Name: Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer een neonataal beeldvormingsmodel voor gram-negatieve bacteriële sepsis met bioluminescente E. coli in muizen. Deze methode maakt real-time tracking van bacteriële verspreiding en correlatie met ziekte-indicatoren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door institutionele fondsen aan C.M.R.

<ol><li>Qazi, S. A., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+a+major+global+public+health+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Infect+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: a major global public health challenge.</a> Pediatr Infect Dis J. 28, 1-2 (2009).</li>
<li>Simonsen, K. A., Anderson-Berry, A. L., Delair, S. F., Davies, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-onset+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Early-onset neonatal sepsis.</a> Clinical Microbiology Reviews. 27 (1), 21-47 (2014).</li>
<li>Seman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+compromise+protective+immunity+in+a+mouse+model+of+Gram-negative+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of interleukin-27 in early life compromise protective immunity in a mouse model of Gram-negative neonatal sepsis.</a> Infections and Immunity. , (2019).</li>
<li>Schrag, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Invasive+Early-Onset+Neonatal+Sepsis%2C+2005+to+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Invasive Early-Onset Neonatal Sepsis, 2005 to 2014.</a> Pediatrics. 138 (6), 20162013(2016).</li>
<li>Stoll, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+onset+neonatal+sepsis%3A+the+burden+of+group+B+Streptococcal+and+E.+coli+disease+continues%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early onset neonatal sepsis: the burden of group B Streptococcal and E. coli disease continues.</a> Pediatrics. 127 (5), 817-826 (2011).</li>
<li>Weston, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+invasive+early-onset+neonatal+sepsis+in+the+United+States%2C+2005-2008%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+and+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">The burden of invasive early-onset neonatal sepsis in the United States, 2005-2008.</a> Pediatrics and Infectious Disease Journal. 30 (11), 937-941 (2011).</li>
<li>Hornik, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+late+onset+sepsis+in+very-low-birth-weight+infants+from+a+large+group+of+neonatal+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Early and late onset sepsis in very-low-birth-weight infants from a large group of neonatal intensive care units.</a> Early Human Development. , Suppl 2 69(2012).</li>
<li>Vergnano, S., Sharland, M., Kazembe, P., Mwansambo, C., Heath, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+sepsis%3A+an+international+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+in+Childhood%3A+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Neonatal sepsis: an international perspective.</a> Archives of Disease in Childhood: Fetal and Neonatal Edition. 90 (3), 220-224 (2005).</li>
<li>Kraft, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+macrophages+express+elevated+levels+of+interleukin-27+that+oppose+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal macrophages express elevated levels of interleukin-27 that oppose immune responses.</a> Immunology. 139 (4), 484-493 (2013).</li>
<li>Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune responses in neonates.</a> Expert Reviews of Clinical Immunology. 10 (9), 1171-1184 (2014).</li>
<li>Gleave Parson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+myeloid-derived+suppressor+cells+are+a+source+of+elevated+levels+of+interleukin-27+in+early+life+and+compromise+control+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine myeloid-derived suppressor cells are a source of elevated levels of interleukin-27 in early life and compromise control of bacterial infection.</a> Immunology and Cell Biology. 97 (5), 445-446 (2018).</li>
<li>Adkins, B., Leclerc, C., Marshall-Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+adaptive+immunity+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neonatal adaptive immunity comes of age.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 553-564 (2004).</li>
<li>Kim, S. K., Keeney, S. E., Alpard, S. K., Schmalstieg, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+L-selectin+and+CD11b+on+neutrophils+of+adults+and+neonates+during+the+first+month+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of L-selectin and CD11b on neutrophils of adults and neonates during the first month of life.</a> Pediatrics Research. 53 (1), 132-136 (2003).</li>
<li>Velilla, P. A., Rugeles, M. T., Chougnet, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+antigen-presenting+cell+function+in+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defective antigen-presenting cell function in human neonates.</a> Clinical Immunology. 121 (3), 251-259 (2006).</li>
<li>Le Garff-Tavernier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+NK+cells+display+major+phenotypic+and+functional+changes+over+the+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Human NK cells display major phenotypic and functional changes over the life span.</a> Aging Cell. 9 (4), 527-535 (2010).</li>
<li>Weinberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+reduced+responsiveness+of+neonatal+neutrophils+to+distinct+chemoattractants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying reduced responsiveness of neonatal neutrophils to distinct chemoattractants.</a> Journal of Leukocyte Biology. 70 (6), 969-976 (2001).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviewss+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nature Reviewss Immunology. 9 (3), 162-174 (2009).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%2C+8th+ed%22">Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed</a>. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Bayarmagnai, B., Perrin, L., Esmaeili Pourfarhangi, K., Gligorijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+of+Tumor+Cell+Motility+in+the+Tumor+Microenvironment+Context%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging of Tumor Cell Motility in the Tumor Microenvironment Context.</a> Methods in Molecular Biology. 1749, 175-193 (2018).</li>
<li>Beerling, E., Ritsma, L., Vrisekoop, N., Derksen, P. W., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+new+insights+into+metastasis+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: new insights into metastasis of tumors.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 3 299-310 (2011).</li>
<li>Witcomb, L. A., Collins, J. W., McCarthy, A. J., Frankel, G., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Imaging+Reveals+Novel+Patterns+of+Colonization+and+Invasion+in+Systemic+Escherichia+coli+K1+Experimental+Infection+in+the+Neonatal+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Imaging Reveals Novel Patterns of Colonization and Invasion in Systemic Escherichia coli K1 Experimental Infection in the Neonatal Rat.</a> Infection and Immunity. 83 (12), 4528(2015).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-alpha+inhibitor+protein+administration+improves+survival+from+neonatal+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Inter-alpha inhibitor protein administration improves survival from neonatal sepsis in mice.</a> Pediatric Research. 68 (3), 242-247 (2010).</li>
<li>Pluschke, G., Pelkonen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+factors+in+the+resistance+of+newborn+mice+to+K1+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Patho%22%5BJournal%5D)">Host factors in the resistance of newborn mice to K1 Escherichia coli infection.</a> Microb. Patho. , 93-102 (1988).</li>
<li>Mancuso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interleukin+12+in+experimental+neonatal+sepsis+caused+by+group+B+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of interleukin 12 in experimental neonatal sepsis caused by group B streptococci.</a> Infections and Immunity. 65 (9), 3731-3735 (1997).</li>
<li>Thammavongsa, V., Rauch, S., Kim, H. K., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+A-neutralizing+monoclonal+antibody+protects+neonatal+mice+against+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protein A-neutralizing monoclonal antibody protects neonatal mice against Staphylococcus aureus.</a> Vaccine. 33 (4), 523-526 (2015).</li>
<li>Andrade, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2-induced+IL-10+production+impairs+neutrophil+recruitment+to+infected+tissues+during+neonatal+bacterial+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">TLR2-induced IL-10 production impairs neutrophil recruitment to infected tissues during neonatal bacterial sepsis.</a> Journal of Immunology. 191 (9), 4759-4768 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Ons subscapulaire infectiemodel voor het induceren van bacteriële sepsis bij neonatale muizen is een nieuwe methode om de longitudinale verspreiding van bacteriële pathogenen in realtime te bestuderen. Intravital imaging biedt de mogelijkheid om bacteriële verspreiding in real time te verkennen in neonaten. Dit is van cruciaal belang om de kinetiek van bacteriële verspreiding te begrijpen en de respons en schade van de gastheer in de juiste fase van de ziekte verder te bestuderen. Muispups krijgen een onderhuidse, subcap...

