Name: Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Leer micro-injectie en live-celmicroscopie van Drosophila-embryo's met een geautomatiseerde high content analyzer. Deze methode ondersteunt kwantitatieve analyse van embryonale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UD, WFM en BR worden ondersteund door het Center for Cellular Construction, een National Science Foundation (NSF) Science and Technology Center, in het kader van subsidieovereenkomst DBI-1548297. BR wordt ook ondersteund door een NSF CAREER award, 1553695.

<ol><li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li>
<li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila-a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila-a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li>
<li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology%2C+adhesion+junctions%2C+presence+of+myofibrils+and+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147(2010).</li>
<li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beautiful+cell%3A+high-content+screening+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li>
<li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+based+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li>
<li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144(2018).</li>
<li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience%3A+a+history+lesson+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li>
<li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+flies-big+discoveries%3A+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li>
<li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li>
<li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li>
<li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li>
<li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li>
<li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li>
<li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327(2019).</li>
<li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reticulon+and+DP1%2FYop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li>
<li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859(2015).</li>
<li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li>
<li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li>
<li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+J+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer Science & Business Media. eBook ISBN 978-3-662-22489-2 (2013).</li>
<li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 978-087969827-0 (2000).</li>
<li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Bate, M., et al. Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBate%2C+M+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Press. Chapter 3. ISBN 978-087969899-7 (1993).</li>
<li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUyen%2C+T+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 67, Academic Press. 113-123 (2001).</li>
<li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li>
<li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li>
<li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li>
<li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1%2C+spastin%2C+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li>
<li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li>
<li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+one+becomes+many%3A+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessay%22%5BJournal%5D)">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li>
<li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided%2C+H3K9me2%2F3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes & Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li>
<li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li>
<li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li>
<li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTram%2C+U+%22Encyclopedia+of+Life+Sciences%22">Encyclopedia of Life Sciences</a>. , (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het hier beschreven protocol is zeer veelzijdig en gemakkelijk aanpasbaar voor het bestuderen van biologische gebeurtenissen in verschillende stadia in de embryonale ontwikkeling van Drosophila. Dit protocol is zeer geschikt voor het bestuderen van biologische processen die gedurende lange perioden voorkomen. Bijvoorbeeld, studies vancellulaireisatie 29,30 of de vorming van heterochromatine domeinen in Drosophila31,32 kunnen profiteren van het gebruik van de methoden beschreven in dit protocol, omdat deze processen optreden over een langere periode van tijd. Bovendien kan de steekproefgrootte worden vergroot door de vergroting te verminderen om vragen te bestuderen die minder optische resolutie vereisen, zoals de timing tussen syncytiale divisies33 of de duur van gastrulation34.  Ook een 20x doelstelling maakt het mogelijk om twee embryo's in één beeldvormingsvlak te beelden. De methoden in dit protocol bieden een dynamisch platform om biologische vragen te stellen met behulp van embryonale ontwikkeling als modelsysteem voor kwantitatieve analyse.
Er zijn 3 kritieke stappen in dit protocol. Na dedechorionatie in 50% bleekmiddel is het noodzakelijk dat embryo's 5 keer krachtig worden gespoeld en gedroogd (2.3.4). Deze stap verwijdert eventuele overgebleven kleine stukjes chorion. Overgebleven chorion zal het gezichtsveld belemmeren bij het beeldvorming van het embryo. Bij het monteren van de embryo's op de glazen coverslip (3.5), is het belangrijk om de embryo's met uniforme druk op de lijm te drukken. Dit zal de embryo's op hetzelfde z-vlak plaatsen. Bij het opensnijden van de microinjectienaald is het belangrijk om de zuiger onmiddellijk in te trekken om de stroomsnelheid van de naald aan te passen of u verliest al uw injectant.
Onze studie werd beperkt door twee factoren. De eerste factor was niet met een geautomatiseerd segmentatieproces. We ontwierpen echter een handmatig segmentatiescript met MATLAB; met een genetisch gecodeerde spindelmarker kan dit proces worden geautomatiseerd. In de toekomst willen we CNN-RFP21, Rtln1-GFP en CNN-RFP produceren; ReepB-GFP transgene lijnen om geautomatiseerde spindelsegmentatie mogelijk te maken. Voor meer informatie over onze MATLAB script en analyse pijplijn, verwijzen naar aanvullende materialen van Diaz et al.15. Ten tweede werden we ook beperkt door ons aankoopinterval van 35 s, waardoor we slechts 6 embryo's tegelijk konden beeld geven. Een langere acquisitie-interval zou ons in staat stellen om meer embryo's tegelijkertijd in beeld te brengen. Hoewel de doorvoer van de toedinatie van geneesmiddelen kan worden verhoogd door micro-injectie te vervangen door een permeatiestap, vonden we dit onnodig omdat onze steekproefgrootte al werd beperkt door acquisitie-interval.
Hoewel dit protocol werd gebruikt om de embryonale ontwikkeling van Drosophila in beeld te brengen, is de algemene aanpak aanpasbaar voor het bestuderen van embryonale ontwikkeling in andere meercellige modelsystemen, zoals C. elegans,Zee-egels en Xenopus. Embryo's zijn zeer nuttig voor kwantitatieve analyse, omdat ze gemakkelijk kunnen worden gesynchroniseerd via verzameling of bevruchting. Bovendien bewegen of zwemmen embryo's niet uit een gezichtsveld, waardoor het gebruik van een eenvoudige multipoint-acquisitiesoftware meerdere timelapse-video's voor kwantitatieve analyse kan produceren. Hoewel we een high content analyzer gebruikten in onze studie, kan elk omgekeerd microscoopsysteem dat in staat is multipoint acquisitie te combineren met de methoden waarnaar hierin wordt verwezen.
Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van een multipoint overname staat omgekeerde confocale microscoop; echter, de voordelen van een hoge inhoud analyzer ontstaan als men verhoogt steekproef grootte om vragen die minder resolutie in de tijd vereisen studie. Een duidelijk voordeel van het gebruik van een high content analyzer is de mogelijkheid om 4 afzonderlijke dia's tegelijkertijd te beelden in vergelijking met 1 dia op traditionele systemen. Met een volledige set van 4 dia's en 40 embryo's op elke dia kunnen 160 embryo's gedurende enkele uren worden afgebeeld, zolang het aanschafinterval minstens 15 minuten tussen de frames bedraagt. Een ander belangrijk voordeel van het gebruik van een high content analyzer is dat de monsters volledig zijn afgesloten van externe lichtbronnen, wat nodig is voor metingen op basis van fluorescentieintensiteit. Ten slotte heeft de high content analyzer die in onze studie wordt gebruikt een 5,5-megapixel CMOS-camera die een royale 221,87 μm gezichtsveld biedt bij 60x vergroting. Dit grotere gezichtsveld stelde ons in staat om een half embryo per acquisitiepunt in beeld te brengen.

