High-throughput screening van chemische verbindingen om hun effecten op bacteriële persistentie op te helderen
23 februari 2021
In dit methodedocument presenteren we een screeningsstrategie met hoge doorvoer om chemische verbindingen, zoals osmolyten, te identificeren die een aanzienlijke impact hebben op de bacteriële persistentie.
Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om omstandigheden te identificeren die een aanzienlijke invloed kunnen hebben op de bacteriële persistentie op een manier met hoge doorvoer. Deze methode is gemakkelijk aan te passen aan het scherm voor verschillende gebieden, zoals medicijnpanelen, genbibliotheken en meer. Omdat de methode verschillende substappen omvat, die tegelijkertijd moeten worden uitgevoerd, kan visuele demonstratie onderzoekers helpen om hun timing te beheren om nauwkeurige resultaten te verkrijgen.
Begin met het voorbereiden van microarray celculturen. Breng 250 microliter exponentiële fasecellen over naar 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium in een centrifugebuis van 50 milliliter. Meng vervolgens voorzichtig de celsuspensie om deze homogeen te maken.
Breng de verdunde celsuspensie over in een steriel reservoir van 50 milliliter. Breng met behulp van een meerkanaals pipet 150 microliters van de celsuspensie over naar elke put van een microarrayplaat die verschillende chemicaliën bevat. Microarrays kunnen ook handmatig worden gegenereerd volgens de methode die in het teksthandschrift wordt beschreven.
Bedek de microarrayplaat met een gasdoorlatend plafondmembraan en incubeer deze gedurende 24 uur in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Om persistenter testplaten te maken, bereidt u 25 milliliter gemodificeerd LB-medium met vijf microgram per milliliter Ofloxacine in een centrifugebuis van 50 milliliter en brengt u dit medium over in een steriel reservoir. Breng 190 microliters van het gemodificeerde LB-medium over in elke put van een generieke vlakke bodem 96 putplaat.
Verwijder na de incubatie van 24 uur de microarray uit de shaker en breng 10 microliters celculturen over van de microarray naar de putten van de persistentertestplaat die gemodificeerd LB-medium met Ofloxacine bevat. Neem 10 microliters celsuspensingen uit de persister essayplaat en verdun deze drie keer in 290 microliters PBS-oplossing met behulp van een ronde bodem 96 putplaat en een meerkanaals pipet. Spot vervolgens 10 microliters van alle serieel verdunde celsuspensusingen op antibioticavrije verse agarplaten.
Bedek de persistentertestplaat met een gasdoorlatend plafondmembraan en incubeer deze zes uur lang in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Herhaal na de incubatie van zes uur de seriële verdunning en het spotten op agarplaten. Incubeer de agarplaten gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius.
Tel dan de kolonievormende eenheden of CFUs. Gebruik de CFU-spiegels vóór en zes uur na de antibioticabehandeling om de persistentiefractie in elke put te berekenen. De CFU telt voordat de OFX-behandeling ook helpt bij het beoordelen van de effecten van osmolieten op de levensvatbaarheid van e coli.
Breng 250 microliter exponentiële fasecellen over naar 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium met de osmoliet die is geïdentificeerd uit de microarrayscreening. Incubeer de kolf in een orbitale shaker bij 250 RPM en 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Verwijder na 24 uur de kolf uit de shaker en breng 250 microliter van de celkweek over op 25 milliliter vers gemodificeerd LB-medium in een verbijsterde kolf van 250 milliliter.
Voeg 25 microliters Ofloxacine-bouillonoplossing toe aan de celsuspensie en schud de kolf zachtjes om de testcultuur homogeen te maken. Incubeer de kolf in een shaker bij 37 graden Celsius en 250 RPM. Breng elk uur tijdens de behandeling, inclusief een tijdstip voor toevoeging van Ofloxacine, één milliliter van de testkweek over van de kolf naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en centrifugeer deze gedurende drie minuten op 17.000 maal G.
Verwijder 950 microliter supernatant en was de cellen driemaal met 950 microliter PBS. Na de laatste wasbeurt de celkorrel opnieuw opschorten in 100 microliter PBS-oplossing. Neem 10 microliters van de celsuspensie en verdun deze zes keer serieel met 90 microliters PBS in een 96 goed ronde bodemplaat.
Spot 10 microliters van de verdunde celsuspensussingen op een antibioticavrije agarplaat. Om de detectielimiet te verhogen, plaat de resterende 90 microliters celsuspensie op een verse agarplaat. Incubeer de platen gedurende 16 uur op 37 graden Celsius en tel cfus.
Een representatief beeld van agarplaten die worden gebruikt om CFU-niveaus van celculturen voor en na OFX-behandeling te bepalen, wordt hier weergegeven. De eerste kolom is de controlegroep. De tweede kolom bevat cellen die zijn gekweekt in 100 millimolair natriumnitraat en de derde kolom bevat cellen die zijn gekweekt in 60 millimolair natriumnitraat.
Voor de eenvoud zijn hier slechts twee osmolieten op gericht. Een grafische weergave van de CFU-gegevens van de platen en persistenterfracties van de celculturen getest in 96 putplaten worden hier weergegeven. Om de fracties te berekenen, werden persistentertellingen genormaliseerd tot de celtellingen die vóór de antibioticabehandeling werden verkregen.
