Name: Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Leer adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties isoleren uit intra-abdominale vetweefsel van muizen met FACS of immunomagnetische bead-separatie. Deze methode ondersteunt metabool onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn Lisa Hansen en Kirsten Vestergaard dankbaar voor hun uitstekende technische assistentie, en P. Scherer, N. Joffin en C. Crewe voor het kritisch lezen van het manuscript. De auteurs bedanken de UTSW Flow Cytometry Core voor uitstekende begeleiding en hulp bij het ontwikkelen van de hier beschreven protocollen. R.K.G. wordt ondersteund door NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 en NIDDK R01 DK119163. J.P. wordt gesponsord door een pre-doctorale prijs van het Innovation Fund Denmark.

Alle protocollen en procedures voor dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Use and Care Committee van het Southwestern Medical Center van de Universiteit van Texas.
1. Isolatie van stromale vasculaire fractie (SVF) uit gonadale witte vetweefsel
<ol><li>Ontleed het gonadale witte vetweefsel van muizen van 6-8 weken oud en plaats vetkussentjes in 1x PBS-oplossing.</li>
	<li>Combineer maximaal 4 vetdepots (2-4 depots van 1-2 muizen aanbevolen) en hak het weefsel fijn in een bekerglas van 10 ml met 200 μl spijsverteringsbuffer (1x HBSS, 1,5% BSA en 1 mg/ml collagenase D).</li>
	<li>Breng het gehakte weefsel over in een centrifugebuis van 50 ml met een verteringsbuffer van 10 ml.</li>
	<li>Incubeer het mengsel bij 37 °C in een waterbad gedurende 1 uur terwijl het schudt.</li>
	<li>Filtreer het verteerde weefsel door een celzeef van 100 μm om onverteerd weefsel te verwijderen.</li>
	<li>Verdun het gefilterde monster tot 30 ml met PBS dat 2% FBS bevat en centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Aspireer de supernatant op, die rijpe adipocyten bevat.</li>
	<li>Ga onmiddellijk verder met de voorkeursmethode voor celisolatie.</li>
</ol>2. Isolatie van APC's en FIP's met behulp van FACS
<ol><li>Los de pellet op in 1 ml 1x RBC lysisbuffer door de buis voorzichtig te schudden.</li>
	<li>Incubeer 1-2 minuten bij RT.</li>
	<li>Voeg 10 ml 2% FBS/PBS toe en passeer het door een celzeef van 40 μm in een schone centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Zuig media op en resuspendeer de pellet in 400-800 μL 2% FBS/PBS bevattend Fc-blok (1:200).</li>
	<li>Incubeer bij 4 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Breng 400 μL-800 μL celsuspensies met ≤10,6 cellen per ml over naar buisjes van 1,5 ml en voeg antilichamen toe. De concentraties van antilichamen staan vermeld in de sectie Materiaaltabel .<ol><li>Bereid afzonderlijke regelbuizen voor voor 1) ongekleurde cellen, 2) enkelkleurige bedieningselementen en 3) FMO-bedieningselementen (fluorescentie min één).</li>
		<li>Kleurig de monsters met PDGFRβ-, CD45-, CD31-, CD9- en LY6C-antilichamen.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Zuig media op en resuspendeer cellen in 400 μL 2% FBS/PBS.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Aspireer media en resuspendeer cellen in 400-800 μL 2% FBS/PBS. Leid vervolgens door filterdoppen van 40 μm in 5 ml polystyreen buizen met ronde bodem voor FACS.</li>
	<li>Volg de volgende stappen voor gating.<ol><li>Gebruik ongekleurde en eenkleurige bedieningselementen voor compensatie.</li>
		<li>Gebruik FMO-besturingen om experimentele poorten in te stellen.</li>
		<li>Gebruik de gating-strategie die wordt weergegeven in figuur 1 om APC's en FIP's te verkrijgen. Gate APC's als CD45-, CD31- , PDGFRβ+-, LY6C-, CD9- en FIP's als CD45- , CD31- , PDGFRβ+- , LY6C+- cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verzamel gesorteerde cellen in buisjes met 500 μL 100% serum en houd de cellen op ijs.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Voeg 2% FBS/PBS toe om de cellen te wassen door opnieuw te centrifugeren bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en gebruik de gepelleteerde cellen.</li>
	<li>Resuspendeer de gepelleteerde cellen in het juiste volume gonadale APC-kweekmedia (voor celcultuur) of een geschikte buffer voor latere analyse.</li>