Bacteriële sepsis is een belangrijke zorg voor neonaten die een uniek immuunprofiel vertonen in de eerste dagen van het leven dat geen adequate bescherming biedt tegen infectie1. Neonatale sepsis blijft een belangrijke Amerikaanse gezondheidszorg probleem goed voor meer dan 75.000 gevallen per jaar in de VS alleenal 2. Om deze infecties grondig te bestuderen, zijn nieuwe diermodellen nodig die aspecten van de menselijke ziekte samenvatten. We hebben een neonatale muis infectie model met behulp van Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli is de tweede belangrijkste oorzaak van neonatale sepsis in de VS, maar verantwoordelijk voor de meerderheid van de sepsis-geassocieerde mortaliteit4,5. Echter, het is de belangrijkste oorzaak wanneer pre-term en zeer laag geboortegewicht (VLBW) baby's worden beschouwd als onafhankelijk5. Het K1-serotype wordt het vaakst geassocieerd met invasieve bloedbaaninfecties en meningitis bij neonaten6,7. Momenteel zijn er geen andere behandelingsopties dan antibiotica en ondersteunende zorg. Ondertussen blijven de tarieven van antibioticaresistentie stijgen voor veel pathogene bacteriën, met sommige stammen van E. coli resistent tegen een veelheid van antibiotica vaak gebruikt in behandeling8. Het is dus absoluut noodzakelijk dat we methoden blijven genereren om de mechanismen van sepsis en de gastheerrespons in neonaten te bestuderen. Deze resultaten kunnen helpen om te verbeteren op de huidige behandelingen en infectie resultaten.
De immuuntoestand van neonaten wordt gekenmerkt door zowel fenotypische als functionele verschillen in vergelijking met volwassenen. Zo is aangetoond dat verhoogde niveaus van ontstekingsremmende en regulerende cytokinen, zoals interleukine (IL)-10 en IL-27, worden geproduceerd door door navelstrengbloed afgeleide macrofagen en zijn zij op grotere niveaus aanwezig in het serum van murine neonaten9,10,11. Dit komt overeen met lagere niveaus van IFN-α, IFN-ɣ, IL-12 en TNF-α die vaak worden gerapporteerd vanuit neonatale cellen in vergelijking met volwassen tegenhangers10. Bovendien is het neonatale immuunsysteem scheef in de richting van een Th2 en regelgevende T-celrespons in vergelijking met volwassenen12. Verhoogde aantallen neutrofielen, T-cellen, B-cellen, NK-cellen en monocyten zijn ook aanwezig in neonaten, maar met aanzienlijke functionele beperkingen. Dit omvat defecten in expressie van celoppervlakmarkeringen en antigeenpresentatie die onrijpheid13,14,15suggereren . Bovendien, neonatale neutrofielen zijn aanzienlijk tekort in hun vermogen om te migreren naar chemotactische factoren16. Myeloïde-afgeleide suppressor cellen (MDSCs) zijn ook gevonden op verhoogde niveaus in neonaten en onlangs aangetoond dat een bron van IL-2711. MDC's zijn zeer onderdrukkend in de richting van T-cellen17. Gezamenlijk tonen deze gegevens beperkingen aan in neonatale immuniteit die de gevoeligheid voor infectie verhogen.
Om de progressie van de bacteriële last te bestuderen en beschermende gastheer immuunreacties te ontleden tijdens neonatale sepsis, hebben we een nieuw infectiemodel ontwikkeld. Neonatale muizen op dagen 3-4 van het leven zijn moeilijk te injecteren in de intraperitoneale ruimte of staartader. In ons model worden dag 3 of 4 pups het bacteriële entmateriaal of PBS onderhuids toegediend in het scapulaire gebied. Een systemische infectie ontwikkelt zich en met behulp van luminescente E. coli O1:K1:H7, kunnen we langswaarts beeld individuele neonatale muizen om de verspreide bacteriële last in perifere weefsels te volgen. Dit is het eerste gerapporteerde model dat intravital beeldvorming gebruikt om de kinetiek van verspreiding van bacteriën tijdens sepsis bij murine neonaten te begrijpen3.
Hier beschrijven we een protocol om septische E. coli-infecties bij neonatale muizen3te induceren. We beschrijven hoe het bacteriële entmateriaal voor injectie moet worden voorbereid en hoe weefsel kan worden geoogst voor de beoordeling van pathologie, het meten van ontstekingsmarkers door genexpressieanalyse en opsomring van de bacteriële last. Daarnaast wordt ook het gebruik van luminescente E. coli voor intravitale beeldvorming van geïnfecteerde neonaten en kwantificering van bacteriële doden door neonatale immuuncellen beschreven. Deze protocollen kunnen ook worden aangepast om andere belangrijke bacteriële infecties in neonaten te bestuderen. De hier gepresenteerde gegevens vertegenwoordigen een algemene nieuwe benadering van het begrijpen van infectiedynamiek in een vertaalbaar neonatale sepsismodel.

