Name: High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer een high-throughput screeningsmethode om chemische verbindingen te identificeren die bacteriële persistentie beïnvloeden. Dit protocol is aanpasbaar voor drug panels en genbibliotheken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de leden van Orman Lab bedanken voor hun waardevolle inbreng tijdens dit onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door de NIH/NIAID K22AI125468 career transition award en een University of Houston startup grant.

1. Bereiding van groeimedium, ofloxacineoplossing en E. coli-celvoorraden
<ol><li>Normaal Luria-Bertani (LB) medium: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L natriumchloride (NaCl) en 5 g/L gistextract toe in gedeïoniseerd (DI) water. Steriliseer het medium door autoclaaf.</li>
	<li>LB agar platen: Voeg 10 g/L trypton, 10 g/L NaCl, 5 g/L gistextract en 15 g/L agar toe aan DI water en steriliseer het medium door autoclaaf. Giet bij de gewenste temperatuur (~55 °C) ~30 ml agar medium in vierkante platen (10 x 10 cm). Droog de platen en bewaar ze op 4 °C.</li>
	<li>Gemodificeerd LB-medium: Voeg 10 g/L trypton en 5 g/L gistextract toe in DI-water. Steriliseer het medium door autoclaaf.</li>
	<li>Gemodificeerd LB-medium inclusief osmolyt: Meng 2x gemodificeerd LB-medium met een 2x osmolyte-oplossing in gelijke volumes. Om 2x gemodificeerd LB-medium te bereiden, voegt u 20 g/L trypton en 10 g/L gistextract toe in DI-water en steriliseert u door autoclaaf. Om de 2x osmolyte-oplossing te bereiden, lost u de osmolyt van belang (2x hoeveelheid) op in DI-water en filtert u de oplossing vervolgens. OPMERKING: Het osmolyt van belang en de concentraties ervan kunnen worden bepaald aan de hand van de fenotype microarray screeningstesten (zie Protocol 4). Het geteste osmolyt en de bijbehorende 2x concentratie kunnen echter worden aangepast afhankelijk van de aard van het onderzoek. Om bijvoorbeeld de impact van 1 mM natriumchloride te bestuderen, zou een 2x osmolyte-oplossing een natriumchlorideoplossing van 2 mM zijn.</li>
	<li>Ofloxacine stamoplossing (5 mg/ml): Voeg 5 mg ofloxacine (OFX) zout toe in 1 ml DI-water. Voeg 10 μL 10 M natriumhydroxide toe om de oplosbaarheid van OFX in water te verhogen en filtreer vervolgens de oplossing. Bereid aliquots voor en bewaar bij -20 °C. OPMERKING: Ofloxacine is een chinolonantibioticum dat veel wordt gebruikt voor zowel groeiende als niet-groeiende bacteriële cellen14,21. De minimale remmende concentratie (MIC) van OFX voor E. coli MG1655-cellen ligt binnen het bereik van 0,039–0,078 μg/ml19,20. Merk ook op dat andere antibiotica zoals ampicilline en kanamycine vaak worden gebruikt in persisteronderzoek. De keuze van antibiotica is afhankelijk van de aard van het onderzoek.</li>
	<li>
E. Coli MG1655-celvoorraden: Ent 2 ml normaal LB-medium in met een enkele kolonie in een reageerbuis van 14 ml (snap-capped) en kweek de cellen in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C. Wanneer de cellen de stationaire fase bereiken, mengt u 500 μL van de celkweek met 500 μL 50% glycerol (steriel) in een cryogene flacon en bewaart u deze bij -80 °C.</li>
</ol>2. Voortplanting van cellen om reeds bestaande persistenten te elimineren
<ol><li>Om een nachtkweek voor te bereiden, schraapt u een kleine hoeveelheid cellen uit een bevroren celvoorraad met een steriele pipetpunt (ontdooi de glycerolcelvoorraad niet) en en ent u de cellen in 2 ml gemodificeerd LB-medium in een snap-capped reageerbuis van 14 ml. Kweek de cellen in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C gedurende 12 uur.</li>
	<li>Eerste vermeerdering<ol>
<li>Breng na 12 uur 250 μL nachtkweek over naar 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml bedekt met een steriele aluminiumfolie.</li>
		<li>Kweek de celkweek in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C totdat cellen de midden-exponentiële fase bereiken (OD600 = 0,5).</li>
		<li>Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) met behulp van een microplaatlezer om de 30 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tweede vermeerdering<ol>
<li>Verdun bij OD600 = 0,5 250 μL celkweek uit de eerste kolf tot 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml.</li>
		<li>Kweek de tweede celkweek in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C tot OD600=0,5.</li>
		<li>Meet de optische dichtheid elke 30 minuten. OPMERKING: Een nachtcultuur kan een aanzienlijke hoeveelheid persistentiecellen4,5,22bevatten . De hierboven beschreven verdunnings-/groeicyclusmethode5 kan worden gebruikt om deze reeds bestaande persistenten te elimineren voordat de cellen naar microarrays worden overgebracht. Hun eliminatie kan worden gevalideerd door persistenterniveaus van overnight-culturen te kwantificeren met de in Protocol 3 beschreven test. Deze methode is reeds gevalideerd in een eerdere studie19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Valideren van de eliminatie van reeds bestaande persistentercellen
