Name: Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Leer functionele isolatie van enkele motorische eenheden in de mediale gastrocnemius van ratten via elektrische stimulatie. Deze methode registreert kracht en actiepotentialen voor neuromusculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Poolse Nationale Onderzoekscentrum subsidie 2018/31/B/NZ7/01028.

Alle procedures moeten worden goedgekeurd door de plaatselijke ethische commissie en voldoen aan de richtsnoeren van de Europese Unie inzake dierverzorging en de nationale wetgeving inzake de bescherming van dieren.
OPMERKING: Elke experimentator die betrokken is bij deze procedure moet worden opgeleid in elementaire chirurgische ingrepen en moet een geldige licentie verkrijgen voor het uitvoeren van dierproeven.
1. Anesthesie
<ol><li>Verdoven de rat met een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (een initiële dosis van 60 mg·kg-1).</li>
	<li>Controleer na ongeveer 5 minuten de diepte van de anesthesie door het oor of de voorpoot van de rat te knijpen met stompe tangen. Ga alleen naar de volgende stappen van het protocol wanneer er geen reflexactie wordt waargenomen.</li>
	<li>Controleer het dier tijdens de operatie elke 10-15 minuten op reflexacties en vul anesthesie aan als het dier reageert op een snuifje met beweging (meestal 10 mg·kg-1·h-1 natriumpentobarbital, IP).</li>
</ol>2. Chirurgie
<ol><li>Bereid het dier voor op de chirurgische ingreep door de vacht over de linker achterpoot te scheren van de hiel naar de heup (het eerste segment, spier- en zenuwisolatie), de rechter achterpoot van de hiel naar de heup (het tweede segment, grondelektrode) en de achterkant van de staart naar de thoracale segmenten (het derde segment, laminectomie). Antiseptisch is niet nodig vanwege de acute aard van het experiment.<ol>
<li>Leg de rat op zijn buik op een verwarmingskussen (37 °C ± 1 °C.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laminectomie<ol>
<li>Snijd met behulp van een stompe schaar de huid langs de wervelkolom van het heiligbeen tot aan de borstwervels.</li>
		<li>Scheid de huid van de onderliggende spieren.</li>
		<li>Knip met behulp van een stompe puntschaar de longissimus-spier aan beide zijden van het heiligbeen en de spineuze processen van de lendenen uit.</li>
		<li>Identificeer de S1 wervel als het laagste segment. Snijd en verwijder met behulp van een stompe schaar de spinachtige processen van L6 tot L2-wervels. Verwijder vervolgens met fijne rongeurs de dwarse processen L6-L2 en voer een laminectomie uit over L6 – L2-segmenten (eerst dwarse processen, dan lamina, begin met L6-wervelsegment) om de lendensegmenten van het ruggenmerg dat door de duramater wordt bedekt, bloot te leggen. Let erop dat u het sacrale bot en het L1-spinneproces niet doorknipt, dat zal worden gebruikt als fixatiepunt voor immobilisatie van dieren.</li>
		<li>Snijd met behulp van een scherpe schaar het ruggenmerg (het staartfragment) en de rug- en ventrale wortels op L2-wervelsegmentniveau, aan de bovenrand van laminectomie. Plaats kleine stukjes gedroogd gelschuim om het bloeden te stoppen. Plaats vervolgens een dunne, met zout doordrenkte watten over de blootgestelde dwarslaesiesegmenten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolatie van mediale gastrocnemiusspier en zijn zenuw<ol>
<li>Met behulp van een scherpe schaar, maak een longitudinale snede op de achterste kant van de linker achterste ledemaat, van de achillespees tot de heup.</li>
		<li>Grijp de huid met de tangen en scheid de huid van de onderliggende spieren aan beide zijden van de incisie.</li>
		<li>Zoek de popliteal fossa aan de achterkant van het kniegewricht, die wordt bedekt door de biceps femoris spier. Maak met behulp van een schaar een snede tussen het voorste en achterste deel van deze spier.</li>
		<li>Naar boven bewegen, snijd de twee hoofden van de biceps femoris helemaal naar de heup om de heup zenuw bloot te leggen.</li>
		<li>Met behulp van stompe tangen en scharen, scheid de laterale van de mediale hoofd van de gastrocnemiusspier en snijd de distale invoeging (achillespees) van de mediale gastrocnemiusspier. Bewaar het fragment van achillespees zo lang mogelijk om het te gebruiken om verbinding te maken met de krachttransducer.</li>