In de afgelopen 30 jaar hebben de vooruitgang in beeldvormingstechnologieën en moleculaire sondes voor live celbeeldvorming ons begrip van de complexiteit en innerlijke werking van de cel bevorderd. Bij deze vooruitgang in de technologie is een grotere afhankelijkheid van het gebruik van ex vivo cel cultuur modellen voor de verwerving van hoge doorvoer imaging gegevens. Celkweekmodellen bieden verschillende voordelen, waaronder de controle van de micro-omgeving via microfluïde systemen, en de mogelijkheid om meerdere cellen tegelijkertijd te beelden, waardoor het gebruik van kwantitatieve benaderingen die nodig zijn voor screening met een hoge doorvoer1,2. Er zijn echter ook aanzienlijke nadelen verbonden aan celkweekmodellen in de context van morfologische studies, zoals tweedimensionale glas- of kunststofoppervlakken die verstorende effecten hebben op de celmorfologie en de voorreguleringervan 3,4,5. Deze effecten kunnen valse of misleidende gegevens opleveren met betrekking tot de studie van biologische processen die cellulaire morfologie reguleren.
Hoewel het alternatief is geweest om cellulaire morfologie te bestuderen in de context van een intact organisme6,vergemakkelijken weinig geschikte intacte organismen een hoge doorvoer kwantitatieve live celbeeldvorming als gevolg van moeilijkheden bij het in leven houden van hele organismen door middel van beeldvorming, en uitdagingen in verband met beeldvorming in een groot meercellig organisme. Als gevolg hiervan hebben celbiologische studies in intacte organismen zich over het algemeen gericht op het observeren van een enkel organisme in de loop van de tijd, wat de steekproefgrootte sterk beperkt. Bovendien maakt deze beperking van één dier-op-een-tijd live beeldvorming moeilijk en kostbaar om in de vorm van een scherm te gebruiken en beperkt het de mogelijkheid om kwantitatieve analytische instrumenten toe te passen, omdat het aantal monsters over het algemeen te klein is. Zo ontstaat de behoefte aan een meercellig modelorganisme dat kan worden gebruikt voor kwantitatieve benaderingen met een hoog gehalte.
Dit protocol past het Drosophila embryo aan voor plaatgebaseerde hoge gehalte beeldvorming om experimentele monstergroottes te genereren die groot genoeg zijn voor kwantitatieve analyse. Drosophila melanogaster is algemeen bekend als het eerste model organisme. Onderzoek met drosophila heeft geleid tot doorbraken in de cel- en moleculaire biologie, waaronder de overdracht van genetische informatie, de identificatie van celsignaleringstrajecten en genetische vereisten van embryonale ontwikkeling7,8,9. Daarnaast is het Drosophila embryo gebruikt om de in vivo microtubbuledynamiek te onderzoeken tijdens cellulaire divisie10,11,12. Het gebruik van microinjectie om kleine moleculen en moleculaire sondes te leveren biedt temporele controle die drosophila embryonale ontwikkeling bijzonder krachtig maakt voor indringende cellulaire processen in vivo13,14. Het genereren van een aanzienlijk aantal experimentele herhalingen met een traditionele beeldvormingsbenadering is echter zeer arbeidsintensief en heeft beperkt gebruik in beeldschermen met hoge doorvoer en kwantitatieve analyse. Onze aanpak maakt gebruik van een high content analyzer die doorgaans is gereserveerd voor eencellige analyse en past in vivo beeldvormingsanalyse aan in het syncytium van de vroege Drosophila embryo.
Dit protocol werd gebruikt om Drosophila embryo's te verzamelen, te ën en micro-injecteren om de mechanismen te onderzoeken die morfologische veranderingen in het Endoplasmatische Reticulum (ER) stimuleren tijdens mitose15. Hoewel veel studies de dynamische aard van de ER hebben geschetst tijdens de celcyclus16,17,18,19, is het moeilijk geweest om de effecten van meerdere verstoringen in de tijd op ER-morfologie te vergelijken. Om de componenten te identificeren die veranderingen in ER-morfologie over celdeling stimuleren, werden de in dit protocol genoemde methoden gebruikt om de rol van microtubuli en andere cytoskeletale factoren op mitotische ER-reorganisatie te onderzoeken met behulp van de corticale syncytialeling in het vroege Embryo drosophila. Samen, de beschikbaarheid van genetische verstoring binnen de Drosophila gemeenschap, de mogelijkheid om drugs micro-inject en moleculaire sondes op precieze momenten tijdens de ontwikkeling, en de goedkope kosten van het werken met Drosophila maakt deze aanpak zeer vatbaar voor high-throughput image-based screening. De hier beschreven methoden zijn van toepassing voor het bestuderen van een breed scala aan cellulaire en ontwikkelingsprocessen in vivo met behulp van het Drosophila embryo20. Specifiek, dit protocol is goed aangepast aan biologische gebeurtenissen die zich