Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Deze methode is belangrijk omdat het kan worden gebruikt in diverse bacteriële soorten om essentiële genen, antibioticaresistentie genen en genen belangrijk voor in vivo fitness tijdens infectie te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het mechanisch delen van genomisch DNA en Poly-CTL editie, die de noodzaak van dure beperking enzymen, adapter straling en gel zuivering elimineren. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de therapie van problematische bacteriële infecties, omdat genen die als belangrijk voor infectie of antibioticaresistentie worden geïdentificeerd, als doelwit voor nieuwe antimicrobiële therapieën kunnen dienen.

Deze methode kan inzicht geven in complexe genotype, fenotype relaties tussen gram-negatieve en gram-positieve bacteriële soorten, en het verbeteren van onze huidige kennis van bacteriële genetica. Om te beginnen, overdracht 's nachts culturen tot 50 milliliter conische buizen, en pellet zowel ontvanger en donor culturen met behulp van centrifugatie op 5,000 keer G gedurende 7 minuten. Gooi de supernatant weg.

Gebruik een serologische pipet van 10 milliliter om de donorsampellet opnieuw op te schorten in 4,5 milliliter LB, aangevuld met diaminopimetaalzuur. Breng de opnieuw geschorste donorstam over in de buis van de ontvangerstam. En verdeel onmiddellijk de paringssuspensie als individuele 100 microliterdruppels op LB agar platen, aangevuld met diaminopeimelaatzuur Incubaat de platen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.

Breng de platen vervolgens voorzichtig over naar een couveuse van 37 graden Celsius en laat de culturen een uur paren. Voeg na de incubatie 1,5 milliliter LB toe op elke plaat en oogst de bacteriën tot een conische buis van 50 milliliter. Pellet de gedekte cellen met behulp van centrifugatie op 5.000 keer G gedurende zeven minuten.

Gooi vervolgens de supernatant weg en schorst de cellen opnieuw in 10 milliliter LB, om restdiamimelic zuur te verwijderen Pellet de cellen opnieuw en herhaal de wasbeurt met LB. Wanneer u klaar bent met het gebruik van een 10 milliliter serologische pipet om de pellet opnieuw op te schorten in 10 milliliter LB, aangevuld met 25%glycerol. Verspreid de cellen op platen, volgens de handschrift aanwijzingen. Dan, incubeer de platen op 37 graden Celsius, 's nachts.

Maak een milliliter aliquots van de resterende bacteriën en bewaar ze op min 80 graden Celsius. Giet een aliquot van de bevroren paring op ijs. Gebruik vervolgens steriele glazen kralen om 150 microliter van de verdunning te verspreiden, op elke 30 bij 150 millimeter Luria-Bertani agarplaat, aangevuld met Kanamycine.

Gooi de gebruikte buis met overtollige paring en incubeerplaten bij 37 graden Celsius gedurende 14 uur. Na de incubatietelling de kolonie die eenheden op elke plaat vormt om de totale mutanten in de transposonbibliotheek te schatten. Tel 20% van ten minste drie platen om de schatting van de kolonietelling voor de gehele groep platen te bepalen.

Na het berekenen van de geschatte kolonie opbrengst, voeg drie tot vijf milliliter LB aan elke plaat, en schraap de bacteriën met behulp van een steriele schraapgereedschap. Trek bacteriële suspensies van alle platen in 50 milliliter conische buizen, en pellet de suspensies door centrifugeren op 5,000 keer G, gedurende zeven minuten. Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in vijf milliliter LB, aangevuld met 30%glycerol.

Maak vervolgens een milliliter aliquots van de transposon bibliotheek in cryovials en bewaar ze op min 80 graden Celsius. Verdun de gDNA met TE-buffer tot een concentratie van 250 nanogram per microliter, in een totaal volume van 200 microliter, en plaats het in het waterbad sonicator. Soniceer het DNA om fragmenten van ongeveer 300 nucleotiden op te leveren.

Bevestig dat het DNA wordt gesneden door het uitvoeren van 10 microliter van ongehoord DNA en 10 microliter van afschuifde DNA, op een 1%hog roast gel. Herhaal de sonicatie, indien nodig. Om de Polly zaadstaart toe te voegen aan het drieste uiteinde van het pure DNA, stel de beleidsreactie op zoals beschreven in het tekstmanuscript en ontcubeer de reactiebuizen gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Om de beleidsreactie te zuiveren, voeg een 40 microliter van grootte selectie paramagnetische kralen aan elk monster en vortex de reactiebuis. Incubeermonsters bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Vervolgens, kort centrifugeren ze om de vloeistof te verzamelen op de bodem van de buis.

Breng de buizen naar een magnetisch rek en broed ze twee minuten op kamertemperatuur of totdat de oplossing duidelijk is. Verwijder voorzichtig de supernatant en voeg 200 microliter vers bereide, 80%-ethanol toe, zonder de kralen te storen. Broed de monsters uit tot de oplossing duidelijk is.

Verwijder vervolgens de supernatant en herhaal de ethanol wasbeurt. Vercentrifugeren de buizen kort en leg ze terug in het magnetische rek, om eventuele resterende vloeistof te verwijderen. Broed de monsters op kamertemperatuur gedurende twee tot vijf minuten om ze te laten drogen.

En voeg 25 microliter water toe aan elke buis. Vortex ze voor ongeveer vijf seconden of pipet op en neer. Vervolgens centrifugeren de buizen om vloeistof te verzamelen aan de onderkant.

Breng de buizen naar het magnetische rek en laat ze ongeveer twee minuten zitten totdat de oplossing duidelijk is. Breng vervolgens de supernatant over naar een nieuwe buis zonder de kralen te storen. Dit protocol werd gebruikt om een hoge dichtheid transposon bibliotheek in A-baumannii stam ATCC 17978, door middel van bacteriële vervoeging met behulp van E-coli MFD DAP auxotroph, die de plasmid pJNW684 repliceert.

De getrokken A-baumannii transposon mutant bibliotheek werd gebruikt om fitnessfactoren te identificeren, belangrijk voor Colistin resistentie onder subremmende concentraties van de anti-microbiële. Na het uitputten van de gemuteerde bibliotheek van genen die bijdragen aan colistin resistentie, werd de totale gDNA van de resterende bibliotheektrek geïsoleerd van controle en experimentele culturen. De gDNA was gefragmenteerd met mechanische afschuif en een beleidsstaart werd toegevoegd aan de DNA-fragmenten ter voorbereiding op sequencing.

DNA-concentraties werden berekend en de monsters werden geanalyseerd met behulp van chip gebaseerde capillaire elektroforese, om succesvolle bibliotheek bouwt te bevestigen. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is het aanpassen van de paring volume, op basis van CFU telt voor specifieke doelstammen om een hoge resolutie mutant bibliotheek te genereren. Bovendien moet de ontvanger stam gevoelig zijn voor de antibioticaresistentie marker, met behulp van de transposon voorafgaand aan mutagenese.

Na deze procedure kan genverwijding of geluidsdeleer worden uitgevoerd om afzonderlijke hoofden uit sequencing-resultaten te halen en genen van belang te valideren onder betwiste omstandigheden.