		<li>Identificeer de mediale gastrocnemius (MG) zenuw. Met behulp van de tang en schaar, snijd alle resterende zekerheden van de heupzenuw, met inbegrip van onderpand aan achterste biceps en semitendinosus. Laat de bloedvaten aan de mediale gastrocnemius intact.</li>
		<li>Rijg een niet-elastische ligatuur door de achillespees en maak drie knopen.</li>
		<li>Plaats een zout-doorweekt stuk watten onder de blootgestelde zenuw en spier.</li>
		<li>Met behulp van gekartelde tangen, sluit de huid over het geopereerde gebied.</li>
		<li>Maak met behulp van een scherpe schaar een incisie van 2 cm in de huid en onderliggend bindweefsel langs de voorste kant van de linkerachterledepot voor immobilisatie met een metalen klem (3.1.6.).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Voorbereiding op de opname en stimulatie
<ol><li>Wervelkolom- en beenfixatie en spieropstelling<ol>
<li>Met behulp van een stalen klem, bevestig de linker achterpoot door het zetten van de klem op het scheenbeen.</li>
		<li>Plaats de rat in het op maat gemaakte verstelbare frame (geïsoleerde koperdraad, 1 mm), trek de huidkleppen rond de laminectomie op met behulp van vier ligaturen en hecht de huid aan het frame om een zwembad voor paraffineolie (grootte ongeveer 50 mm x 50 mm) over het blootgestelde ruggenmerg te vormen.</li>
		<li>Met behulp van een Dumont #55 tangen, til de dura mater op de kruising van het ruggenmerg, snijd het caudally tot het sacrale bot en trek het in.</li>
		<li>Met behulp van een stompe glazen staaf, scheiden linker en rechter rug en ventrale wortels op opeenvolgende niveaus, zorg ervoor dat ze niet beschadigen.</li>
		<li>Vul het zwembad over het ruggenmerg met warme (37 °C) paraffineolie, die de blootgestelde ventrale en rugwortels bedekt.</li>
		<li>Plaats de rat op de op maat gemaakte aluminium plaat (lengte 260 mm, breedte 120 mm, hoogte 80 mm) met een zwembad (lengte 135 mm, breedte 100 mm, diepte 45 mm) voor zijn achterpoten aangesloten op het gesloten-lus verwarmingssysteem. De plaat is een plek waar het dier zal worden geïmmobiliseerd en het experiment zal worden uitgevoerd.</li>
		<li>Bevestig de klem op de linker achterpoot met de metalen balk om de hindimb te immobiliseren.</li>
		<li>Bevestig de wervelkolom door stalen klemmen op het sacrale bot en de L1-wervel te plaatsen om het dierlijk lichaam te immobiliseren en de artefacten te elimineren die van kracht zijn opnamen die verband houden met ademhalingsbewegingen.</li>
		<li>Sluit de linker mediale gastrocnemiusspier met de niet-elastische ligatuur aan op de krachttransducer (met inachtneming van 50 μm/250 mN, meetbereik 0-1000 mN) via de achillespees.</li>
		<li>Vul de kamer voor achterpoten met warme (37 °C) paraffineolie om de mediale gastrocnemiusspier te bedekken en de olietemperatuur op 37 °C ± 1 °C te houden met behulp van de temperatuursonde en het automatische systeem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaatsing van elektroden voor actie potentialies opname en stimulatie<ol>
<li>Steek een bipolaire zilverdraadelektrode door het middelste deel van de mediale gastrocnemiusspier, loodrecht op zijn lange as. Houd ongeveer 5 mm afstand tussen de twee elektroden gelegen langs een lange as van de spier. Deze elektroden zullen worden gebruikt om motor-eenheid actie potentialen (MUAPs) record. Sluit de elektroden aan op de geluidsarme versterker.</li>
		<li>Strek de geopereerde spier uit tot een passieve spanning van 100 mN, gecontroleerd door de krachttransducer. Voor rat mediale gastrocnemius op dit stuk ontwikkelen de MUs van drie soorten de hoogste twitch force15.</li>
		<li>Maak met behulp van een scherpe schaar een incisie van 2 cm in de huid van de rechter achterpoot en voeg een zilverdraadelektrode in die als referentieelektrode kan worden gebruikt.</li>
		<li>Plaats en bevestig een op maat gemaakte geïsoleerde metalen plaat (maat 30 mm x 13 mm) boven de blootgestelde ruggegraatswortels. Leg linkerparen ventrale en rugwortels (L4, L5 en L6) op de plaat.</li>
		<li>Voeg zout aan het zwembad gevormd door de huid rond de laminectomie. Het zoutgehalte moet onder de geïsoleerde plaat liggen.</li>
		<li>Plaats een zilverdraad stimulerende elektrode (twee zilveren draden, 0,5 mm diameter, lengte 50 mm) over de blootgestelde ruggenmergwortels, plaats een positieve pool 3 mm boven de plaat in olie, terwijl de negatieve pool in de zoutoplossing (toegevoegd aan het zwembad, onder de plaat) en sluit aan op de stimulator.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Motorische eenheidsopnamen