<ol><li>Verdun na de tweede vermeerdering (zie stap 2.3) 250 μL van de celkweek (OD600 = 0,5) in 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml. OPMERKING: Verdun voor de controles 250 μL nachtkweek (zie stap 2.1) in 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml. Alvorens de cellen in de kolf over te brengen, moet de celdichtheid van de nachtkweek worden aangepast in vers gemodificeerd LB-medium om OD600 = 0,5 te verkrijgen.</li>
	<li>Voeg 25 μL OFX-stamoplossing (5 mg/ml) toe aan de celsuspensie en schud de kolf voorzichtig om de testcultuur homogeen te maken. De uiteindelijke concentratie OFX is 5 μg/ml in de testcultuur.</li>
	<li>Incubeer de testcultuur in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C.</li>
	<li>Breng elk uur tijdens de behandeling (inclusief 0 uur, het tijdstip voordat OFX in de testcultuur wordt toegevoegd) 1 ml van de testcultuur over van de kolf naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de testcultuur in de microcentrifugebuis gedurende 3 min op 17.000 x g.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig 950 μL van het supernatant zonder de celkorrel te verstoren.</li>
	<li>Voeg 950 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de microcentrifugebuis.</li>
	<li>Herhaal de wasstappen 3,5-3,7 gedurende in totaal 3x totdat de antibioticaconcentratie onder de minimale remmende concentratie (MIC) ligt.</li>
	<li>Na de laatste wasbeurt de celkorrel opnieuw in 100 μL PBS-oplossing, wat resulteert in een 10x geconcentreerd monster.</li>
	<li>Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun zes keer in 90 μL PBS-oplossing met behulp van een 96 goed ronde bodemplaat.</li>
	<li>Spot 10 μL verdunde celsuspensussingen op antibioticavrije verse agarplaten. Om de detectielimiet te verhogen, plaat de resterende 90 μL celsuspensie op een verse agarplaat.</li>
	<li>Incubeer de agarplaten gedurende 16 uur bij 37 °C en tel vervolgens de kolonievormende eenheden (CFUs). Houd rekening met de verdunningspercentages bij de berekening van het totale aantal CFUs in 1 ml testcultuur. Kill curves worden gegenereerd door het plotten van de logaritmische CFU-waarden met betrekking tot de duur van de antibioticabehandeling. OPMERKING: Een 6 uur OFX-behandeling is voldoende om een bifasische kill curve te verkrijgen voor E. coli cellen19,20. Het persistentieniveau van de gepropageerd cellen (gemeten aan de hand van CFU-tellingen van 6 uur) moet aanzienlijk lager zijn dan dat van de nachtcultuur. De procedures beschreven in Protocol 2 en 3 kunnen worden uitgevoerd met regelmatige LB, afhankelijk van het onderzoeksontwerp.</li>
</ol>4. Microarray plaat screenings 
<ol><li>Microarray-celculturen voorbereiden<ol>
<li>Breng 250 μL exponentiële fasecellen over naar 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een centrifugebuis van 50 ml. Meng de celsuspensie voorzichtig om deze homogeen te maken. OPMERKING: De exponentiële fasecellen (OD600 = 0,5) worden verkregen uit de tweede propagatiestap (zie stap 2.3).</li>
		<li>Breng de verdunde celsuspensie over in een steriel reservoir van 50 ml.</li>
		<li>Breng met behulp van een meerkanaals pipet 150 μL van de celsuspensie over naar elke put van een microarray, d.w.z. een plaat van 96 put die verschillende osmolyten bevat. OPMERKING: Putten zonder osmolyten dienen als besturingselementen.</li>
		<li>Bedek de microarray met een gasdoorlatend afdichtingsmembraan.</li>
		<li>Incubeer de plaat in een orbitale shaker bij 37 °C en 250 tpm gedurende 24 uur. OPMERKING: In deze experimenten werden in de handel verkrijgbare platen gebruikt, zoals Phenotype Microarrays (PM-9 en PM-10) die een breed scala aan osmolyten, pH-buffers en andere chemicaliën in gedroogde toestand bij verschillende concentraties omvatten. Deze microarrays zijn in half-gebied 96 goed plaatformaten. De kweekvolumes moeten worden aangepast afhankelijk van het type platen dat wordt gebruikt. Microarrays kunnen ook handmatig worden gegenereerd (zie hieronder).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Handmatige bereiding van microarray platen<ol>
<li>Breng 75 μL 2x osmolyte-oplossingen over in de putten van een 96-putplaat met een half oppervlak.</li>
		<li>Breng 500 μL exponentiële fasecellen over naar 25 ml 2x gemodificeerd LB-medium in een centrifugebuis van 50 ml. Meng de celsuspensie voorzichtig om deze homogeen te maken. OPMERKING: De inentingssnelheid werd aangepast om consistent te zijn met het microarray screening protocol beschreven in 4.1.</li>
