond de twee rijen embryo's te snijden.

Snijd een tweede rechthoek naast de eerste en verwijder de tweede rechthoek met een rechte randzijde van een roestvrijstalen spatel. Schuif voorzichtig de rechte rand van de spatel onder de eerste rechthoek en verwijder deze. Plaats vervolgens de uitsnijding met embryo's aan de buitenzijde van een schaal van 3,5 centimeter.

Onder een stereomicroscoop, lager een voorbereide coverslip over de embryo's en druk voorzichtig de twee rijen embryo's op de lijm. Als u geen microinjectie uitvoert, vult u de siliconenruimter halverwege de top met één-op-één halocarbonolie 700 tot halocarbonolie 27. Lijn de onderste randen van een vier-slide plaat adapter met dubbelzijdige tape.

Dit voorkomt dat de dia beweegt tijdens de beeldvorming. Zorg ervoor dat u de tape niet in het pad van de objectieve lens plaatst. Monteer de coverlip op de vier-slide plaat adapter.

Bij het micro-injecteren van de embryo's, plaats de coverslip met embryo's over een dia om te voorkomen dat de bodem van de coverslip vuil wordt tijdens uitdroging en micro-injectie. Desiccate de embryo's gedurende vijf tot 10 minuten, dan onmiddellijk bedekken met een-op-een halocarbon olie 700 tot halocarbon olie 27, het vullen van de siliconen spacer halverwege de top. Laad twee of drie microinjectienaalden met ongeveer twee microliters injectant met behulp van een verlengde laadpunt.

Monteer een naald op de microinjector en druk de zuiger halverwege de punt, waardoor de luchtdruk in de glazen capillaire. Laat de glazen naald op een glazen schuif en snijd de punt van de naald met een nieuw nummer negen scheermes, snijden onder een hoek van 45 graden om een scherpe open punt te produceren. De injectant moet naar beneden stromen naar de onderkant van de punt zonder uit de naald te stromen.

Voeg voorzichtig 20 microliter halocarbonolie toe over de punt van de naald en snijd deze opnieuw open onder een hoek van 45 graden. De injectant moet beginnen om snel te stromen, dus vergeet niet om de druk aan te passen door het intrekken van de zuiger. Gebruik de micromanipulator om de naald in het midden van het gezichtsveld te plaatsen.

Til vervolgens de naald op en verwijder de glazen schuif van onder het. Plaats de embryo's op het stereomicroscoopstadium, onder de microinjectienaald en concentreer ze op 50 keer vergroting. Laat de naald zakken totdat deze in hetzelfde focusvlak komt als de embryo's.

Het verplaatsen van de glijbaan met de ene hand en het bedienen van de microinjector met de andere, injecteren een rij embryo's. Hef de naald en draai de dia 180 graden om de tweede rij embryo's bloot te stellen aan de micro-injectie naald. Laat de naald zakken en injecteer de tweede rij embryo's.

Dit protocol werd gebruikt om de rol van microtubuli in endoplasmische reticulumreorganisatie tijdens mitose in het Embryo Drosophila te onderzoeken. De effecten van verschillende microinjected drug behandelingen op ER reorganisatie werden kwantitatief vergeleken. Colchicine, dat nieuwe microtubuli polymerisatie voorkomt, bleek de lokalisatie van de ER tot spindelpolen tijdens mitose drastisch te verminderen.

Time lapse imaging data werd verkregen voor 32 embryo's. Gemiddelde en maximale intensiteit metingen werden geanalyseerd uit 12, 800 regio's van belang met behulp van een aangepaste MATLAB script. Wanneer u dit protocol voor de eerste keer probeert, vergeet dan niet te lang te duren voor één stap, anders loopt u het risico uw ontwikkelingsfase te missen die u wilt image.

Oefen dit protocol stap voor stap voordat u experimenten probeert. Onze methode van monstervoorbereiding vergemakkelijkt een gelijktijdige verwerving van meerdere embryo's tijdens één experiment, waardoor voldoende experimentele replica's worden genereert voor kwantitatieve analyse. Dit protocol kan helpen bij de ontwikkeling van embryologie overgang van kwalitatieve naar kwantitatieve beeldvorming experimenten.

De mogelijkheid om meerdere embryo's beeld binnen een imaging sessie elimineert ook experimentele ruis tussen replica's.