<table><tbody><tr><td>1 mL Insulin Syringe</td><td>Coviden</td><td>1188128012</td><td>Inoculum of PBS-injectie</td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td>Histopathologie</td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>LSA1049201</td><td>Bacterieclearance assay</td></tr><tr><td>Animal Tattoo Ink Paste</td><td>Ketchum</td><td>KI1482039</td><td>Dieridentificatie</td></tr><tr><td>Animal Tattoo Ink Green Paste</td><td>Ketchum</td><td>KI1471039</td><td>Dieridentificatie</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6B.2 Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-781</td><td>Celisolatie</td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7</td><td>ATCC</td><td>11775</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expresses luciferase)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Geconstrueerd in-house bij WVU</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>R6812</td><td>RNA extractie</td></tr><tr><td>DPBS, 1X</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Difco Tryptic Soy Agar</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>236950</td><td>Bacteriegroei</td></tr><tr><td>IL-1 beta Primer/Probe (Mm00434228)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Cytokine expressie qPCR</td></tr><tr><td>IL-6 Primer/Probe (Mm00446190)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Cytokine expressie qPCR</td></tr><tr><td>iQ Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708860</td><td>Real-time kwantitatieve PCR</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA synthese</td></tr><tr><td>Isolation Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Bacterieclearance assay</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT and Living Image 4.5 Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>Intravitale beeldvorming</td></tr><tr><td>LB Broth, Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td>Bacteriegroei</td></tr><tr><td>EASYstrainer (Nylon Basket)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>542 040</td><td>Celstrainer</td></tr><tr><td>SpectraMax iD3</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td>Platelezer</td></tr><tr><td>Pellet Pestle Motor</td><td>Grainger</td><td>6HAZ6</td><td>Weefselhomogenisatie</td></tr><tr><td>Polypropylene Pellet Pestles</td><td>Grainger</td><td>6HAY5</td><td>Weefselhomogenisatie</td></tr><tr><td>Prime Thermal Cycler</td><td>Techne</td><td>3PRIMEBASE/02</td><td>cDNA synthese</td></tr><tr><td>TNF-alpha Primer/Probe (Mm00443258)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Cytokine expressie qPCR</td></tr><tr><td>TriReagent (GTCP)</td><td>Molecular Research Center</td><td>TR 118</td><td>RNA extractie</td></tr></tbody></table>