		<li>Voeg 75 μL van de celsuspensie toe aan elke put van de 96-putplaat met 2x osmolyte-oplossingen.</li>
		<li>Incubeer de plaat in een orbitale shaker bij 37 °C en 250 tpm gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het voorbereiden van persistenter assay platen<ol>
<li>Bereid 25 ml gemodificeerd LB-medium met 5 μg/ml OFX in een centrifugebuis van 50 ml en breng dit medium over in een steriel reservoir.</li>
		<li>Breng 190 μL gemodificeerd LB-medium met OFX uit het reservoir over in elke put van een generieke flat-bottom 96 putplaat (persister-assay plate) met behulp van een meerkanaals pipet.</li>
		<li>Verwijder de microarray uit de shaker (na 24 uur cultiveren) en breng 10 μL celculturen over van de microarray naar de putten van de persister-assay plate, die gemodificeerd LB-medium met OFX bevatten.</li>
		<li>Neem 10 μL celsuspensingen uit de persistenter-assay plaat en verdun driemaal in 290 μL PBS-oplossing met behulp van een 96-putplaat met ronde bodem en een meerkanaals pipet.</li>
		<li>Na de seriële verdunning spot 10 μL van alle serieel verdunde celsuspensusingen op antibioticavrije verse agarplaten met behulp van een meerkanaalspipet.</li>
		<li>Incubeer de persister-assay plaat (bereid in stap 4.3.3) in een orbitale shaker bij 37 °C en 250 tpm gedurende 6 uur na het bedekken van de plaat met een gasdoorlatend afdichtingsmembraan.</li>
		<li>Neem na 6 uur incubatie in een shaker de persister-assay plate eruit en herhaal de stappen 4.3.4-4.3.5.</li>
		<li>Incubeer de agarplaten gedurende 16 uur bij 37 °C en tel vervolgens CFUs. De CFU-niveaus vóór en 6 uur na de antibioticabehandeling maken het mogelijk om de persistentiefractie in elke put te berekenen. De CFU telt voordat de OFX-behandeling ook helpt bij het beoordelen van de effecten van osmolyten en op de levensvatbaarheid van E. coli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Valideren van de vastgestelde voorwaarden
<ol><li>Breng 250 μL van de exponentiële fasecellen over van stap 2.3 naar 25 ml vers gemodificeerd LB-medium dat het osmolyt bevat dat is geïdentificeerd uit de microarrayscreening (zie Protocol 4).</li>
	<li>Incubeer de kolf in een orbitale shaker bij 250 tpm en 37 °C gedurende 24 uur.</li>
	<li>Verwijder na 24 uur de kolf uit de shaker en breng 250 μL van de celkweek over op 25 ml vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 ml.</li>
	<li>Voeg 25 μL OFX-stamoplossing (5 mg/ml) toe aan de celsuspensie en schud de kolf voorzichtig om de testcultuur homogeen te maken. Incubeer de kolf in een shaker bij 37 °C en 250 tpm.</li>
	<li>Breng elk uur tijdens de behandeling 1 ml van de testcultuur over van de kolf naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de testcultuur in de microcentrifugebuis gedurende 3 min op 17.000 x g.</li>
	<li>Verwijder 950 μL supernatant en voeg 950 μL PBS toe.</li>
	<li>Herhaal de wasstappen 5.6 en 5.7 gedurende 3x.</li>
	<li>Na de laatste wasbeurt de celkorrel opnieuw in 100 μL PBS-oplossing.</li>
	<li>Neem 10 μL van de celsuspensie en verdun 6x in 90 μL PBS-oplossing met een 96 goed ronde bodemplaat.</li>
	<li>Spot 10 μL van de verdunde celsuspensussingen op een antibioticavrije verse agarplaat. Om de detectielimiet te verhogen, plaat de resterende 90 μL celsuspensie op een verse agarplaat.</li>
	<li>Incubeer de agarplaat gedurende 16 uur bij 37 °C en tel vervolgens CFUs.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
<li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li>
<li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li>
<li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li>
<li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li>
<li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177(2019).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li>
<li>Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760(2009).</li>
<li>Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li>
<li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li>
<li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983(2015).</li>
<li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+%28p%29ppGpp+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li>
<li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393(2020).</li>
<li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472(2020).</li>
<li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li>
<li>Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+The+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008(2006).</li>
<li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li>
<li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