</ol>3. Immunomagnetische scheiding van adipogene en niet-adipogene fracties
<ol><li>Isoleer SVF uit gonadale witte vetweefsel volgens de stappen 1.1-1.7.</li>
	<li>Aspireer het supernatans op en resuspendeer de SVF-pellet in 10 ml 1x in de handel verkrijgbare MS Buffer.</li>
	<li>Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 40 μm.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Aspireer het supernatans en resuspendeer de gepelleteerde cellen in 100 μL 1x MS Buffer.</li>
	<li>Voer CD31+- en CD45+- celdepletie uit zoals hieronder besproken (Figuur 2A, stap 1). Dit wordt gedaan om endotheel- en hematopoëtische afstammingscellen te verwijderen.<ol><li>Tel de cellen met behulp van een cellenteller en pas de concentratie aan tot ≤ 1 x 108 cellen/ml.</li>
		<li>Voeg de biotine-geconjugeerde CD31- en CD45-antilichamen toe aan de celsuspensie, elk in een concentratie van ≤ 0,25 μg per 106 cellen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.</li>
		<li>Was de cellen door 4 ml 1x MS Buffer toe te voegen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet met 100 μL 1x MS-buffer.</li>
		<li>Voeg 10 μL streptavidine nanobeads toe en incubeer de cellen gedurende 15 minuten op ijs.</li>
		<li>Was de cellen door 4 ml 1x MS-buffer toe te voegen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en zuig vervolgens het supernatans op.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 2,5 ml 1x MS-buffer en breng ze over naar een polypropyleen buisje van 5 ml.</li>
		<li>Plaats de buis gedurende 5 minuten in het magnetenrek.</li>
		<li>Verzamel niet-gelabelde cellen door de celsuspensie in een schone centrifugebuis van 15 ml te gieten. OPMERKING: Vermijd het schudden of wegdeppen van hangende druppels, aangezien dit leidt tot besmetting door ongewenste celfractie.</li>
		<li>Verwijder de slang van de magneet en herhaal stap 3.6.9. tot 3.6.11. nog twee keer voor een totaal van 3 wasbeurten.</li>
	</ol></li>
	<li>Scheiding van adipogene en niet-adipogene fracties (figuur 2A, stap 2)<ol><li>Blijf werken met niet-gelabelde breuk (d.w.z. CD45- CD31- breuk).</li>
		<li>Centrifugeer de tube van 15 ml met niet-gelabelde cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Aspireer het supernatans en resuspendeer de pellet in 100 μL 1x MS-buffer.</li>
		<li>Voeg respectievelijk biotinegeconjugeerde LY6C- en CD9-antilichamen toe in een concentratie van ≤ 0,25 μg per 106 cellen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.</li>
		<li>Volg stap 3.6.3. tot 3.6.12. om de tweede scheiding te voltooien.</li>
		<li>Verzamel ongebonden breuken. Niet-gelabelde cellen (LY6C-CD9-) vertegenwoordigen een adipogene fractie die APC's bevat (Figuur 2A, Stap 3).</li>
		<li>Verwijder de slang van de magneet, resuspendeer en elute gebonden cellen in 1x MS-buffer. Eluaten of gelabelde fractie (LY6C+ CD9+), vertegenwoordigt een niet-adipogene fractie die FIP's bevat (Figuur 2A, stap 3).</li>
		<li>Centrifugeer gelabelde en niet-geëtiketteerde fracties bij 600 x g gedurende 5 minuten tot pelletcellen bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Ga onmiddellijk over tot celkweek (stap 6) of gebruik ongedifferentieerde precursoren voor voorkeursanalyses (stap 4 en/of stap 5).</li>
</ol>4. Beoordeel de zuiverheid van adipogene en niet-adipogene fracties door middel van flowcytometrie
<ol><li>Resuspendeer kraal-geïsoleerde celfracties in 200-400 μL 2% FBS/PBS bevattend Fc-blok (1:200).</li>
	<li>Incubeer bij 4 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in buisjes van 1,5 ml en voeg antilichamen toe. De concentraties van antilichamen staan vermeld in de materiaaltabel.<ol><li>Bereid afzonderlijke regelbuizen voor voor 1) ongekleurde cellen, 2) enkelkleurige bedieningselementen en 3) FMO-bedieningselementen.</li>
		<li>Voeg aan de monsters CD45-, CD31-, CD9- en LY6C-antilichamen toe.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubeer bij 4 °C gedurende 15 minuten beschermd tegen licht.</li>
	<li>Centrifugeer op 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Aspireer supernatans en resuspendeer cellen in 400 μL 2% FBS/PBS.</li>
