Constructing Mutanten in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae stam 519/43
11 september 2020
Hier beschrijven we een S. pneumoniae serotype 1 stam 519/43 die genetisch kan worden gemodificeerd door gebruik te maken van zijn vermogen om op natuurlijke wijze DNA en een zelfmoordplasmide te verkrijgen. Als proof of principle werd een isogene mutant in het pneumolysine (ply) gen gemaakt.
Dit protocol is belangrijk omdat het genetische modificatie mogelijk maakt van een eerder niet-behandelbare serotype, waardoor het mogelijk wordt om onderzoek te doen en inzicht te krijgen in de serotype. Dit opent mogelijkheden voor biologisch werk zoals vaccinontwikkeling. De procedure zal worden gedemonstreerd door Vanessa S.Terra, een assistent-professor van de London School of Hygiene and Tropical Medicine.
Om te beginnen genereer plasmide pSD1 door een ligatie uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant van het pGEM-T Easy System I. Incubeer de reactie een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag transformeer chemisch competente E.coli Dh5-alpha met pSD1, door 50 microliter van de cellen gedurende 15 minuten op ijs te incuberen met drie microliter van de pSD1 ligatiereactie, en vervolgens de cellen bloot te stellen aan thermische schok en de cellen gedurende twee minuten op ijs te plaatsen.
Verwijder de cellen van het ijs en voeg 350 microliter SOC-medium toe, vervolgens incubeer de cultuur gedurende twee uur bij 37 graden Celsius en 120 RPM. Plateer de transformatie op Luria-Bertani agar aangevuld met 0,4 millimolair IPTG, 0,24 milligram per milliliter X-Gal voor blauw-witte selectie, en 100 microgram per milliliter ampicilline om ervoor te zorgen dat alle kolonies die op de plaat groeien de plasmidebackbone hebben. Kies drie witte kolonies die pSD1 bevatten en zet nachtelijke groei op in 10 milliliter L-B aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline.
Incubeer de culturen een nacht bij 37 graden Celsius met schudden. De volgende dag centrifugeer de culturen bij 3.082 G en gebruik het pellet voor plasmide-extractie. Na extractie van het plasmide DNA, zet een BamH1 restrictie-digestie op voor zowel het pSD1-plasmide als de spectinomycine-cassette.
Incubeer de restrictie-digestiereacties en controles bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Wanneer de restrictie voltooid is, analyseer de producten door middel van elektroforese en snij vervolgens de juiste band uit en zuiver deze met behulp van een commercieel kit. Voer vervolgens een ligatiereactie uit met behulp van het BamH1-verteerde pSD1 en spectinomycine.
Dit zal het plasmide pSD2 genereren. Transformeer pSD2 in chemisch-competente E.coli DH5-alpha zoals eerder beschreven. Selecteer vervolgens de transformanten die het pSD2-plasmide dragen op basis van hun vermogen om te groeien in LBA aangevuld met 100 microgram per milliliter spectinomycine en ampicilline en extraheer het plasmide DNA.
Bereid een nachtcultuur van S.pneumoniae 519/43 in BHI en laat deze statisch groeien bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. De volgende dag verdun de culturen 1:50 en 1:100 in 10 milliliter verse BHI-bouillon. Incubeer de cultuur statisch bij 37 graden Celsius tot de OD bij 595 nanometer tussen 0,05 en 0,1 ligt.
Zodra de juiste OD is bereikt, neem 860 microliter cultuur en breng het over in een microcentrifugebuis. Voeg 100 microliter van 100-millimolair natriumhydroxide toe, 10 microliter van 20%BSA, 10 microliter van 100-millimolair calciumchloride, twee microliter van 50 nanogram per milliliter CSP1 en 500 nanogram van pSD2. Incubeer de reactie statisch bij 37 graden Celsius gedurende drie uur.
Vervolgens plaatst u 330 microliter op 5% bloedagar platen aangevuld met 100 microgram per milliliter spectinomycine elke uur gedurende een incubatieperiode van drie uur. Bewerk de platen vervolgens een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Plaats spectinomycine-resistente kolonies op een andere bloedagarplaat aangevuld met 100 microgram per milliliter spectinomycine en op bloedagarplaten aangevuld met 100 microgram per milliliter ampicilline, wat test op de aanwezigheid van de plasmidebackbone.
Incubeer beide sets platen een nacht. Correcte assemblage van pSD2 werd bevestigd door restrictie-digestie. pSD2 werd vervolgens gebruikt om 519.43 wild-type cellen te transformeren.
Kolonies die groeien op spectinomycine na een nachtelijke incubatie werden beschouwd als positieve transformanten. Fenotypische bevestiging van de pneumolysinemutatie werd uitgevoerd door hemolytische activiteit te beoordelen voor D39, 519/43 wild-type en mutant 519/43 delta ply. Dit werd vergeleken met hemolyse van rode bloedcellen door 0,5% saponine, wat als 100% wordt beschouwd. De mutant verloor zijn vermogen om rode bloedcellen te lyseren.