De hier beschreven persistentietest met hoge doorvoer is ontwikkeld om de effecten van verschillende chemicaliën op de persistentie van E. coli te verduidelijken. Naast commerciële PM-platen kunnen microarrays handmatig worden geconstrueerd zoals beschreven in stap 4.2. Bovendien is het hier gepresenteerde protocol flexibel en kan het worden gebruikt om andere microarrays te screenen, zoals medicijnpanelen en celbibliotheken, die in 96 putplaatformaten zijn. De experimentele omstandigheden, waaronder de groeifas...

Bacteriële culturen bevatten een kleine subpopulatie van persistente cellen die tijdelijk tolerant zijn voor ongewoon hoge niveaus van antibiotica. Persistentiecellen zijn genetisch identiek aan hun antibioticagevoelige verwanten en hun overleving is toegeschreven aan voorbijgaande groeiremming1. Persistercellen werden voor het eerst ontdekt door Gladys Hobby2, maar de term werd voor het eerst gebruikt door Joseph Bigger toen hij ze identificeerde in met penicilline behandelde Staphylococcus pyogenesculturen 3. Een baanbrekende studie gepubliceerd door Balaban et al.4 ontdekte twee persistentietypen: type I-varianten die voornamelijk worden gevormd door passage door de stationaire fase, en type II-varianten die continu worden gegenereerd tijdens de exponentiële groei. Persistenten worden gedetecteerd door clonogene overlevingstesten, waarbij kweekmonsters met verschillende tussenpozen worden genomen tijdens antibioticabehandelingen, gewassen en geplateerd op een typisch groeimedium om de overlevende cellen te tellen die kunnen koloniseren bij afwezigheid van antibiotica. Het bestaan van persistenten in een celkweek wordt beoordeeld door een bifasische kill curve4,5 waarbij het initiële exponentiële verval wijst op de dood van antibioticagevoelige cellen. De moordtrend neemt echter in de loop van de tijd af, wat uiteindelijk leidt tot een plateaugebied dat de overlevende persistentiecellen vertegenwoordigt.
Persistercellen zijn geassocieerd met verschillende ziekten zoals tuberculose6, cystische fibrose7, candidiasis8 en urineweginfecties9. Bijna alle tot nu toe geteste micro-organismen bleken persistenterfenotypes te genereren, waaronder hoogpathogene Mycobacterium tuberculosis6, Staphylococcus aureus10, Pseudomonas aeruginosa7 en Candida albicans8. Recente studies leveren ook bewijs voor de opkomst van multidrugresistente mutanten uit persistenter subpopulaties11,12. Uit aanzienlijke inspanningen op dit gebied is gebleken dat persistentiemechanismen zeer complex en divers zijn; van zowel stochastische als deterministische factoren geassocieerd met de SOS-respons13,14, reactieve zuurstofsoorten (ROS)15, toxine/antitoxine (TA) systemen16, autofagie of zelfvertering17 en ppGpp-gerelateerde strenge respons18 is bekend dat persistentievorming wordt vergemakkelijkt.
Ondanks aanzienlijke vooruitgang bij het begrijpen van het persistentiefenotype, zijn de effecten van osmolyten op bacteriële persistentie niet volledig begrepen. Aangezien het behoud van optimale osmotische druk een noodzaak is voor de groei, goede werking en overleving van cellen, kan een diepgaande studie van osmolyten leiden tot potentiële doelwitten voor anti-persisterstrategieën. Hoewel moeizame screening met hoge doorvoer een zeer effectieve benadering is voor het identificeren van metabolieten en andere chemische stoffen die een cruciale rol spelen in de persistentie fenotype19,20. In dit werk zullen we onze gepubliceerde methode19bespreken , waarbij we microarrays hebben gebruikt, d.w.z. 96 putplaten die verschillende osmolyten bevatten (bijv. natriumchloride, ureum, natriumnitriet, natriumnitraat, kaliumchloride), om osmolyten te identificeren die de persistentie van E. coli aanzienlijk beïnvloeden.