	<li>Centrifugeer de suspensie bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Aspireer het supernatans en resuspendeer cellen in 400-800 μL 2% FBS/PBS. Filtreer door filterdoppen van 40 μm in 5 ml polystyreen buizen met ronde bodem voor analyse door middel van flowcytometrie.</li>
	<li>Flowcytometrieanalyse om de zuiverheid te beoordelen<ol><li>Gebruik ongekleurde en eenkleurige bedieningselementen voor compensatie.</li>
		<li>Gebruik FMO-besturingen om experimentele poorten in te stellen.</li>
		<li>Gebruik de poortstrategie voor levende en enkele cellen, zoals weergegeven in figuur 2B.</li>
		<li>Voer de gating uit zoals weergegeven in afbeelding 2B voor CD45, CD31, LY6C en CD9.</li>
		<li>Gebruik flowcytometriesoftware om de frequenties van CD45-, CD31-, LY6C-, CD9-cellen (APC's) en CD45-, CD31-LY6C+-cellen (FIP's) binnen geïsoleerde fracties te evalueren.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse van genexpressie met behulp van kwantitatieve PCR om de zuiverheid van FIP's en APC's te beoordelen
<ol><li>Extraheer mRNA uit magnetisch of FACS-geïsoleerde cellen met behulp van een in de handel verkrijgbare extractiekit (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Gebruik 1 μg RNA om cDNA te synthetiseren met behulp van een cDNA Reverse Transcriptase-kit (zie Materiaaltabel) door de instructies van de fabrikant te volgen.</li>
	<li>Bepaal de relatieve mRNA-niveaus van APC- en FIP's-selectieve genen (tabel 1) door kwantitatieve PCR met behulp van SYBR groene PCR-mastermix.<ol><li>Stel de monsterreactie voor PCR als volgt in: 5 μL 2x SYBR groene kleurstof, 1 μL cDNA (~50 ng/ μL), 0,5 μL van elke voorwaartse en achterwaartse primer (10 μM) en 3 μL water.</li>
		<li>Gebruik de volgende standaard PCR-omstandigheden voor de kwantitatieve PCR-run: hold-stage: 50 °C gedurende 2 min, 95°C gedurende 10 min; PCR-fase (40 cycli): 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Normaliseer waarden naar de niveaus van het huishoudgen (Rps18) door ΔΔ-Ct te berekenen.</li>
	<li>Om de statistische significantie te evalueren, voert u de t-toets van de ongepaarde student uit.</li>
</ol>6. Celcultuur en differentiatie
<ol><li>Centrifugeer magnetisch of FACS-geïsoleerde cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 500 μl gonadale APC-kweekmedia en plaat 40K cellen/putje van elke fractie in een kweekplaat met 48 putjes.</li>
	<li>Vervang de media elke 1-2 dagen. APC's zullen differentiatie in adipocyten beginnen te ondergaan naarmate ze samenvloeiing naderen. FIP's die in dezelfde media worden bewaard, zijn resistent tegen het ondergaan van adipogenese.</li>
</ol>

<ol><li>Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipokines+in+inflammation+and+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adipokines in inflammation and metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).</li>
<li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Eto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+structure+and+cellular+components+of+aspirated+and+excised+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).</li>
<li>Hirsch, J., Batchelor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+cellularity+in+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue cellularity in human obesity.</a> Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).</li>
<li>Ghaben, A. L., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and metabolic health.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).</li>
<li>Hepler, C., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expanding+problem+of+adipose+depot+remodeling+and+postnatal+adipocyte+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment.</a> Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).</li>
<li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and%2For+Hyperplasia%3A+Dynamics+of+Adipose+Tissue+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth.</a> PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324(2009).</li>