<ol><li>Stimulerend met elektrische rechthoekige pulsen (duur van 0,1 ms, amplitude tot 0,5 V), selecteer de ventrale wortels (L4, L5 en L6); ventrale wortelstimulatie roept samentrekking van spieren op, terwijl er geen dergelijk effect is voor rugwortels. Elimineer rugwortels van de plaat. Voor de mediale gastrocnemius, de meeste axonen zijn in de L5 ventrale wortel.</li>
	<li>Met behulp van een paar Dumont #55 tangen en vergrootglazen, split L5 of L4 ventrale wortels in zeer fijne bundels van axonen (pak het gesneden uiteinde van de ventrale wortel met beide tangen en schil de wortellet uit elkaar); plaats een van deze bundels op een zilveren draadelektrode en stimuleer (0,1 ms rechthoekige pulsen van amplitude tot 0,5 V) om activiteit van één MU te bereiken. Een stevige ondersteuning (metalen balk) is zeer nuttig voor het manipuleren van dunne bundels van axonen, die kunnen worden gebruikt als een hand ondersteuning voor het gebruik van tangen. Merk ook op dat een extra lichtbron nodig is.</li>
	<li>Door de intensiteit van de stimulus geleidelijk te verhogen, identificeert u één MU op basis van het opgeroepen "alles-of-geen" karakter van de twitch contractie en actie potentiële stimulus. Test de opgeroepen activiteit voorzichtig bij een stimulatie rond de drempel.<ol>
<li>Wanneer meer dan één MU krimpt in de bestudeerde spier en het toenemende niveau van de kracht, evenals het verhogen van amplitude of veranderende vorm van het actiepotentieel zichtbaar zijn, ga dan terug naar stap 4.2 en splits de bundel axonen opnieuw. Merk op dat de sterkste MUs in rat mediale gastrocnemius hebben ongeveer 70 keer grotere twitch kracht dan de zwakste en wanneer zeer sterke MU is twitching de tweede, zwakke MU kan niet duidelijk zijn. Merk ook op dat sommige CPU's hebben hun spiervezels gelegen uit het opnamegebied van de elektrode en zijn niet zichtbaar in elektromyogram; in een dergelijk geval kunnen veranderingen in de stimulusamplitude effect hebben in de kracht, maar niet in actiepotentieel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stimuleer een motorunit met een stimulatieprotocol dat nodig is voor het doel van het experiment. Voor een basisstimulatieprotocol dat nodig is om alle basismotorische eenheid contractiel en actie potentialen eigenschappen te berekenen, onder meer de volgende.<ol>
<li>Inclusief 5 stimuli op 1 Hz (5 enkele twitches geregistreerd en gemiddeld; gemiddeld is het elimineren van ruis, wat vooral belangrijk is voor de zwakste MU's).</li>
		<li>Neem een reeks stimuli op 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 en 150 Hz frequenties op met een duur van 500 ms (deze opnames maken de berekening van de krachtfrequentierelatie, de maximale tetanische kracht bij 150 Hz en de sag bij 20-40 Hz stimulatie mogelijk).</li>
		<li>Neem de vermoeidheidstest op (tetani opgeroepen door treinen met 14 stimuli op 40 Hz frequentie, elke seconde gedurende 4 minuten herhaald).</li>
		<li>Neem ten minste 10 s tijdsintervallen tussen alle elementen van het protocol hierboven.</li>
		<li>Herhaal het proces met opeenvolgende geïsoleerde motoreenheden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beëindig het experiment en euthanaseer het dier met behulp van intraperitoneale toediening van een dodelijke dosis pentobarbital natrium (180 mg·kg-1).</li>
</ol>5. Elektronische apparatuur
OPMERKING: Het op maat gemaakte computerprogramma regelt de stimulator en biedt de mogelijkheid om variabele stimulatiepatronen te creëren, inclusief die welke in stap 4.4 worden aangegeven. Het programma werkt samen met de analoog-naar-digitale converter (ten minste 10 kHz voor de MUAP en force recordings).
<ol><li>Sluit de wisselstroomversterker aan op de computer via de analoog-naar-digitale converter en parallel aan de oscilloscoop.</li>
	<li>Sluit de krachttransducer aan op de computer via de analoog-naar-digitale converter en parallel aan de oscilloscoop. Gebruik de krachttransducer om de passieve spierkracht tijdens het experiment te controleren. Houd er rekening mee dat tijdens het experiment de passieve kracht kan afnemen; daarom is het noodzakelijk om de spierlengte te verhogen om de passieve spierkracht constant te houden.</li>
</ol>