voordoen over een langere periode en binnen 100 micron van de Drosophila embryo cortex te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>10 x 35mm Micro Dish</td><td>VWR</td><td>Cat #: 10799-192</td><td>N/A</td></tr><tr><td>100% druivensap concentraat</td><td>Welch's, 100% Concentrate Grape Juice</td><td>N/A</td><td>Koop in supermarkt</td></tr><tr><td>250ml Erlenmeyer kolven, smalle mond</td><td>VWR</td><td>Cat #: 10536-914</td><td>N/A</td></tr><tr><td>3" Non-Metallic Zeef Nr. 140</td><td>Gilson Company</td><td>SV-165 #140</td><td>N/A</td></tr><tr><td>4 Slide Imaging Tray</td><td>Grace Biolabs</td><td>SKU: 400104</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ACROS Organics, n-Heptane, 99+%, voor spectroscopie</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: AC411255000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absoluut, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# : AC615095000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoaat, 99%. (methyl paraben )</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: AC126961000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Dekglas, Rechthoekig, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 50-143-782</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Cultuurputjes Siliconenblad Materiaal - 1.6mm dik</td><td>Grace Biolabs</td><td>SKU: 664273</td><td>N/A</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Flessjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 03-341-71A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Embryo Collectiekooi-Mini</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-105</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Pipettips</td><td>Fisher Scientific</td><td>Productcode: 10289651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Kegelcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 05-527-90</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Kegelcentrifugebuizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 14-432-22</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Fleischmann's, Actieve Droge Gist</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>Koop in supermarkt</td></tr><tr><td>Druivenplaten</td><td>REFFER NAAR RECEPTBEREIDING</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halocarbon 27 Olie</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-133</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halocarbon 700 Olie</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-131</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Heptaanlijm</td><td>REFFER NAAR RECEPTBEREIDING</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Industriële Scheermesjes (Chirurgisch Koolstofstaal) Enkelzijdig Nr. 9</td><td>VWR</td><td>Cat #: 55411-050</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Parafilm M Laboratorium Afdichtingsfolie, 4 inch x 250 voet Rol</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 50-998-944</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Scotch Dubbelzijdig Plakband met Dispenser, Smalle Breedte, Ontworpen voor Verlijming, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: NC0879005</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Silica gel kralen, droogmiddel ~ 2 - 5 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SKU: 1077351000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen Lepel/Spatel</td><td>VWR</td><td>Cat #: 470149-044</td><td>N/A</td></tr><tr><td>W.A. Hammond Drierite Indicaterende Absorptiemiddelen</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 23-116582</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Gistpasta</td><td>REFFER NAAR RECEPTBEREIDING</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12 Tafelcentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Je zult toegang nodig hebben tot 15 ml kegelcentrifuge-inzetstukken.</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Elke autoclaaf is prima.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II Microinjector.</td><td>Drummond Scientific</td><td>N/A</td><td>Dit is een op minerale olie gebaseerd injectiesysteem.</td></tr><tr><td>GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td><td>GE healthcare</td><td>N/A</td><td>Een snelle confocale microscoop die geschikt is voor multipoint-acquisitie kan worden vervangen.</td></tr><tr><td>Koelkast (4C&deg;)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Vlieg media en gistpasta moeten worden bewaard bij (4C&deg;).</td></tr><tr><td>Zies Stemi 508 Stereo Microscoop met Transilluminatie basis 300 en overhead gooseneck verlichting.</td><td>Zeiss Microscopy</td><td>N/A</td><td>De transilluminatiebasis en gooseneckverlichting zijn noodzakelijk.</td></tr></tbody></table>