<li>Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+remodeling+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue remodeling and obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).</li>
<li>Kloting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Tissue+Remodeling%3A+Its+Role+in+Energy+Metabolism+and+Metabolic+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30(2016).</li>
<li>Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+adipocyte+precursors+and+their+role+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease.</a> Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> Elife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364 (6438), 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).</li>
<li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Dissection+of+Diverse+Mouse+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).</li>
<li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).</li>
<li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+white+adipose+hyperplastic+potential+is+associated+with+enhanced+susceptibility+to+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).</li>
<li>Vishvanath, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfrbeta%2B+Mural+Preadipocytes+Contribute+to+Adipocyte+Hyperplasia+Induced+by+High-Fat-Diet+Feeding+and+Prolonged+Cold+Exposure+in+Adult+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).</li>
<li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development%2C+expansion+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li>
<li>Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRalpha%2FPDGFRbeta+signaling+balance+modulates+progenitor+cell+differentiation+into+white+and+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes.</a> Development. 145 (1), 155861(2018).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Buffolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Paracrine+Signaling+Mechanism+Linking+CD34%28high%29+Progenitors+to+the+Regulation+of+Visceral+Fat+Expansion+and+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling.</a> Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).</li>
<li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+adipocyte+differentiation+from+Pdgfrbeta%28%2B%29+preadipocytes+protects+against+pathologic+visceral+adipose+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity.</a> Nature Communications. 9 (1), 890(2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6+family+proteins+in+neutrophil+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Ly6 family proteins in neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).</li>
<li>Vijay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+adipose+tissue+identifies+depot+and+disease+specific+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types.</a> Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).</li>
</ol>

T.A.P. is een werknemer en aandeelhouder van Novo Nordisk A/S

De C57BL/6-muizenstam is de meest gebruikte muizenstam in onderzoeken naar door voeding geïnduceerde obesitas. C57BL/6-muizen komen snel aan wanneer ze op een vetrijk dieet (HFD) worden geplaatst en ontwikkelen enkele van de prominente kenmerken van het metabool syndroom geassocieerd met obesitas (bijv. insulineresistentie en hyperlipidemie). Met name WAT-uitbreiding die optreedt in verband met voeding met een vetrijk dieet (HFD) vindt plaats op een depotspecifieke manier 19,20,21,22,23.</sup...

Wit vetweefsel (WAT) vertegenwoordigt de belangrijkste plaats voor energieopslag bij zoogdieren. In dit weefsel slaan adipocyten, of 'vetcellen', overtollige calorieën op in de vorm van triglyceriden, verpakt in grote uniloculaire lipidedruppels. Bovendien scheiden adipocyten een groot aantal factoren af die verschillende aspecten van energiehomeostase reguleren 1,2,3. Adipocyten vormen het grootste deel van het WAT-volume; adipocyten vertegenwoordigen echter slechts minder dan 50% van het totale aantal cellen dat wordt aangetroffen in WAT 4,5. Het niet-adipocytencompartiment van WAT, of stromale-vasculaire fractie (SVF), is vrij heterogeen en bevat vasculaire endotheelcellen, weefsel-residente immuuncellen, fibroblasten en populaties van adipocytenprecursorcellen (APC).