<ol><li>Burke, R. E., Levine, D. N., Tsairis, P., Zajac, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+types+and+histochemical+profiles+in+motor+units+of+the+cat+gastrocnemius%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological types and histochemical profiles in motor units of the cat gastrocnemius.</a> Journal of Physiology. 234, 723-748 (1973).</li>
<li>Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+motor+units+in+the+medial+gastrocnemius+muscle+of+male+and+female+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The number of motor units in the medial gastrocnemius muscle of male and female rats.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 58, 821-828 (2007).</li>
<li>Grottel, K., Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+motor+units+in+medial+gastrocnemius+muscle+of+the+rat+in+light+of+variability+of+their+principal+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Division of motor units in medial gastrocnemius muscle of the rat in light of variability of their principal properties.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 50, 571-588 (1990).</li>
<li>Celichowski, J., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+plasticity+of+motor+unit+properties+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biocybernetics+and+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Variability and plasticity of motor unit properties in mammalian skeletal muscle.</a> Biocybernetics and Biomedical Engineering. 32 (4), 33-45 (2012).</li>
<li>Gardiner, P. F., Olha, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+and+electromyographic+characteristics+of+rat+plantaris+motor+unit+types+during+fatigue+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Contractile and electromyographic characteristics of rat plantaris motor unit types during fatigue in situ.</a> Journal of Physiology. 385, 13-34 (1987).</li>
<li>Drzymała-Celichowska, H., Kaczmarek, P., Krutki, P., Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summation+of+slow+motor+unit+forces+at+constant+and+variable+interpulse+intervals+in+rat+soleus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electromyography+and+Kinesiology%22%5BJournal%5D)">Summation of slow motor unit forces at constant and variable interpulse intervals in rat soleus muscle.</a> Journal of Electromyography and Kinesiology. 30, 1-8 (2016).</li>
<li>Krutki, P., Celichowski, J., Łochyński, D., Pogrzebna, M., Mrówczyński, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+differences+of+motor+units+properties+in+the+medial+gastrocnemius+muscle+of+cat+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+Italiennes+de+Biologie%22%5BJournal%5D)">Interspecies differences of motor units properties in the medial gastrocnemius muscle of cat and rat.</a> Archives Italiennes de Biologie. 144, 11-23 (2006).</li>
<li>Burke, R. E., Rudomin, P., Zajac, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+activation+history+on+tension+production+by+individual+muscle+units%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The effect of activation history on tension production by individual muscle units.</a> Brain Research. 109, 515-529 (1976).</li>
<li>Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+the+regulation+of+motor+unit+contraction+in+the+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying the regulation of motor unit contraction in the skeletal muscle.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 51, 17-33 (2000).</li>
<li>Burke, R. E., Levine, D. N., Salcman, M., Tsairis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+units+in+cat+soleus+muscle%3A+physiological%2C+histochemical+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Motor units in cat soleus muscle: physiological, histochemical and morphological characteristics.</a> Journal of Physiology. 238, 503-514 (1974).</li>
<li>Milner-Brown, H. S., Stein, R. B., Yemm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contractile+properties+of+human+motor+units+during+voluntary+isometric+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contractile properties of human motor units during voluntary isometric contractions.</a> Journal of Physiology. 228, 285-306 (1973).</li>
<li>Taylor, A., Stephens, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+human+motor+unit+contractions+by+controlled+intramuscular+microstimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Study of human motor unit contractions by controlled intramuscular microstimulation.</a> Brain Research. 117, 331-335 (1976).</li>
<li>Westling, G., Johansson, R. S., Thomas, C. K., Bigland-Ritchie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+contractile+and+electrical+properties+of+single+human+thenar+motor+units+in+response+to+intraneural+motor-axon+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Measurement of contractile and electrical properties of single human thenar motor units in response to intraneural motor-axon stimulation.</a> Journal of Neurophysiology. 64, 1331-1338 (1990).</li>
<li>Burke, R. E. Motor units: anatomy, physiology and functional organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+RE+%22APS+Handbook+of+Physiology+Series%2C+Section+1%2C+The+Nervous+System%22">APS Handbook of Physiology Series, Section 1, The Nervous System</a>. 11, part 1, Motor Control 345-422 (1981).</li>
<li>Celichowski, J., Grottel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dependence+of+the+twitch+course+of+medial+gastrocnemius+muscle+of+the+rat+and+its+motor+units+on+stretching+of+the+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+Italiennes+de+Biologie%22%5BJournal%5D)">The dependence of the twitch course of medial gastrocnemius muscle of the rat and its motor units on stretching of the muscle.</a> Archives Italiennes de Biologie. 130, 315-325 (1992).</li>
<li>Celichowski, J., Grottel, K., Bichler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+profile+of+unfused+tetani+of+fast+motor+units+with+respect+to+their+resistance+to+fatigue+in+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Differences in the profile of unfused tetani of fast motor units with respect to their resistance to fatigue in the rat medial gastrocnemius muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 20, 681-685 (1999).</li>
<li>Krutki, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+motor+units+into+fast+and+slow+on+the+basis+of+profile+of+20+Hz+unfused+tetanus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Division of motor units into fast and slow on the basis of profile of 20 Hz unfused tetanus.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 59, 353-363 (2008).</li>
<li>Drzymała-Celichowska, H., Krutki, P., Celichowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summation+of+motor+unit+forces+in+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electromyography+and+Kinesiology%22%5BJournal%5D)">Summation of motor unit forces in the rat medial gastrocnemius muscle.</a> Journal of Electromyography and Kinesiology. 20, 599-607 (2010).</li>
<li>Kaczmarek, P., Celichowski, J., Drzymała-Celichowska, H., Kasiński, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+image+of+motor+unit+architecture+in+the+mechanomyographic+signal+during+single+motor+unit+contraction.+In+vivo+and+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electromyography+and+Kinesiology%22%5BJournal%5D)">The image of motor unit architecture in the mechanomyographic signal during single motor unit contraction. In vivo and simulation study.</a> Journal of Electromyography and Kinesiology. 19, 553-563 (2009).</li>
<li>Celichowski, J., Krutki, P., Bichler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+conduction+velocity+of+motor+units+of+rat%27s+medial+gastrocnemius+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Axonal conduction velocity of motor units of rat's medial gastrocnemius muscle.</a> Journal of Physiology (Paris). 90, 75-78 (1996).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Indien correct uitgevoerd door ervaren wetenschappers, moet de chirurgische component van het beschreven protocol binnen ongeveer twee uur worden voltooid. Men moet bijzondere zorg besteden aan het handhaven van stabiele fysiologische omstandigheden van het dier tijdens de operatie, met name lichaamstemperatuur en diepte van anesthesie, die systematisch moet worden gecontroleerd door het beoordelen van pinna en ontwenningsreflexen. Na de operatie moet het mogelijk zijn om gedurende ten minste zes uur stabiele opnameomsta...