drosophila embryo preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Moderne benaderingen in kwantitatieve live celbeeldvorming zijn een essentieel instrument geworden voor het verkennen van celbiologie, door het gebruik van statistieken en computationele modellering mogelijk te maken om biologische processen te classificeren en te vergelijken. Hoewel celcultuurmodelsystemen zeer geschikt zijn voor beeldvorming met een hoog gehalte, suggereren hoge doorvoerstudies van celmorfologie dat ex vivo culturen beperkt zijn in het samenvatten van de morfologische complexiteit in cellen in levende organismen. Als zodanig is er behoefte aan een schaalbaar hoog doorvoermodel systeem om levende cellen in een intact organisme te beeld. Hier beschreven is een protocol voor het gebruik van een hoge inhoud image analyzer om tegelijkertijd meerdere time-lapse video's van embryonale Drosophila melanogaster ontwikkeling tijdens de syncytial blastoderm stadium te verwerven. De syncytial blastoderm heeft traditioneel gediend als een groot in vivo model voor beeldvorming biologische gebeurtenissen; het verkrijgen van een aanzienlijk aantal experimentele replica's voor kwantitatieve en hoge doorvoerbenaderingen was echter arbeidsintensief en beperkt door de beeldvorming van één embryo per experimentele herhaling. Hier gepresenteerd is een methode om beeldvorming en micro-injectie benaderingen aan te passen aan een hoog gehalte imaging systeem, of een omgekeerde microscoop in staat van geautomatiseerde multipoint acquisitie. Deze aanpak maakt het mogelijk om 6-12 embryo's gelijktijdig te verwerven, afhankelijk van de gewenste acquisitiefactoren, binnen één beeldsessie.