WAT is uitzonderlijk in zijn opmerkelijke vermogen om in omvang uit te breiden naarmate de vraag naar energieopslag toeneemt. Het handhaven van deze weefselplasticiteit is essentieel, aangezien een adequate opslag van lipiden in WAT beschermt tegen schadelijke ectopische lipideafzetting in niet-vetweefsels6. De manier waarop individuele WAT-depots deze expansie ondergaan als reactie op een calorieoverschot is een cruciale bepalende factor voor insulinegevoeligheid in de setting van obesitas7. Pathologische WAT-expansie, waargenomen bij zwaarlijvige personen met metabool syndroom, wordt gekenmerkt door preferentiële expansie van viscerale WAT-depots ten koste van metabolisch gunstig onderhuids vetweefsel. Bovendien wordt insulineresistentie bij obesitas in verband gebracht met pathologische remodellering van WAT. Dit wordt gekenmerkt door hypertrofische groei van bestaande adipocyten (toename in omvang), ontoereikende angiogenese, chronische metabole ontsteking, accumulatie van extracellulaire matrixcomponenten (fibrose) en weefselhypoxie 8,9. Deze WAT-fenotypes van obesitas worden geassocieerd met leversteatose en insulineresistentie, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen bij de aandoening van lipodystrofie (afwezigheid van functionele WAT). Daarentegen wordt gezonde WAT-expansie waargenomen in de metabolisch gezonde zwaarlijvige populatie en wordt gekenmerkt door preferentiële expansie van beschermende subcutane WAT en depot-expansie door adipocytenhyperplasie10. De rekrutering van nieuwe adipocyten wordt gemedieerd door de novo differentiatie van adipocyten uit adipocytenprecursorcellen (APC's) ("adipogenese" genoemd). Hyperplasie van adipocyten valt samen met relatief lagere graden van WAT-fibrose en metabole ontsteking 6,11. Een veelheid aan celtypen binnen de WAT-micro-omgeving heeft een directe invloed op de gezondheid en uitbreidbaarheid van WAT bij obesitas12. Als zodanig blijft het definiëren van de functie van de verschillende celtypen die aanwezig zijn in WAT een hoge prioriteit voor het veld.
In het afgelopen decennium zijn verschillende strategieën gebruikt om inheemse APC's te definiëren en te isoleren van menselijke en muizen WAT SVF13. Dergelijke strategieën isoleren APC's op basis van de expressie van het celoppervlak van gemeenschappelijke mesenchymale stam-/voorlopercelmarkers met behulp van op antilichamen gebaseerde celscheidingstechnieken. Deze benaderingen omvatten fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), met behulp van fluorofoor-gelabelde antilichamen, of immunomagnetische parelscheiding (d.w.z. chemisch gemodificeerde antilichamen). Celoppervlakte-eiwitten die het doelwit zijn van de isolatie van APC's zijn PDGFRα, PDGFRβ, CD34 en SCA-1. Deze benaderingen hebben bijgedragen aan de verrijking van APC's; Celpopulaties geïsoleerd op basis van deze markers zijn echter vrij heterogeen. Zeer recente single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) studies hebben de moleculaire en functionele heterogeniteit van stromale cellen binnen de geïsoleerde stromale-vasculaire fractie (SVF) van muizen WAT 14,15,16,17 aan het licht gebracht. Op basis van onze eigen scRNA-seq en functionele analyses hebben we functioneel verschillende immuunmodulerende en adipogene PDGFRβ+ perivasculaire celsubpopulaties geïdentificeerd en gekarakteriseerd in het stromale compartiment van intra-abdominaal WAT bij volwassen muizen15. Fibro-inflammatoire precursoren, of FIP's, vertegenwoordigen een prominente subpopulatie van PDGFRβ+-cellen en kunnen worden geïsoleerd op basis van LY6C-expressie (LY6C+ PDGFRβ+-cellen)15. FIP's missen adipogene capaciteit, oefenen een sterke pro-inflammatoire reactie uit op verschillende stimuli, produceren collageen en scheiden anti-adipogene factorenaf 15. De pro-inflammatoire en fibrogene activiteit van deze cellen neemt toe in verband met obesitas bij muizen, wat impliceert dat deze cellen reguleren van WAT-remodellering. De LY6C-CD9-PDGFRβ+-subpopulatie vertegenwoordigt adipocytenprecursorcellen (APC's). Deze APC's zijn verrijkt door de expressie van Pparg en andere pro-adipogene genen, en differentiëren gemakkelijk tot rijpe adipocyten in vitro en in vivo15. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van deze verschillende celpopulaties uit intra-abdominale WAT-depots van volwassen muizen met behulp van FACS, en immunomagnetische parelscheiding met gebiotinyleerde antilichamen. Dit protocol kan worden gebruikt om functioneel verschillende subpopulaties van vetvoorlopercellen te isoleren van meerdere intra-abdominale WAT-depots van volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen15. Het afzonderlijk bestuderen van deze functioneel verschillende celpopulaties kan een grote bijdrage leveren aan ons huidige begrip van de moleculaire mechanismen die adipogenese en de remodellering van intra-abdominaal vetweefsel bij gezondheid en ziekte reguleren.