een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonaten hebben een verhoogd risico op bacteriële sepsis als gevolg van het unieke immuunsysteem profiel dat ze vertonen in de eerste maanden van het leven. We hebben een protocol opgesteld voor het bestuderen van de pathogenese van E. coli O1:K1:H7, een serotype dat verantwoordelijk is voor hoge sterftecijfers bij pasgeborenen. Onze methode maakt gebruik van intravital beeldvorming van neonatale pups op verschillende tijdstippen tijdens de progressie van infectie. Deze beeldvorming, parallel met het meten van bacteriën in het bloed, ontstekingsprofilering en weefsel histopathologie, betekent een rigoureuze benadering van het begrijpen van infectiedynamica tijdens sepsis. In het huidige rapport modelleren we twee infectieuze entculums voor de vergelijking van bacteriële lasten en de ernst van de ziekte. We vinden dat subscapulaire infectie leidt tot verspreide infectie door 10 uur na infectie. Tegen 24 uur, infectie van luminescente E. coli was overvloedig in het bloed, longen, en andere perifere weefsels. Expressie van inflammatoire cytokinen in de longen is significant bij 24 uur, en dit wordt gevolgd door cellulaire infiltratie en bewijs van weefselschade die toeneemt met infectieuze dosis. Intravital imaging heeft wel een aantal beperkingen. Dit omvat een lichtgevende signaaldrempel en enkele complicaties die kunnen ontstaan bij neonaten tijdens anesthesie. Ondanks enkele beperkingen, vinden we dat onze infectie model biedt een inzicht voor het begrijpen van longitudinale infectie dynamiek tijdens neonatale murine sepsis, die niet grondig is onderzocht tot op heden. We verwachten dat dit model ook kan worden aangepast aan andere kritische bacteriële infecties te bestuderen tijdens het vroege leven.