Alle positieve kolonies werden verder bevestigd door middel van sequencing om de locatie van de insertie te beoordelen. Er werden primers met bindingsplaatsen buiten de homologieregio gebruikt. Bij het uitvoeren van de transformatiereactie is het belangrijk om de reagentia in de juiste volgorde toe te voegen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor genetische modificatie van een S. pneumoniae serotype 1 stam 519/43, gebruikmakend van zijn natuurlijke vermogen om DNA te verwerven. De studie demonstreert de creatie van een isogene mutant in het pneumolysine (ply) gen, wat de weg vrijmaakt voor verder onderzoek.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genetische manipulatie
- Pathogeenonderzoek
Achtergrond
- Streptococcus pneumoniae is een belangrijk humaan pathogeen.
- Genetische modificatie van dit serotype is uitdagend geweest.
- Inzicht in de genetica kan helpen bij vaccinontwikkeling.
- Deze studie biedt een nieuwe benadering voor genetische manipulatie.
Doel van het onderzoek
- Om genetische modificatie van S. pneumoniae serotype 1 mogelijk te maken.
- Om een mutante stam voor onderzoeksdoeleinden te creëren.
- Om studies naar pneumolysine en zijn rol in pathogenese te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Generatie van plasmide pSD1 met behulp van het pGEM-T Easy Systeem I.
- Transformatie van E. coli Dh5-alpha met de ligatiereactie.
- Incubatie en thermische schok procedures voor competente cellen.
- Verificatie van genetische modificaties door middel van standaard moleculaire technieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van een isogene mutant in het ply gen.
- Demonstratie van de effectiviteit van het protocol voor genetische modificatie.
- Mogelijke implicaties voor vaccinonderzoek en -ontwikkeling.
- Totstandbrenging van een nieuw model voor het bestuderen van S. pneumoniae.
Conclusies
- De methode maakt genetische manipulatie mogelijk van een eerder moeilijk te bewerken serotype.
- Dit opent nieuwe wegen voor biologisch onderzoek.
- Verdere studies kunnen deze techniek gebruiken voor vaccinontwikkeling.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Genetic modification of Streptococcus pneumoniae serotype 1 has been a longstanding barrier in infectious disease research, particularly for vaccine and therapeutic target validation in high-burden regions. This protocol enables functional genomics in a clinically relevant strain, supporting mechanistic de-risking of virulence factors like pneumolysin. By establishing a reliable mutagenesis system, it improves predictive confidence in target selection and accelerates preclinical evaluation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through isogenic mutant construction in a clinically relevant serotype.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional validation of virulence genes such as ply.
- Strategic Value: Supports target de-risking by linking genotype to phenotype in infection models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates defined mutant strains for standardized phenotypic assays, including hemolysis and infection models.
- Operational Value: Establishes a workflow for generating isogenic controls essential for assay reproducibility.
- Strategic Value: Enables scalable screening of genetic variants using selectable markers and counter-selection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates phenotype-genotype correlation in vivo using intraperitoneal and intranasal challenge models.
- Operational Value: Produces validated mutant stocks for downstream efficacy and safety testing.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing serotype-specific pathogenic mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling target validation through genetic manipulation prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene knockout to clarify pathway involvement in pathogenesis.
- Screening: Generates isogenic mutant panels for comparative phenotypic screening in cell-based and animal models.
- Analytics: Enables quantitative measurement of dependent variables such as hemolytic activity and bacterial burden in tissues.
- Translational Research: Connects molecular findings to preclinical outcomes by comparing infection phenotypes across serotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for serial mutagenesis applicable to other vaccine candidate antigens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in serotype-specific pathogenesis.
- Operational Value: Delivers a standardized, reproducible method for generating defined genetic mutants in S. pneumoniae.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by enabling early assessment of target essentiality and virulence contribution.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing functional data on virulence factors before costly preclinical investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, bacterial transformation, and allelic exchange techniques.
- Dependent on access to electroporation or chemical transformation systems for E. coli and S. pneumoniae.
- Necessitates standardized protocols for DNA preparation, restriction digestion, and ligation to ensure plasmid integrity.
- Requires biosafety level 2 containment for handling pathogenic S. pneumoniae strains.
- Success depends on optimizing competence-inducing conditions, including CSP1 concentration and calcium chloride levels.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Generation of Plasmid pSD1 and Chemical Transformation of E. coli Dh5α
2:03
Plasmid DNA Extraction, Restriction Digestion of pSD1 and Spectinomycin Gene, and Assembly of pSD2
3:03
Transformation of S. pneumoniae Strain 519/43
4:46
Results: Confirmation of Mutagenesis
5:43
Conclusion