Het onderstaande protocol beschrijft de isolatie van vetvoorlopercellen van muizen epididymale WAT; dezelfde procedure kan echter worden gebruikt om overeenkomstige cellen te isoleren uit de mesenteriale en retroperitoneale WAT-depots van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen15. Een gedetailleerd protocol over hoe deze depots bij muizen te identificeren en te isoleren is te vinden in Bagchi et al.18. Dit protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van muizen van 6-8 weken oud. De frequentie en het differentiatievermogen van APC's kunnen afnemen in verband met veroudering.

```html
<table><tbody><tr><td>Mechanische weefselvoorbereiding en SVF-isolatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 en 100 &micro;m celstrainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5ml polypropyleen buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestiebuffer (voor 10mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg Collagenase D (1 mg/ml uiteindelijke cc.)</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0.15 g BSA (1.5 % uiteindelijke cc.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immunomagnetische scheiding van APC's en non-APC's</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X MojoSort Buffer (MS buffer)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSort Magneet (MS magneet)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reinheitsprüfung und FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Rode Bloedcel Lysis Buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc block (Muis CD16/CD32)</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>Concentratie: &le; 0.25 &micro;g per 10^6 cellen Soort: Muis Kloon: 30-F11</td></tr><tr><td>Biotin CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>Concentratie: &le; 0.25 &micro;g per 10^6 cellen Soort: Muis Kloon: MEC13.3</td></tr><tr><td>Biotin CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>Concentratie: &le; 0.25 &micro;g per 10^6 cellen Soort: Muis Kloon: MZ3</td></tr><tr><td>Biotin LY6C</td><td>BioLegend</td><td>128003</td><td>Concentratie: &le; 0.25 &micro;g per 10^6 cellen Soort: Muis Kloon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>Concentratie: Verdunning 1:400 Soort: Muis Kloon: 390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>Concentratie: Verdunning 1:400 Soort: Muis Kloon: 30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>Concentratie: Verdunning 1:50 Soort: Muis Kloon: APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>Concentratie: Verdunning 1:400 Soort: Muis Kloon: HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>Concentratie: Verdunning 1:400 Soort: Muis Kloon: MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur en Differentiatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gonadale APC Cultuur media (voor 500mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM met 1 g/L glucose</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Foetale boviene serum (FBS)** lot#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 100% ITS premix</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM L-ascorbinezuur-2-2fosfaat</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro;L 100 g/ml FGF-basic</td><td>R&amp;D systems</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 &micro;L Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**OPMERKING: Het adipogene vermogen van primaire APC's kan variëren van lot tot lot van commercieel FBS. Meerdere lots/bronnen van FBS moeten worden getest.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

De stromale-vasculaire fractie (SVF) van wit vetweefsel (WAT) is opmerkelijk heterogeen en bestaat uit talrijke celtypen die functioneel bijdragen aan de uitbreiding en hermodellering van WAT op volwassen leeftijd. Een enorme barrière voor het bestuderen van de implicaties van deze cellulaire heterogeniteit is het onvermogen om gemakkelijk functioneel verschillende celsubpopulaties te isoleren van WAT SVF voor in vitro en in vivo analyses. Single-cell sequencing-technologie heeft onlangs functioneel verschillende fibro-inflammatoire en adipogene PDGFRβ+ perivasculaire celsubpopulaties geïdentificeerd in intra-abdominale WAT-depots van volwassen muizen. Fibro-inflammatoire voorlopercellen ("FIP's" genoemd) zijn niet-adipogene collageenproducerende cellen die een pro-inflammatoir fenotype kunnen uitoefenen. PDGFRβ+ adipocytenprecursorcellen (APC's) zijn zowel in vitro als in vivo bij celtransplantatie zeer adipogeen. Hier beschrijven we meerdere methoden voor de isolatie van deze stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale WAT-depots van muizen. FIP's en APC's kunnen worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) of door gebruik te maken van op biotinylated antilichamen gebaseerde immunomagnetische pareltechnologie. Geïsoleerde cellen kunnen worden gebruikt voor moleculaire en functionele analyse. Het bestuderen van de functionele eigenschappen van de subpopulatie van stromale cellen in isolatie zal onze huidige kennis van de hermodellering van vetweefsel onder fysiologische of pathologische omstandigheden op cellulair niveau uitbreiden.