<table><tbody><tr><td>14-ml test tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>E. coli strain MG1655</td><td>Princeton University</td><td></td><td>Verkregen van Brynildsen lab</td></tr><tr><td>Flat-bottom 96-well plate</td><td>USA Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>Gas permeable sealing membrane</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>Gesteriliseerd door gammastraling en vrij van cytotoxines</td></tr><tr><td>Half-area flat-bottom 96-well plate</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>Moleculaire genetica kwaliteit</td></tr><tr><td>Ofloxacin salt</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge;97,5</td></tr><tr><td>Phenotype microarray (PM-9 en PM-10)</td><td>Biolog</td><td>N/A</td><td>PM-9 en PM-10 platen bevatten respectievelijk verschillende osmolyten en buffers</td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plate</td><td>USA Scientific</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Gecertificeerd ACS kwaliteit</td></tr><tr><td>Sodium nitrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424345000</td><td>ACS reagenskwaliteit</td></tr><tr><td>Sodium nitrite</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA186680B</td><td>98% zuiverheid</td></tr><tr><td>Square petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td>Moleculaire genetica kwaliteit</td></tr><tr><td>Varioskan lux multi mode microplate reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>Gebruikt voor optische dichtheidsmeting bij 600 nm</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-100</td><td>Moleculaire genetica kwaliteit</td></tr></tbody></table>

high-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacteriële persistenten worden gedefinieerd als een kleine subpopulatie van fenotypische varianten met het vermogen om hoge concentraties antibiotica te tolereren. Ze zijn een belangrijk gezondheidsprobleem omdat ze zijn geassocieerd met terugkerende chronische infecties. Hoewel bekend is dat stochastische en deterministische dynamiek van stressgerelateerde mechanismen een belangrijke rol speelt bij persistentie, worden mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische switch van/naar de persistentietoestand niet volledig begrepen. Hoewel persistentiefactoren die worden veroorzaakt door omgevingssignalen (bijv. uitputting van koolstof-, stikstof- en zuurstofbronnen) uitgebreid zijn bestudeerd, moeten de effecten van osmolyten op persistentie nog worden bepaald. Met behulp van microarrays (d.w.z. 96 putplaten met verschillende chemicaliën) hebben we een aanpak ontworpen om de effecten van verschillende osmolyten op escherichia coli persistentie op een hoge doorvoer manier op te helderen. Deze aanpak is transformerend omdat het gemakkelijk kan worden aangepast voor andere screeningarrays, zoals medicijnpanels en gen knock-outbibliotheken.

Figuur 1 beschrijft ons experimentele protocol. De verdunnings-/groeicyclusexperimenten (zie Protocol 2) werden aangepast aan een studie uitgevoerd door Keren et al.5 om de persistenten afkomstig van de nachtelijke culturen te elimineren. Figuur 2A is een representatief beeld van agarplaten die worden gebruikt om CFU-niveaus van celculturen voor en na OFX-behandeling te bepalen. In deze experimenten werden cellen gekweekt in gemodificeerd...

In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.