Motoreenheden (MU's) zijn de kleinste functionele eenheden van skeletspieren. Daarom is het begrijpen van hun functie, plasticiteit en contractiele eigenschappen, evenals de mechanismen van hun krachtregulatie, cruciaal voor vooruitgang in de spierfysiologie. De basiscontractieleigenschappen van M's en de verhoudingen van hun fysiologische types zijn gedocumenteerd voor tal van spieren, voornamelijk de achterpootspieren bij proefdieren. Echter, zowel de plasticiteit van MU eigenschappen en de mechanismen van MU kracht regelgeving zijn nog steeds niet volledig begrepen.
Het principe van de beschreven methode is uitgebreide denervation van de achterpootspieren behalve de onderzochte en laminectomie bij de lendenwervels om dunne ventrale worteltjes voor te bereiden, elk met een enkele "functionele" motoraxon, gestimuleerd om de kracht en het actiepotentieel van het MU vast te leggen. Met behulp van de techniek beschreven in dit document, is het mogelijk om meer dan de helft van de MUs van de mediale gastrocnemius spier te isoleren in een succesvol experiment. De rattenmediale gastrocnemius bestaat uit gemiddeld 52 MU's (vrouwtjes) of 57 MU's (mannetjes) van drie fysiologische types: S (langzaam), FR (snel resistent) en FF (snel vetbaar)1,2, en hebben variabele contractiele eigenschappen3. Voor experimenten waarbij gemiddelde waarden voor MU's in de controle- en experimentele groepen worden vergeleken, zijn isolatie en registratie van 10-30 MU's voor elk van deze groepen noodzakelijk. Kritisch, individuele MU's kunnen toegankelijk zijn voor stimulatie voor perioden van meer dan een uur. Bovendien, aangezien deze techniek het mogelijk maakt voor het registreren van zowel MU kracht en actie mogelijkheden, deze methode is geschikt voor het bestuderen van verschijnselen in verband met kracht productie, het beoordelen van het effect van vermoeidheid, en het observeren van de relatie tussen de kracht en actie mogelijkheden.
Eerdere studies hebben bevestigd dat MU contractiele eigenschappen zijn plastic en kan worden gemoduleerd door tal van interventies. Experimenten met behulp van de hier beschreven techniek zijn uitgevoerd op rat mediale gastrocnemius4 of andere achterpootspieren van de rat5,6 en op kat spieren7, met behulp van een soortgelijke methode van enkele MU isolatie. Een andere reeks experimenten met treinen van stimuli die bij variabele interpulsintervallen werden uitgevoerd, leverden waarnemingen op met betrekking tot motorische controleprocessen, en de resultaten in het algemeen richten de aandacht op de geschiedenis van stimulatie, met inbegrip van aanzienlijke effecten van een verschuiving in tijdschaal van zelfs één stimulus, cruciaal voor krachtproductie8,9.
M's kunnen ook worden bestudeerd met behulp van alternatieve methoden. Ten eerste, een methode is directe stimulatie van motoneurons. Burke gebruikte intracellulaire stimulatie van motoneurons in cat medial gastrocnemius en soleus met glasmicro-elektroden die parallel worden gebruikt om de elektrofysiologische eigenschappen van deze neuronen1,10te bepalen. Andere methoden zijn voorgesteld om MUs studie in menselijke spieren, die aanzienlijk lagere interventie vereisen. Voor al deze methoden, de stimulerende en opnames elektroden worden ingevoegd in de spier of zenuw, en kracht wordt geregistreerd van de vinger of van de voet. De eerste van deze methoden werd gebruikt om MUs te bestuderen in de eerste dorsale interosseous spier. Voor deze spier, samentrekkend met een lage kracht, in het elektromyogram geregistreerd met de naald elektrode ingevoegd in de spier de actie mogelijkheden van slechts een actieve motorische eenheid werden geïdentificeerd. Vervolgens werden de fragmenten van een spierkracht die parallel en na elk actiepotentieel werden geregistreerd, gemiddeld (spike-triggered middeling). Deze methode maakt extractie van de kracht van een motorische eenheid uit de spierkracht opname11. Echter, de methodologische zwakte van deze procedure is dat er geen enkele twitch kracht, maar eerder fragmenten van tetanische weeën werden gemiddeld. Menselijke MUs kan ook worden bestudeerd met behulp van de tweede methode van intramusculaire elektrische microstimulatie met behulp van een elektrode ingevoegd in de spier12, die een fragment van een axonale boom stimuleert, wat leidt tot activering van een enkele motorunit. De derde methode is microstimulatie met een elektrode ingebracht in de zenuw. Wanneer de elektrode slechts één motoraxon in de zenuw activeert, komt slechts één motorunit samen13. Deze laatste methoden hebben een aantal beperkingen, waaronder stabiliteit en kwaliteit van de opname, ethische beperkingen en toegang tot het experimentele materiaal. Dit protocol is op grote schaal gebruikt bij katten in de jaren '70 en '8014.