De in dit protocol gepresenteerde aanpak werd gebruikt om de rol van microtubuli in Endoplasmic Reticulum (ER) reorganisatie tijdens mitose in het Drosophila embryo15te onderzoeken. Tijdens mitose, de structuur van de ER toont een dramatische reorganisatie, echter, de krachten die rijden deze veranderingen zijn slecht begrepen. Onlangs werd aangetoond dat een familie van ER-vormgeving eiwitten de vorming van ER-tubule25,26,27,28bevordert , die bekend staan om hun nabijheid met microtubuli28. Om de rol microtubuli op ER-morfologie te bestuderen, werden de methoden in het protocol gebruikt om gegevens te genereren om de effecten van verschillende microinjected drugbehandelingen op ER-reorganisatie tijdens mitose kwantitatief te vergelijken. Colchicine, dat nieuwe microtubulial polymerisatie voorkomt, bleek de reorganisatie van de SEH tijdens mitose drastisch te verminderen, zoals aangegeven in figuur 5 en figuur 6. Bovendien maakte de hier beschreven aanpak de productie van time laps-beeldgegevens voor 32 embryo's mogelijk. Gemiddelde en maximale intensiteit metingen werden geproduceerd uit 12.800 regio's van belang met behulp van een aangepaste MATLAB script, die ook gegenereerd beschrijvende en inferential statistieken van vitaal belang voor het maken van vergelijkingen tussen medicamenteuze behandelingen. Door de beschikbaarheid van moleculaire sondes en het gemak van microinjecties, zijn de hier beschreven methoden gemakkelijk aan te passen om een verscheidenheid aan biologische processen te bestuderen via fluorescentieintensiteit kwantificering.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figuur 5: Representatieve afbeeldingen van Rtnl1-GFP en ReepB-GFP verrijking bij de aspolen tijdens mitose. (A) 60x gezichtsveld van ReepB-GFP tijdens mitose in celcyclus 10. Het blauwe vierkant vertegenwoordigt het gezichtsveld dat wordt gebruikt voor panelen B-E. Paneel A wordt verwerkt met een drempelwaarde binair filter. Dit filter is niet toegepast op Panels B-E omdat gegevens van pixels onder de ingestelde drempelwaarde worden uitgesloten. (B,D) ReepB-GFP in controle, en in colchicine. C,E) Rtnl1-GFP in control, en in colchicine. Dit cijfer is gewijzigd van Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figuur 6: Kwantificering van Rtnl1-GFP en ReepB-GFP verrijking bij de aspolen tijdens mitose. 20 spindels en 20 cytoplasma ROI's in 10 frames werden geanalyseerd voor 32 embryo's onder de volgende omstandigheden. (A) 10% DMSO-controle-injecties voor Rtnl1-GFP. Controleembryo's vertoonden een 0,1-voudige toename van de verrijking (p<0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met niet-geïnjecteerde monsters (p < 0,001 voor alle monsters op T210). (B) ReepB-GFP embryo's geïnjecteerd met 10% DMSO om als controle te dienen. Controle embryo's toonde een 0,1-voudige toename van de verrijking (p<0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met niet-geïnjecteerde monsters (Figuur 1E; p < 0,001 voor alle monsters op T210). (C) Rtnl1-GFP embryo's geïnjecteerd met 5 μM Colchicine. Hier hebben we een vermindering van de Rtnl1-GFP verrijking gemeten tot spindels (p < 0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met controles (A) (p < 0,001 voor alle monsters op T210). (D) ReepB-GFP embryo's geïnjecteerd met 5 μM Colchicine. We hebben een vermindering van reepB-GFP-verrijking gemeten tot spindels (p<0,001 voor alle monsters op T210) in vergelijking met controles (B) (p<0,001 voor alle monsters op T210). Dit cijfer is gewijzigd van Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Gistpasta21</td>
			<td>2. Druivenplaten21</td>
			<td>3. Heptane Lijm24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Voeg 7 gram actieve droge gist toe aan een conische 50 ml. Voeg 9 milliliter DI water toe en meng tot zelfs standvastigheid met een metalen spatel.</td>
			<td>2.1 Maak oplossing a: Voeg 6 gram agar toe aan 140 ml DI-water in een kolf van 250 ml en autoclave het.</td>
			<td>3.1 Vul een glazen scintillatie flacon met 50 centimeter dubbelzijdige tape.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Voeg 7 gram actieve droge gist toe aan een conische 50 ml. Voeg 9 milliliter DI water toe en meng tot zelfs standvastigheid met een metalen spatel.</td>
			<td>2.2 Maak oplossing b: Meng 0,1 gram methylacparbenen in 2 ml ethanol en voeg deze oplossing toe aan 60 ml druivensapconcentraat.</td>
			<td>3.2 Voeg 20 ml heptaan toe en verzegel glazen scintillatief met parafilm. Draai 's nachts bij kamertemperatuur.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Onmiddellijk na autoclaving oplossing a, meng in oplossing b en giet mengsel in 10 x 35mm perti gerechten. (maakt 35 druivenplaten)</td>
			<td>3.3 Verwijder plastic tapepuin door lijm in 2 15 ml conische buizen over te brengen en gedurende 15 minuten bij 3000 rpm te centen.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Laat druivenplaten 's nachts op kamertemperatuur zetten met plaatdeksels eraf. Dek platen af met deksels en bewaar in 4C° nadat ze zijn ingesteld.</td>
			<td>3.4 Lijm supernatant overbrengen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml voor opslag.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Recepten van media en oplossingen.