High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om omstandigheden te identificeren die een aanzienlijke invloed kunnen hebben op de bacteriële persistentie op een manier met hoge doorvoer. Deze methode is gemakkelijk aan te passen aan het scherm voor verschillende gebieden, zoals medicijnpanelen, genbibliotheken en meer. Omdat de methode verschillende substappen omvat, die tegelijkertijd moeten worden uitgevoerd, kan visuele demonstratie onderzoekers helpen om hun timing te beheren om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.Begin met het voorbereiden van microarray celculturen. Breng 250 microliter exponentiële fasecellen over naar 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Meng vervolgens voorzichtig de celsuspensie om deze homogeen te maken.Breng de verdunde celsuspensie over in een steriel reservoir van 50 milliliter. Breng met behulp van een meerkanaals pipet 150 microliters van de celsuspensie over naar elke put van een microarrayplaat die verschillende chemicaliën bevat. Microarrays kunnen ook handmatig worden gegenereerd volgens de methode die in het teksthandschrift wordt beschreven.Bedek de microarrayplaat met een gasdoorlatend plafondmembraan en incubeer deze gedurende 24 uur in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Om persistenter testplaten te maken, bereidt u 25 milliliter gemodificeerd LB-medium met vijf microgram per milliliter Ofloxacine in een centrifugebuis van 50 milliliter en brengt u dit medium over in een steriel reservoir. Breng 190 microliters van het gemodificeerde LB-medium over in elke put van een generieke vlakke bodem 96 putplaat.Verwijder na de incubatie van 24 uur de microarray uit de shaker en breng 10 microliters celculturen over van de microarray naar de putten van de persistentertestplaat die gemodificeerd LB-medium met Ofloxacine bevat. Neem 10 microliters celsuspensingen uit de persister essayplaat en verdun deze drie keer in 290 microliters PBS-oplossing met behulp van een ronde bodem 96 putplaat en een meerkanaals pipet. Spot vervolgens 10 microliters van alle serieel verdunde celsuspensusingen op antibioticavrije verse agarplaten.Bedek de persistentertestplaat met een gasdoorlatend plafondmembraan en incubeer deze zes uur lang in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Herhaal na de incubatie van zes uur de seriële verdunning en het spotten op agarplaten. Incubeer de agarplaten gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius.Tel dan de kolonievormende eenheden of CFUs. Gebruik de CFU-spiegels vóór en zes uur na de antibioticabehandeling om de persistentiefractie in elke put te berekenen. De CFU telt voordat de OFX-behandeling ook helpt bij het beoordelen van de effecten van osmolieten op de levensvatbaarheid van e coli.Breng 250 microliter exponentiële fasecellen over naar 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium met de osmoliet die is geïdentificeerd uit de microarrayscreening. Incubeer de kolf in een orbitale shaker bij 250 RPM en 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Verwijder na 24 uur de kolf uit de shaker en breng 250 microliter van de celkweek over op 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 milliliter.Voeg 25 microliters Ofloxacine-bouillonoplossing toe aan de celsuspensie en schud de kolf zachtjes om de testcultuur homogeen te maken. Incubeer de kolf in een shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Breng elk uur tijdens de behandeling, inclusief een tijdstip voor toevoeging van Ofloxacine, één milliliter van de testkweek over van de kolf naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer deze gedurende drie minuten op 17.000 maal G.Verwijder 950 microliter supernatant en was de cellen driemaal met 950 microliter PBS. Na de laatste wasbeurt de celkorrel opnieuw opschorten in 100 microliter PBS-oplossing. Neem 10 microliters van de celsuspensie en verdun deze zes keer serieel met 90 microliters PBS in een 96 goed ronde bodemplaat.Spot 10 microliters van de verdunde celsuspensussingen op een antibioticavrije agarplaat. Om de detectielimiet te verhogen, plaat de resterende 90 microliters celsuspensie op een verse agarplaat. Incubeer de platen gedurende 16 uur op 37 graden Celsius en tel cfus.Een representatief beeld van agarplaten die worden gebruikt om CFU-niveaus van celculturen voor en na OFX-behandeling te bepalen, wordt hier weergegeven. De eerste kolom is de controlegroep. De tweede kolom bevat cellen die zijn gekweekt in 100 millimolair natriumnitraat en de derde kolom bevat cellen die zijn gekweekt in 60 millimolair natriumnitraat.Voor de eenvoud zijn hier slechts twee osmolieten op gericht. Een grafische weergave van de CFU-gegevens van de platen en persistenterfracties van de celculturen getest in 96 putplaten worden hier weergegeven. Om de fracties te berekenen, werden persistentertellingen genormaliseerd tot de celtellingen die vóór de antibioticabehandeling werden verkregen.Om byphasic kill curves te genereren, werden de cellen gedurende 24 uur gekweekt in 25 milliliter gemodificeerd LB-medium met de aangegeven osmolieten en verbijsterde kolven, en vervolgens overgebracht naar persistenter assay flasks voor persistenter enumeration. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het spotten van de cellen op agarplaat arbeidsintensief is en focus vereist. Een fout tijdens de stap kan leiden tot kruisbesmetting onder de geteste omstandigheden.Het is dus belangrijk om voorafgaand aan het experiment te oefenen met het spotten van meerdere monsters tegelijk. Volgens dit protocol kunnen medicijnpanels en mutante celbibliotheken worden gescreend om de effecten op de persistentie te bestuderen. Met deze screening hebben we een aantal osmolieten en PS-condities geïdentificeerd die een significante impact hebben op bacteriële persistentie.