Dit protocol veroorzaakte bacteriële sepsis bij neonatale muizen, en we gebruikten longitudinale intravitale beeldvorming, opsoming van bacteriën in het bloed, histologische beoordelingen van pathologie en inflammatoire cytokine-expressieprofielen om het verloop van de ziekte te bestuderen. Tekenen van morbiditeit werden waargenomen bij neonatale pups besmet met zowel lage (~ 2 x 106 CFUs) en hoge (~ 7 x 106 CFUs) inoculums van E.coli na verloop van tijd. Pups die het grotere entmateriaal k...

Infectie van neonatale muizen met bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulteert in een septische infectie met significante longontsteking en longpathologie. Hier beschrijven we procedures om neonatale sepsis te modelleren en verder te bestuderen met behulp van longitudinale intravitale beeldvorming parallel met de opsomsoming van systemische bacteriële lasten, ontstekingsprofilering en longsentopathologie.

Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Ons protocol maakt bacteriële verspreiding en last tracking in een experimentele neonatale sepsis model in real time, en de mogelijkheid om andere markers van de ziekte te correleren met de ziekteverwekker last. Dit protocol stelt ons in staat om sepsis in individuele neonatale muizen in de lengterichting te analyseren, waardoor de mogelijkheid wordt geboden om infectiedynamiek en bacteriële verspreiding in realtime te observeren en te vergelijken. Preklinische tests van interventies voor neonatale sepsis kunnen met deze methode worden uitgevoerd, waardoor de effecten van gastheercontrole van de bacteriën kunnen worden gecontroleerd.Begin met het plaatsen van leeftijdsgedefgegelijkde pups in een hoge of lage dosis nestgroepen binnen een bioveiligheidsniveau twee kast. Op postnatale dag drie of vier, record de gewichten van alle pups voorafgaand aan inenting. Laad insulinespuiten met PBS of het hoge of lage E.coli lux entmateriaal in de bioveiligheidskast en leg de geladen spuiten op ijs.Plaats het te injecteren neonaat op een schoon oppervlak in de bioveiligheidskast en verhoog de huid bij de nek als de pup te sjofelen. Steek de naald schuine kant net onder de huid in de ruimte tussen de huid en de spier. Wanneer de naald kan worden gevoeld onder de huid, injecteren 50 microliter van de entmateriaal, terwijl tegelijkertijd het vrijgeven van de beknelde gedeelte van de huid om terugstroom te voorkomen, verwijder dan de naald langzaam en met zorg.Wanneer alle pups op dezelfde manier zijn geïnjecteerd, brengen ze de pups terug naar hun dammen. Onmiddellijk na de injectie en op de juiste experimentele tijdstippen daarna, plaats de kooi met E.coli lux geïnfecteerde neonatale muizen en dam in een bioveiligheid niveau twee laminaire stroom kap en open de software in de micro CT-computer. Na het initialiseren van het systeem en wachten op de stadiumtemperatuur te vergrendelen op 37 graden Celsius en de CCD-temperatuur te vergrendelen op negatieve 90 graden Celsius, plaats maximaal vier verdoofde pups op de beeldvorming doos in de beeldvorming kamer in de gevoelige positie.Sluit de deur van de beeldkamer en selecteer de luminescentieweergaveoptie. Selecteer het filter openen en vervolgens openen en stel het excitatiefilter in op blokkering en het emissiefilter dat moet worden geopend. Selecteer 500, 520, 560, 580, 600 en 620 nanometer.Beeld vervolgens de pups voordat u ze terug naar de kooi met de dam met controle tot anesthesie herstel. Op het juiste experimentele eindpunt, in een bioveiligheidskast, doven het geëuthanaseerde neonaat met 70% ethanol om besmetting te voorkomen en het dier aan de rechterkant te plaatsen. Gebruik tangen om de huid te grijpen tussen de buik en het achterste linkerbeen en gebruik fijne tip chirurgische schaar om een huid incisie te maken.Ga vervolgens verder incisie naar de achterkant van het dier totdat de hele milt is blootgesteld. Gebruik de tang en schaar om de milt uit de buik te verwijderen en plaats deze in de oplossing die geschikt is voor de downstream-toepassing ervan. Om de longen te verkrijgen, pel de huid van de borst volledig terug en gaat aan de basis van het borstbeen met de schaar verticaal, omhoog gesneden totdat de ribbenkast wordt gesplitst.Gebruik tangen om de rechter- en linkerlongen individueel te grijpen en de longen uit de borstholte te verwijderen. Verwijder het