<table><tbody><tr><td>Krachtsensor</td><td>op maat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 11255-20</td><td>Dumont #55 met extra lichte en fijne schachten</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 11150-10</td><td>Extra Fijne Greafe-pintset</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 11026-15</td><td>Speciaal uitgehold patroon voor superieure grip</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 11023-10</td><td>Slank 1x2 tanden</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 11251-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Hemostaten</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 13003-10</td><td>Hartman</td></tr><tr><td>Isolation Unit</td><td>Grass Instruments</td><td>S1U5A</td><td></td></tr><tr><td>Laag-ruis bioamplifer</td><td>World Precision Instruments</td><td>Bestelcode 74030</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhaakjes</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 12503-15</td><td>Met wolfraamcarbid mondstukken</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 16021-14</td><td>Friedman-Pearson</td></tr><tr><td>Scharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 14101-14</td><td>Rechte scherpe/doffe met grote vingerbeugelingen</td></tr><tr><td>Scharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 14075-11</td><td>Gebogen dof/dof</td></tr><tr><td>Scharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 14084-08</td><td>Extra fijn bon</td></tr><tr><td>Scharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>Nr. 15000-00</td><td>Recht, ideaal voor het snijden van zenuwen</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Grass Instruments</td><td>S88</td><td>Dual Output Square Pulse Stimulator</td></tr></tbody></table>