Dit protocol beschrijft twee strategieën die de isolatie van verschillende stromale celpopulaties uit intra-abdominale WAT-depots van volwassen muizen mogelijk maken. APC's en FIP's kunnen worden geïsoleerd door FACS (Figuur 1) of immunomagnetische parelscheiding met gebiotinyleerde antilichamen (Figuur 2). Beide benaderingen maken gebruik van reagentia en antilichamen die allemaal in de handel verkrijgbaar zijn. Immunomagnetische parelscheiding leidt tot de sch...

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

Het protocol stelt onderzoekers in staat om functioneel en moleculair verschillende subpopulaties van perigonadale witte vetweefsel stromale cellen te isoleren uit muismodellen van belang. Het voordeel van deze techniek is dat alle gereedschappen en reagentia wijd beschikbaar zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door Lavanya Vishvanath, een senior laboratoriumonderzoeksanalyticus uit het laboratorium van Dr. Rana Gupta.Na isolatie van stromale vasculaire cellen uit gonadale witte vetweefsels, of WAT, suspendeert u de celpellet in één milliliter rode bloedcel lysis buffer voor een incubatie van één tot twee minuten bij kamertemperatuur. Stop de lysis met 10 milliliter 2%FBS en PBS en filter de cellen door een 40 micron celzeef in een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis. Verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer het pellet in 400 tot 800 microliters FBS en PBS, aangevuld met FC blok.Na een incubatie van 10 minuten bij vier graden Celsius, brengt u 400 tot 800 microliters cellen over naar het juiste aantal buizen voor fluorosceïne-geconjugeerde antilichaamkleuring en label de cellen met de controle- en experimentele antilichamen van belang bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, pellet de cellen door centrifugatie en was de cellen in 400 microliters vers FBS en PBS per buis. Na de wassing, suspendeer de pellets in 400 tot 800 microliters vers FBS en PBS per buis, en filter de cellen door 40 micron filterdoppen in vijf milliliter polystyreen ronde bodembuizen voor FACS.Stel de compensatie en experimentele poorten in om de antigeen-presenterende cellen en fibro-inflammatoire progenitors te verkrijgen. Na celsortering, verzamel en was de cellen door centrifugatie, en suspendeer de pellets in 500 microliters gonadale antigeen-presenterende celcultuurmedium per fractie. Voor immunomagnetische kraalscheiding van de adipogeen en niet-adipogeen celfracties, suspendeer de stromale vasculaire pellet in 10 milliliter MS buffer en filter de cellen door een 40 micron zeef.Na het tellen, verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer de cellen bij niet meer dan één maal 10 tot de achtste cellen per milliliter MS buffer concentratie. Voeg vervolgens niet meer dan 0,25 gram anti-CD31 en anti-CD45 biotin-geconjugeerd antilichaam toe per één maal tien tot de zes cellen voor een 15 minuten incubatie op ijs. Aan het einde van de incubatie, was de cellen in vier milliliter MS buffer door centrifugatie, en suspendeer het pellet in 100 microliters vers MS buffer.Voeg 10 microliters streptavidin nanokralen toe aan de cellen voor een 15 minuten incubatie op ijs, gevolgd door een andere wassing in vier milliliter MS buffer. Suspendeer het pellet in 2,5 milliliter vers MS buffer en breng de cellen over naar een vijf milliliter polypropyleen buis. Plaats de buis vijf minuten op een magneet voordat u de ongelabelde cellen afgiet in een nieuwe 15 milliliter centrifugebuis.Herhaal de wassing nog twee keer zoals gedemonstreerd, trek de ongelabelde cellen na elke wassing, en verzamel de endotheel- en hematopoietische lijn-gedepleteerde cellen door centrifugatie. Suspendeer het pellet in 100 microliters MS buffer en label de cellen met niet meer dan 0,25 microgram Ly6C en CD-9 antilichamen per één maal tien tot de zesde cellen gedurende 15 minuten op ijs. Aan het einde van de incubatie, verzamel de ongebonden Ly6C negatieve CD-9 negatieve adipogeen cellen zoals zojuist gedemonstreerd voordat u de Ly6C positieve niet-adipogeen cellen verzamelt.Verzamel vervolgens beide celpopulaties door centrifugatie en suspendeer