hart uit het longweefsel met een schaar. Plaats vervolgens de long in de oplossing die geschikt is voor de downstream-toepassing.Om een in vitro bacteriële dodentest uit te voeren, plaatst u de niet-geïnfecteerde milt in een nylon zeef van 40 micrometer in een steriele petrischaal van 60 millimeter met vijf milliliter PBS, aangevuld met 10%foetaal runderserum, en gebruikt u een steriele drie milliliter syringe plunger om het weefsel in één cel suspensie te ontven. Breng de cellen naar een 15 milliliter centrifuge buis en verzamel ze door centrifugatie. Resuspend de pellet in een milliliter van rode bloedcel lyse buffer per drie tot vier milt.Na vijf minuten bij kamertemperatuur, was de milten in PBS en resuspend de pellet in 250 microliters van PBS aangevuld met runderserum albumine en twee millimolar EDTA voor het tellen. Vervolgens isoleer de Ly6 B2 positieve cellen met de juiste immunomagnetische kralen volgens het protocol van de fabrikant en zaad de verrijkte Ly6 B2 positieve cellen op een een keer 10 tot de vijf cellen per 100 microliter van volledige medium per putdichtheid in een zwarte of witte 96-put plaat. Bereid het bacteriële entmateriaal bij de gewenste veelheid van infectie in een uiteindelijk volume van 100 microliter per put en voeg 100 microliter bacteriële entmateriaal of medium alleen aan elke put voor een een uur incubatie in de celcultuur incubator.Vervang aan het einde van de incubatie het medium door 200 microliter vers volledig medium aangevuld met 100 microgram per milliliter gentamycine om eventuele resterende extracellulaire bacteriën te verwijderen en de cellen nog twee uur terug te brengen naar de celkweek incubator. Gebruik aan het einde van de incubatie en op elk experimenteel tijdstip daarna een plaatlezer om de luminescentie in elke put van de dekselcultuurplaat te meten voordat u de plaat terugzet naar de couveuse van de celkweek tot de volgende lezing. Terwijl de meeste dieren vertonen hoge niveaus van bacteriën in het bloed op 24 uur na infectie, sommige pups hebben lage of niet op te sporen bacteriën in het bloed, wat suggereert klaring van de infectie door dit moment punt.Bovendien, neonatale Ly6 B2 positieve miltcellen besmet met bioluminescentE E.coli gedurende een uur voor de verwijdering van extracellulaire bacteriën en de daaropvolgende gentamycine behandeling uitgedrukt een hoog niveau van luminescentie op drie uur die afneemt na verloop van tijd indicatief voor bacteriële klaring. Levende dierlijke beeldvorming van de lichtgevende bacteriën bevestigt verder de toename van de verspreiding van bacteriën en de groei bij neonatale pups in de tijd op 10 en 24 uur na infectie. Intravital imaging in combinatie met micro CT vergemakkelijkt de identificatie van infectie foci in de hersenen, longen, en andere perifere weefsels.De longen van sommige sterk geïnfecteerde muizen tonen ondoorzichtige regio's die in overeenstemming zijn met ontstekingsconsolidatie die co-gelokaliseerd is tot luminescente bacteriële signalen. Deze gebieden van vermoedelijke ontstekingsexsudaat worden niet waargenomen in niet-geïnfecteerde controlelongen. Een significante toename van inflammatoire cytokine expressie ten opzichte van controles wordt ook waargenomen in zowel lage als hoge enoculumgroepen, correleren met een opmerkelijke verdikking van de alveolische wand, verhoogde alveololbloedingen en ontstekingsinfiltratie bij deze dieren.De belangrijkste dingen om te onthouden zijn om de juiste techniek uit te voeren bij het uitvoeren van de injecties en om strikte aandacht te besteden aan de neonaten bij het toedienen van de anesthesie. Met behulp van deze techniek kunnen we neonatale sepsis in realtime visualiseren om interventies te bestuderen en gerichte therapieën te hosten die gericht zijn op het verbeteren van de immuunrespons.

a-neonatal-imaging-model-of-gram-negative-bacterial-sepsis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Seman, B. G., et.al. Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of neutrophils and inflammatory monocytes from neonatal mouse spleens and their application in a luminescent bacterial killing assay. It covers mechanical dissociation, red blood cell lysis, magnetic bead–based cell enrichment, bacterial incubation, and antibiotic protection. Timed luminescence readings indicate initial bacterial internalization...