high-throughput-screening-chemical-compounds-to-elucidate-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Venkateswaran, S., et al. High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a high-throughput method to identify bacteria-repellent polymers using a microarray slide exposed to mixed bacterial cultures. Bacterial binding is assessed by DAPI fluorescence, where reduced signal indicates polymers with minimal surface attachment.

High-Throughput Identification of Bacteria-Repellent Polymers via Microarray Screening

In this video, we demonstrate a method to evaluate the effect of osmolytes on the formation of bacterial persisters. The bacterial cells are first exposed to osmolytes to induce osmotic stress, triggering persister formation, then treated with antibiotics to enumerate the persisters.

In Vitro Persister Assay: A Method to Evaluate the Effect of Osmolytes on Bacterial Persistence

Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Dit artikel beschrijft de high-throughput assay die met succes heeft bewezen grote bibliotheken van kleine moleculen te screenen op hun potentiële vermogen om cellulaire niveaus van cyclisch di-GMP manipuleren Pseudomonas aeruginosa, die een nieuw krachtig hulpmiddel voor antibacteriële geneesmiddelen en beproeving in.

Oprichting van een High-throughput Setup voor het screenen van kleine moleculen die Moduleer c-di-GMP Signalering in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

De kolen agar rezazurin assay (CARA) is een semi-kwantitatief, medium-doorvoer methode om de activiteit van testmiddelen te beoordelen tegen mycobacteriën die zich vermenigvuldigen, niet vermenigvuldigen of beide. De CARA maakt een snelle evaluatie mogelijk van tijd- en concentratie-afhankelijke activiteit en identificeert parameters om na te streven door kolonievormende eenheid (CFU) assays.

Visualisatie van de Charcoal Agar Resazurin Assay voor Semi-kwantitatieve, Medium-throughput bepalen van het aantal mycobacteriën

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Hier beschrijven we een protocol dat is een aanpasbaar, hele gastheer, hoge-content screening tool die kan worden gebruikt om te studeren gastheer-pathogeen interacties en worden gebruikt voor drugontdekking.

Een High-throughput, High-inhoud, vloeistof gebaseerde C. elegans Pathosystem

De co-cultuur interactie testen gepresenteerd in dit protocol zijn goedkoop, hoge doorvoer, en eenvoudig. Deze testen kunnen worden gebruikt om microbiële interacties in co-cultuur te observeren, interactie patronen te identificeren en het remmende potentieel van een microbiële stam van belang tegen menselijke en milieu pathogenen te karakteriseren.

Co-Culture-tests met hoge doorvoer voor het onderzoek naar microbiële interacties

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Deze studie ontwikkelde een test voor high-throughput screening tegen Mycobacterium abscessus met een recent gecreëerde dubbele reporterstam, waarbij fluorescentie en luminescentie worden gebruikt om de levensvatbaarheid van bacteriën snel te beoordelen. Dit protocol zal relevant zijn voor onderzoekers die nieuwe geneesmiddelen willen screenen op deze resistente bacterie.

Ontwikkeling van tests voor high-throughput medicijnscreening tegen mycobacteriën

Leer een high-throughput screeningsmethode om chemische verbindingen te identificeren die bacteriële persistentie beïnvloeden. Dit protocol is aanpasbaar voor drug panels en genbibliotheken.

High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen

Meer video's verkennen