Analyseren van de α-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocyten Using Single Molecule Localization Microscopy

Deze methode kan worden gebruikt voor de kwantitatieve evaluatie van sarcomere rijping in iPSC-afgeleide cardiomyocyten. Met behulp van deze superresolutie-gebaseerde aanpak, is het mogelijk om zelfs subtiele veranderingen in sarcomere organisatie, die niet mogelijk is met conventionele confocale beeldvorming te detecteren. Schakel ten minste drie uur voor gebruik de microscoop in en breng het monster op kamertemperatuur.

Wanneer de microscoop klaar is, voeg 300 microliter palm imaging buffer aan een put van gelabelde cellen en steek de kamer dia in de fase houder van de microscoop. Selecteer de 1.57 NA 100X oliedoelstelling en gebruik de PALM-modus in de beeldsoftware en activeer de TIRF-instellingen. Stel het aantal frames in op 5, 000 tot 10.000, de UV-laserkracht op 0,1% en de 647-laser op 0,2% en het versterkingsniveau op 50 tot 100.

Wanneer alle acquisitieparameters zijn ingesteld, schakelt u de laserverlichting in en selecteert u een doelcel. Om een beeld te verwerven, verhoogt u de 647 laserkracht tot 100% en verlaagt u de winst tot nul. Bleek de doelcel voor ongeveer vijf seconden, dan verhogen de winst tot 50 en start de PALM image acquisition.

Open aan het einde van de overname de gegevens in ImageJ en open de Thunderstorm-plug-in voor de reconstructie van de PALM-gegevens. Selecteer analyse uitvoeren in de plug-in en open het menu camera-instelling. Voer de pixelgrootte en de elektromagnetische versterking in.

Stel in het analysemenu de B-spline-volgorde in op drie, de B-splineschaal op twee, de piekintensiteitsdrempel op stfwave. f1, de montage straal tot drie, de eerste sigma tot 1,6, de vergroting tot vijf, de update frequentie tot 50, en de laterale verschuivingen naar twee, en klik op OK. Selecteer na de reconstructie sigma in het plot histogrammenu en gebruik het rechthoeksgereedschap om een interessegebied te selecteren, met uitzondering van mogelijke artefacten. Voeg het interessegebied toe aan het filter en voeg en onzekerheid van minder dan 25 toe aan het gebied van rentewaarden.

Voer in het tabblad Dubbele duplicaten verwijderen een afstandsdrempel van 10 nanometer in. Stel op het tabblad samenvoegen de maximale afstand in op 20, de maximale frames per molecuul op nul en de maximale uitframes op één. Selecteer op het tabblad driftcorrectie de correlatie kruiscorrelatie en stel het aantal opslaglocaties en de vergroting in op vijf, sla vervolgens de uiteindelijke PALM-afbeelding op en exporteert de post-processgegevens.

Om de sarcomere lengte te analyseren, importeert u het gereconstrueerde PALM-beeld van belang in ImageJ en gebruikt u het lijngereedschap om een lijn te trekken tussen de geselecteerde sarcomerestructuren loodrecht op de Z-schijf om de kortste afstand tussen de actinefilamenten te meten. Selecteer in het analysemenu het plotprofiel en verkrijg de lengte tussen de twee pieken. Als u de dikte van de Z-schijf wilt analyseren, zet u de gereconstrueerde PALM-afbeelding om in een acht-bits modusafbeelding en opent u de Nokdetectie-plug-in.

Stel de lijnbreedte in op 20, het hoge contrast op 230, het lage contrast op 10, de sigma op 0,79, de lagere drempel op 25,84 en de minimale lijnlengte op 20. Selecteer de schattingsbreedte, breid de lijn uit en geef de weergaveresultaten weer, klik op OK en gebruik de gemiddelde lijnbreedte uit de resultatentabel voor verdere analyse. iPSC-afgeleide cardiomyocyte en neonatale cellen vertonen een vergelijkbaar alfaactininepatroon met onregelmatige disarranged sarcomere structuren.

Kwantitatieve beoordeling toont aan dat de lengte en dikte van de alfa-actininefilamenten vrijwel identiek zijn tussen de twee groepen cellen die wijzen op een voortijdige ontwikkelingstoestand van iPSC-afgeleide cardiomyocyten. In tegenstelling, volwassen volwassen cardiomyocyten vertonen een regelmatige sarcomere netwerk met een iets verhoogde sarcomere lengte en verminderde Z-disc dikte. Een vergelijking van conventionele confocale beeldvorming en PALM onthult geen significant verschil in sarcomere lengte.

Echter, een diep verminderde Z-disc dikte wordt gedetecteerd wanneer iPSC cardiomyocyten worden onderworpen aan PALM imaging. Een winst in resolutie wordt waargenomen wanneer PALM wordt toegepast, die wordt ondersteund door de overeenkomstige intensiteit percelen. Met name sarcomere structuren verworven met behulp van een lage kwaliteit buffer lijken te zijn dikker in vergelijking met structuren gevangen onder optimale beeldvormingsomstandigheden.

Dit gebrek aan gegevensnauwkeurigheid is te wijten aan de verminderde knipperende eigenschappen van de fluorofoof, wat resulteert in minder gedetecteerde fotonen per lokalisatiegebeurtenis. Bovendien wordt de lokalisatieprecisie verlaagd, waardoor de algehele resolutie van het gereconstrueerde PALM-afbeelding wordt verlaagd. Bovendien kan monsterdrift de precieze lokalisatie van de fluorescerende moleculen beïnvloeden, wat resulteert in wazige beelden.

Om goede PALM-beelden te verkrijgen, is het erg belangrijk om thermische evenwicht van het gehele beeldvormingssysteem mogelijk te maken om overmatige monsterdrift tijdens de beeldvorming te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere cellulaire structuren zoals mitochondriën door PALM worden afgebeeld om extra parameters van cardiomyocyte rijping te verwerven.