In Vitro Evaluation of Bacterial Killing by Neonatal Mouse Splenic Phagocytes

Source: Seman, B. G., et al. A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates a neonatal mouse model for studying systemic infection using encapsulated bioluminescent bacteria. Neonatal pups are injected with high- or low-dose bacterial suspensions and returned to their mother for postnatal care. The encapsulated bacteria evade early immune detection, spread systemically, and are visualized over time using luminescence imaging. This model...

Modeling Infection in Neonatal Mice Using Encapsulated Bioluminescent Bacteria

Hier wordt een procedure beschreven voor de oprichting van systemische infectie in de neonatale rat met culturen van Escherichia coli K1. Deze niet-invasieve procedure toestaat kolonisatie van het maagdarmkanaal, translocatie van het pathogeen in de systemische circulatie, en invasie van het centraal zenuwstelsel bij de choroid plexus.

Non-Invasive Model van Neuropathogenic Escherichia coli Infectie in de Neonatale Rat

Hypoxisch-ischemische encefalopathie na perinatale asfyxie kan worden bestudeerd met behulp van diermodellen. We tonen de procedures die nodig zijn voor het opzetten van een biggenmodel van neonatale hypoxisch-ischemische encefalopathie.

Een Knorretje Model van Neonatale hypoxisch-ischemische encefalopathie

Encephalopathie van prematuriteit omvat de afwijkingen van het centrale zenuwstelsel die geassocieerd zijn met letsel door vroeggeboorte. Dit rapport beschrijft een klinisch relevante rattenmodel van in utero tijdelijke systemische hypoxie-ischemie en intra-amniotische lipopolysaccharide toediening (LPS) die chorioamnionitis nabootst, en de gerelateerde impact van infectieuze stimuli en placentale ondervoeding op de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel.

Modellering Encephalopathie van Prematurity gebruik van prenatale hypoxie-ischemie met Intra-vruchtwater Lipopolysaccharide bij ratten

Dit protocol biedt de nodige maatregelen treffen en evalueren van neonatale sepsis in 7 dagen oude muizen.

Een gecontroleerde muismodel voor neonatale Sepsis van de Polymicrobial

We ontwikkelden een model van chorioamnionitis om foetale blootstelling aan maternale ontsteking (FEMI) te simuleren zonder complicaties van levende organismen om de effecten van FEMI op de ontwikkeling van het darmkanaal van het nageslacht te onderzoeken. Dit maakt het mogelijk om mechanistische oorzaken voor de ontwikkeling van darmletsel na chorioamnionitis te bestuderen.

Een murien model van foetale blootstelling aan maternale ontsteking om de effecten van acute chorioamnionitis op de ontwikkeling van pasgeborenen te bestuderen

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Vroeggeboorte (bevalling &lt; 37 weken) is een urgent wereldwijd gezondheidsprobleem met suboptimale preventie- en behandelingsopties. We presenteren een muismodel van oplopende vaginale bacteriële infectie-geïnduceerde vroeggeboorte en schetsen hoe de resulterende neonatale morbiditeit en mortaliteit kunnen worden geanalyseerd.

Modellering van oplopende vaginale infectie, vroeggeboorte en neonatale morbiditeit bij muizen

Dit protocol schetst een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis (NEC) en daaropvolgende isolatie van lamina propria-immuuncellen uit de neonatale muizendunne darm.

Een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis en lamina propria-isolatie voor profilering van immuuncellen

Leer een neonataal beeldvormingsmodel voor gram-negatieve bacteriële sepsis met bioluminescente E. coli in muizen. Deze methode maakt real-time tracking van bacteriële verspreiding en correlatie met ziekte-indicatoren mogelijk.

Een neonatale beeldvorming model van gram-negatieve bacteriële sepsis

Meer video's verkennen