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Dit protocol maakt een gelijktijdige verwerving van meerdere embryo's binnen één beeldsessie mogelijk. Terwijl voorbeeldvoorbereiding is aangepast voor multi-point acquisitie met behulp van een high content analyzer, kunnen monsters die met dit protocol zijn bereid, worden afgebeeld op elke omgekeerde microscoop die multi-point acquisitie kan gebruiken. Om te beginnen, organiseren twee rijen van 15 tot 20 embryo's op een schone sectie van grote plaat met behulp van een ei picker tool.Lijn de embryo's aan hun ventrale kant in dezelfde oriëntatie met betrekking tot voorste en achterste uiteinden. Plak een spacer op een coverslip en streep 10 microliters van heptane lijm vaststelling van de blootgestelde coverslip glas inzet. Terwijl de lijm droogt, gebruik dan een scheermesje om een rechthoek rond de twee rijen embryo's te snijden.Snijd een tweede rechthoek naast de eerste en verwijder de tweede rechthoek met een rechte randzijde van een roestvrijstalen spatel. Schuif voorzichtig de rechte rand van de spatel onder de eerste rechthoek en verwijder deze. Plaats vervolgens de uitsnijding met embryo's aan de buitenzijde van een schaal van 3,5 centimeter.Onder een stereomicroscoop, lager een voorbereide coverslip over de embryo's en druk voorzichtig de twee rijen embryo's op de lijm. Als u geen microinjectie uitvoert, vult u de siliconenruimter halverwege de top met één-op-één halocarbonolie 700 tot halocarbonolie 27. Lijn de onderste randen van een vier-slide plaat adapter met dubbelzijdige tape.Dit voorkomt dat de dia beweegt tijdens de beeldvorming. Zorg ervoor dat u de tape niet in het pad van de objectieve lens plaatst. Monteer de coverlip op de vier-slide plaat adapter.Bij het micro-injecteren van de embryo's, plaats de coverslip met embryo's over een dia om te voorkomen dat de bodem van de coverslip vuil wordt tijdens uitdroging en micro-injectie. Desiccate de embryo's gedurende vijf tot 10 minuten, dan onmiddellijk bedekken met een-op-een halocarbon olie 700 tot halocarbon olie 27, het vullen van de siliconen spacer halverwege de top. Laad twee of drie microinjectienaalden met ongeveer twee microliters injectant met behulp van een verlengde laadpunt.Monteer een naald op de microinjector en druk de zuiger halverwege de punt, waardoor de luchtdruk in de glazen capillaire. Laat de glazen naald op een glazen schuif en snijd de punt van de naald met een nieuw nummer negen scheermes, snijden onder een hoek van 45 graden om een scherpe open punt te produceren. De injectant moet naar beneden stromen naar de onderkant van de punt zonder uit de naald te stromen.Voeg voorzichtig 20 microliter halocarbonolie toe over de punt van de naald en snijd deze opnieuw open onder een hoek van 45 graden. De injectant moet beginnen om snel te stromen, dus vergeet niet om de druk aan te passen door het intrekken van de zuiger. Gebruik de micromanipulator om de naald in het midden van het gezichtsveld te plaatsen.Til vervolgens de naald op en verwijder de glazen schuif van onder het. Plaats de embryo's op het stereomicroscoopstadium, onder de microinjectienaald en concentreer ze op 50 keer vergroting. Laat de naald zakken totdat deze in hetzelfde focusvlak komt als de embryo's.Het verplaatsen van de glijbaan met de ene hand en het bedienen van de microinjector met de andere, injecteren een rij embryo's. Hef de naald en draai de dia 180 graden om de tweede rij embryo's bloot te stellen aan de micro-injectie naald. Laat de naald zakken en injecteer de tweede rij embryo's.Dit protocol werd gebruikt om de rol van microtubuli in endoplasmische reticulumreorganisatie tijdens mitose in het Embryo Drosophila te onderzoeken. De effecten van verschillende microinjected drug behandelingen op ER reorganisatie werden kwantitatief vergeleken. Colchicine, dat nieuwe microtubuli polymerisatie voorkomt, bleek de lokalisatie van de ER tot spindelpolen tijdens mitose drastisch te verminderen.Time lapse imaging data werd verkregen voor 32 embryo's. Gemiddelde en maximale intensiteit metingen werden geanalyseerd uit 12, 800 regio's van belang met behulp van een aangepaste MATLAB script. Wanneer u dit protocol voor de eerste keer probeert, vergeet dan niet te lang te duren voor één stap, anders loopt u het risico uw ontwikkelingsfase te missen die u wilt image.Oefen dit protocol stap voor stap voordat u experimenten probeert. Onze methode van monstervoorbereiding vergemakkelijkt een gelijktijdige verwerving van meerdere embryo's tijdens één experiment, waardoor voldoende experimentele replica's worden genereert voor kwantitatieve analyse. Dit protocol kan helpen bij de ontwikkeling van embryologie overgang van kwalitatieve naar kwantitatieve beeldvorming experimenten.De mogelijkheid om meerdere embryo's beeld binnen een imaging sessie elimineert ook experimentele ruis tussen replica's.