functionele isolatie van enkele motoreenheden van rat medial gastrocnemius muscle

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Dit werk schetst functionele isolatie van motoreenheden (MU's), een standaard elektrofysiologische methode voor het bepalen van de kenmerken van motoreenheden in achterpootspieren (zoals de mediale gastrocnemius, soleus of plantarisspier) bij experimentele ratten. Een cruciaal element van de methode is de toepassing van elektrische stimuli geleverd aan een motor axon geïsoleerd van de ventrale wortel. De stimuli kunnen worden geleverd bij constante of variabele interpulssies. Deze methode is geschikt voor experimenten op dieren in verschillende stadia van rijpheid (jong, volwassen of oud). Bovendien kan dit protocol worden gebruikt in experimenten waarbij variabiliteit en plasticiteit van motoreenheden worden onderzocht die door een groot spectrum van interventies worden opgeroepen. De resultaten van deze experimenten kunnen zowel het vergroten van de basiskennis in de spierfysiologie en worden vertaald in praktische toepassingen. Deze procedure richt zich op de chirurgische voorbereiding voor de registratie en stimulatie van MU's, met de nadruk op de nodige stappen om voorbereidingsstabiliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten te bereiken.

Parameters van de contracties en actiemogelijkheden van de motoreenheid kunnen worden berekend op basis van opnamen wanneer stabiele omstandigheden van de opnames zijn gewaarborgd. Figuur 1 presenteert een representatieve opname van de enkele twitch van een snelle MU. Het bovenste spoor toont het actiepotentieel van de motoreenheid. De vertraging tussen stimulus levering en het begin van de motorische eenheid actie potentieel is te wijten aan geleidingstijd van ventrale wortel naar spier. <s...

Deze methode maakt het mogelijk de opname van de kracht van twitch en tetanische contracties en actie potentialen in drie soorten motorische eenheden in de rat mediale gastrocnemius spier. De functionele isolatie van een enkele motorunit wordt veroorzaakt door elektrische stimulatie van de axon.

Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...

Deze methode maakt het mogelijk om afzonderlijke motoreenheden functioneel te isoleren bij het hanteren van massa's proefdieren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het registreren van kracht en actie mogelijkheden van individuele motorische eenheden van geïdentificeerd fysiologisch type. Professor Jan Celichowski, hoofd van de afdeling neurobiologie, zal helpen bij het aantonen van de procedure.Begin met het snijden van de huid langs de wervelkolom, van het heiligbeen tot de thoracale wervels, met een scherpe stompe schaar. Identificeer de S1 wervel als het laagste segment. Snijd vervolgens en verwijder de longissimus spieren, en de spinous processen van L6 tot L2 wervels.Gebruik fijne rongeurs om de dwarse processen van L6 naar L2 te verwijderen en voer een laminectomie uit over L6 naar L2-segmenten om de lendensegmenten van het ruggenmerg dat door de dura mater wordt bedekt, bloot te leggen. Snijd met behulp van een scherpe schaar het ruggenmerg en de rug- en ventrale wortels in het L2-wervelsegment, ter hoogte van de bovenrand van de laminectomie. Plaats kleine stukjes droog gelschuim om het bloeden te stoppen.Gebruik vervolgens een scherpe schaar om een longitudinale knuffel te maken aan de achterzijde van de linker achterpoot, van de achillespees tot de heup. Zoek de popliteal fossa aan de achterkant van het kniegewricht, die wordt bedekt door de biceps femoris spier, en maak een kopje tussen de voorste en achterste deel van deze spier. Naar boven bewegen, snijd de twee hoofden van de biceps femoris helemaal naar de heup om de heup zenuw bloot te leggen.Met behulp van stompe tangen en scharen, scheid de laterale van de mediale hoofd van de gastrocnemiusspier, en snijd de distale inbrengen van de mediale gastrocnemiusspier. Identificeer de mediale gastrocnemius of MG zenuw, gebruik dan tangen en scharen om alle resterende zekerheden van de heupzenuw met inbegrip van onderpand aan achterste biceps en semitendinosus te snijden. Kweekte een niet elastische ligatuur door de achillespees en maak drie knopen.Maak dan een incisie van twee centimeter in de huid en onderliggend bindweefsel langs de voorste kant van de linker achterpoot voor een mobilisatie met een middenclan. Bevestig de linker achterpoot door een stalen klem op het scheenbeen te zetten. Plaats de rat in een op maat gemaakt verstelbaar frame.Trek de huidflappen rond de laminectomie met vier ligaturen. En hecht ze aan het frame om een zwembad te vormen voor paraffineolie over het blootgestelde ruggenmerg. Gebruik een Dumont 55 tang om de dura mater op te tillen op de kruising van het ruggenmerg.Snijd het vervolgens caudally tot aan het sacrale bot en trek het in. Scheid de linker- en rechter rug- en ventrale wortels op opeenvolgende niveaus met een stompe glazen staaf. Vul het zwembad over het ruggenmerg met warme paraffineolie, die de blootgestelde ventrale en rugwortels bedekt.Plaats de rat op een op maat gemaakte aluminium plaat met een zwembad voor de achterste ledematen, aangesloten op de gesloten lus verwarmingssysteem. Bevestig de klem op de linker achterpoot met de metalen balk om deze te immobiliseren. Bevestig de wervelkolom door stalen klemmen op het sacrale bot en de L1-wervel te plaatsen.Sluit vervolgens de linker mediale gastrocnemiusspier aan met de niet-elastische ligatuur met de krachttransducer via de achillespees. Steek een bipolaire zilverdraad of elektrode door het middelste deel van de spier, loodrecht op zijn lange as, en vul de kamer voor achterste ledematen met warme paraffine olie om de mediale gastrocnemius spier te dekken. Strek de geopereerde spier tot een passieve spanning van 100 millinewton, gecontroleerd door de krachttransducer.Gebruik vervolgens een scherpe schaar om een incisie van twee centimeter in de huid van de rechter achterpoot te maken en voeg een zilveren draadelektrode in die als referentieelektrode moet worden gebruikt. Plaats en bevestig een op maat gemaakte geïsoleerde metalen plaat boven de blootgestelde ruggegraatswortels. Leg linker paar ventrale en rugwortels op de plaat.En voeg zout aan het zwembad gevormd door de huid rond de laminectomie. Plaats een zilverdraad stimulerende elektrode over de blootgestelde ruggegraatswortels, plaats dan een positieve pool drie millimeter boven de plaat in olie, en de negatieve pool in de zoute. Stimuleer de ventrale wortels met elektrische rechthoekige pulsen, wat doet denken aan samentrekking van spieren.Gebruik een paar Dumont 55 tangen en vergrootglazen om L5 of L4 ventrale wortels te splitsen in zeer fijne bundels axonen. Plaats een van deze bundels op een zilveren draad elektrode en stimuleren om de activiteit van een enkele motor eenheid te observeren. Door de intensiteit van de stimulus geleidelijk te verhogen, identificeert u een enkele motoreenheid op basis van het opgeroepen alles-of-geen-karakter van de twitch contractie en actie potentiële stimulus.Parameters van de contracties en actiemogelijkheden van de motoreenheid kunnen worden berekend aan de hand van opnamen wanneer stabiele omstandigheden van opnames verzekerd zijn. Hier wordt een representatieve opname van de enkele twitch van een snelle motorunit getoond. De bovenste trays tonen het actiepotentieel van de motoreenheid.De vertraging tussen stimulus levering en het begin van de motorische eenheid actie potentieel is te wijten aan geleidingstijd van de ventrale wortel naar de spier. Een representatieve registratie van de ongefundeerde tetanuskracht van een snelle motoreenheid en een trein van motorische eenheid actie potentialen worden hier getoond, samen met de tijdsposities van de toegepaste stimuli. Voordat u deze procedure probeert, moet u er rekening mee houden dat het splitsen van de ventrale wortel in dunne filamenten enige training en ervaring nodig heeft.