Om byphasic kill curves te genereren, werden de cellen gedurende 24 uur gekweekt in 25 milliliter gemodificeerd LB-medium met de aangegeven osmolieten en verbijsterde kolven, en vervolgens overgebracht naar persistenter assay flasks voor persistenter enumeration. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het spotten van de cellen op agarplaat arbeidsintensief is en focus vereist. Een fout tijdens de stap kan leiden tot kruisbesmetting onder de geteste omstandigheden.
Het is dus belangrijk om voorafgaand aan het experiment te oefenen met het spotten van meerdere monsters tegelijk. Volgens dit protocol kunnen medicijnpanels en mutante celbibliotheken worden gescreend om de effecten op de persistentie te bestuderen. Met deze screening hebben we een aantal osmolieten en PS-condities geïdentificeerd die een significante impact hebben op bacteriële persistentie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit methodeartikel beschrijft een high-throughput screeningstrategie om chemische verbindingen te identificeren die een significante invloed hebben op bacteriële persistentie. Het protocol is aanpasbaar voor diverse toepassingen, waaronder geneesmiddelenpanels en genbibliotheken.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- High-throughput screening
- Chemische verbindingen
Achtergrond
- Bacteriële persistentie is een kritieke factor bij het beheer van infecties.
- Het identificeren van verbindingen die de persistentie beïnvloeden, kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën.
- High-throughput methoden maken een efficiënte screening van meerdere condities mogelijk.
- Visuele demonstraties kunnen de uitvoering van complexe protocollen verbeteren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het screenen van verbindingen die de bacteriële persistentie beïnvloeden.
- Het bieden van een protocol dat kan worden aangepast aan verschillende onderzoeksbehoeften.
- Het faciliteren van de gelijktijdige uitvoering van meerdere experimentele stappen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van microarray-celculturen.
- Overdracht van cellen in de exponentiële fase naar gemodificeerd LB-medium.
- Homogenisatie van de celsuspensie.
- Simultane uitvoering van verschillende tussenstappen voor optimale efficiëntie.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt de identificatie van significante chemische verbindingen mogelijk.
- Aangetoonde aanpassingsvermogen voor verschillende screening-toepassingen.
- Visuele hulpmiddelen verbeteren de timing en nauwkeurigheid in experimenten.
- High-throughput mogelijkheden verhogen de efficiëntie van het onderzoek.
Conclusies
- Deze methode voor high-throughput screening is effectief voor het identificeren van verbindingen die invloed hebben op bacteriële persistentie.
- De aanpasbaarheid van het protocol maakt het waardevol voor diverse onderzoekcontexten.
- Visuele demonstraties zijn nuttig voor het beheren van complexe experimentele procedures.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
High-throughput screening van chemische verbindingen op effecten op bacteriële persistentie pakt een kritiek knelpunt aan in de ontdekking van anti-infectiva door systematische analyse van fenotypische resistentiemechanismen mogelijk te maken. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie in een vroeg stadium en informeert de triage van portfolio's door modulatoren van persistentie te identificeren die ten grondslag kunnen liggen aan het recidief van chronische infecties. De aanpasbaarheid aan drug-panels en genbibliotheken positioneert deze workflow als een herbruikbaar middel in discovery- en preklinische pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt systematische evaluatie van chemische en genetische modulatoren van bacteriële persistentie mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door het kwantificeren van fenotypische switching onder gedefinieerde omstandigheden.
- Faciliteert biologische risicoreductie door het verduidelijken van persistentiemechanismen die relevant zijn voor chronische infectiemodellen.
- Levert gegevens voor voorspellende zekerheid bij het verder ontwikkelen van anti-persistentiestrategieën.
Screening en assayontwikkeling
- Levert gevalideerde, kwantitatieve uitslagen van persister-fracties onder diverse chemische condities.
- Standaardiseert assay-condities voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid tussen studies.
- Maakt schaalbare, geparallelliseerde screening van compound-bibliotheken of genetische varianten mogelijk.
- Bereidt robuuste biologische systemen voor op downstream mechanistische of translationele studies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt de modulatie van in vitro persistentie af met ziekterelevante bacteriële fenotypes.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van anti-persistentie-interventies.
- Informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten die zich richten op persistentiemechanismen.
- Biedt mechanistische risicoreductie voor modellen van chronische infecties.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Deze high-throughput screeningmethode bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie en ondersteunt zowel hypothesegedreven als onbevooroordeelde evaluatie van verbindingen voor de modulatie van persistentie.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing mogelijk van omgevings- en chemische triggers van persistentie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van compound- of genbibliotheken.
- Analytica: Genereert colony forming unit (CFU) data en berekeningen van de persisterfractie voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen van chronische infectie, mits ondersteund door downstream validatie.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Aanpasbaar aan diverse screeningsarrays, ter ondersteuning van meerdere R&D-programma's.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets tegen persistentie en bij mechanistische risicoreductie.
- Operationele waarde: Standaardiseert high-throughput workflows voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen anti-infectieve portfolio's.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risicogebaseerde prioritering van kandidaten die zich richten op persistentiemechanismen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in high-throughput microbiologische assays en kwantitatieve CFU-analyse.
- Vereist multi-channel pipetteren, het hanteren van microarray-platen en een infrastructuur voor kolonietelling.
- Noodzaakt tot strikte standaardisatie tussen teams om kruiscontaminatie te minimaliseren en dataintegriteit te waarborgen.
- Aanpasbaar aan verschillende modelsystemen, maar arbeidsintensieve stappen zoals agar-spotting vereisen oefening en precisie.
- Doorvoersnelheid en detectielimieten worden beperkt door handmatige handelingen en de capaciteit voor kolonienumeratie.