drosophila-embryo-preparation-microinjection-for-live-cell-microscopy

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor de bereiding Drosophila embryo's voor live-imaging analyse wordt gepresenteerd. Onze-protocol zorgt voor vochtigheid en gas uit te wisselen en comprimeert niet de Drosophila embryo. Deze methode is geschikt voor het GFP-gebaseerde live beeldvorming van Drosophila embryo's met behulp van een stereomicroscoop of rechtop samengestelde microscoop.

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in...

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Voorbereiden Individuele Drosophila Egg Chambers voor Live Imaging

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Deze video beschrijft hoe u micro-invoegingen uitvoert die reagentia leveren in levende Drosophila-embryo's. Onderzoekers kunnen deze methode gebruiken om exogene verbindingen zoals nucleïnezuren en eiwitten te introduceren tijdens de vroege stadia van embryo-ontwikkeling. Het aanbevolen protocol demonstreert hoe de procedure voor injectie van een oplosbaar reagens moet worden opgezet en uitgevoerd - hier een fluorescerend eiwit voor live beeldvormingsexperimenten.

Micro-injection van Levende Embryo's Drosophila: Vroege Levering van Reagentia aan het Ontwikkelende Embryo

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Actomyosine contractiliteit speelt een belangrijke rol in cel- en weefselmorfogenese. Het is echter een uitdaging om actomyosinecontractiliteit in vivo acuut te manipuleren. Dit protocol beschrijft een optogenetisch systeem dat snel Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in Drosophila-embryo's remt, waardoor het onmiddellijke verlies van epitheliale spanning na de inactivatie van actomyosine in vivo wordt onthuld.

Optogenetische remming van Rho1-gemedieerde actomyosinecontractiliteit in combinatie met meting van epitheliale spanning in Drosophila-embryo's

Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo's om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.

Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie

Leer micro-injectie en live-celmicroscopie van Drosophila-embryo's met een geautomatiseerde high content analyzer. Deze methode ondersteunt kwantitatieve analyse van embryonale ontwikkeling.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer (Video) | JoVE Journal

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

Meer video's verkennen