de cellen in 500 microliters gonadale antigeen-presenterende celcultuurmedium per fractie. Om celculturen voor differentiatie op te zetten, plateer elke fractie bij vier maal tien tot de vierde cellen per put in concentratie in afzonderlijke putjes van een 48-wel plate en plaats de platen gedurende zeven tot 10 dagen in de celcultuur incubator. De adipocyte precursor cellen zullen beginnen met differentiatie naar adipocyten terwijl ze de confluentie naderen, terwijl de fibro-inflammatoire progenitoren resistent zullen zijn tegen adipogenese.Met behulp van dit protocol kunnen verschillende stromale celpopulaties worden geïsoleerd uit intraabdominale WAT depots van volwassen muizen door FACS of immunomagnetische kraalscheiding zoals gedemonstreerd. Met immunomagnetische kraalscheiding kunnen adipogeen en niet-adipogeen cellen worden geïsoleerd uit de gonadale WAT stromale vasculaire fractie. Zoals waargenomen door flowcytometrie, is 75%van de cellen binnen de adipogeen fractie Ly6C negatieve CD-9 negatieve adipocyte precursor cellen, terwijl meer dan 75%van de niet-adipogeen fractie, Ly6C positieve fibro-inflammatoire progenitor cellen.Adipocyte precursor cellen geïsoleerd met beide methoden differentiëren in lipide-bevattende adipocyten met een hoge zuiverheid binnen zeven tot 10 dagen na plateren. In tegenstelling daarmee blijven niet-adipogeen precursoren fibroblast-achtig en worden niet adipocyten onder dezelfde kweekomstandigheden. Het protocol werkt voor de isolatie van adipogeen en fibro-inflammatoire stromale cel subpopulaties uit perigonadale witte vetweefsel.Vergelijkbare celpopulaties kunnen worden gevonden in andere vetdepots van muizen. Echter, hun selectie zal afhangen van het gebruik van verschillende antilichamen. De celpopulaties geïsoleerd door FACS en magnetische scheiding kunnen worden gebruikt voor in vitro assays van celdifferentiatie of verder gekenmerkt door genexpressieanalyse.

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren de technieken die nodig zijn om de stromale vasculaire fractie (SVF) te isoleren uit de inguinale (subcutane) en perigonale (viscerale) vetweefsel depots van muizen om hun genexpressie en collagenolytische activiteit te beoordelen. Deze methode omvat de verrijking van Sca1high vet-afgeleide stamcellen (ASCs) met behulp van immunomagnetische celscheiding.

Immunomagnetische Scheiding van Fat Depot-specifieke SCA1<sup&gt; hoog</sup&gt;-Vetcellen afgeleide stamcellen (ASC)

Hier worden een methode beschreven voor het isoleren van Adipocyte Progenitor Cell (APC) populaties uit Perivascular Adipose Tissue (PVAT) met behulp van Magnetisch-geactiveerde Cell Sorting (MCS). Deze methode zorgt voor een verhoogde isolatie van APC per gram vetweefsel in vergelijking met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Dit protocol beschrijft de semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit muizenvetweefsel om preadipocyten te verkrijgen en adipocytendifferentiatie in vitro te bereiken. Het gebruik van een weefseldissociator voor collagenasevertering vermindert experimentele variatie en verhoogt de reproduceerbaarheid.

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

Hier beschrijven we de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, waardoor de perivasculaire vetweefselfunctie en de relatie met vasculaire cellen kunnen worden bestudeerd.

Isolatie, kweek en adipogene inductie van van stromale vasculaire fractie afgeleide preadipocyten uit periiaorta-vetweefsel van muizen

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Hier presenteren we een standaardmethode om effectief stamcellen en adipocyten van vetweefsel te isoleren, gekenmerkt door &gt;90% vermindering van verwerkingstijd, hoge cellevensvatbaarheid en brede compatibiliteit.

Efficiënte isolatie van vetweefselstamcellen en adipocyten uit varkensvet vetweefsel

Leer adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties isoleren uit intra-abdominale vetweefsel van muizen met FACS of immunomagnetische bead-separatie. Deze methode ondersteunt metabool onderzoek.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Meer video's verkennen