functional-isolation-single-motor-units-rat-medial-gastrocnemius

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

Deze video toont de chirurgische voorbereiding en procedures die nodig zijn om de contractiele responsen van de rat mediale gastrocnemius spier voorbereiding...

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

This video demonstrates the isolation of single myofibres from harvested murine Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle. The isolated myofibres can be cultured to study myofiber-associated muscle stem cell activity.

Myofiber Isolation: A Technique to Obtain Single Myofibers from Harvested Mouse Extensor Digitorum Longus (EDL) Muscle

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

De scheenbeenzenuw doorsnijding model is een goed verdragen, gevalideerde en reproduceerbaar model van de skeletspier atrofie. Het model chirurgische protocol wordt beschreven en gedemonstreerd in C57Black6 muizen.

Scheenbeen Nerve doorsnijding - Een gestandaardiseerd model voor denervatie-geïnduceerde Skeletal Muscle Atrofie in Muizen

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Het vermogen om neuromusculaire verbindingscomponenten nauwkeurig te detecteren is cruciaal bij het evalueren van wijzigingen in de architectuur vanwege pathologische of ontwikkelingsprocessen. Hier presenteren we een volledige beschrijving van een eenvoudige methode om hoogwaardige beelden te verkrijgen van neuromusculaire verbindingen die kunnen worden gebruikt om kwantitatieve metingen uit te voeren.

Dissectie van enkelvoudige skeletspiervezels voor immunofluorescente en morfometrische analyses van neuromusculaire knooppunten van de hele berg

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

Leer functionele isolatie van enkele motorische eenheden in de mediale gastrocnemius van ratten via elektrische stimulatie. Deze methode registreert kracht en actiepotentialen voor neuromusculair onderzoek.

Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Meer video's verkennen