Een semiautomatiseerde ChIP-Seq-procedure voor grootschalige epigenetische studies

Dit protocol is belangrijk omdat het een hoogdoorvoer ChIP-Seq-analyse van primaire monsters mogelijk maakt om cis-regulerende mechanismen en de implicaties ervan op ziekten beter te begrijpen. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn de reproduceerbaarheid van de gegevens en de drastische vermindering van de praktische laboratoriumtijd. Voor chromatine-shearing, voeg 70 microliter vers, kamertemperatuur, complete lysisbuffer toe aan een glycine-gefixeerde, snap-frozen en ontdooide cellenpellet van belang, voor een incubatie van één minuut bij kamertemperatuur, gevolgd door één minuut resuspensie zonder bellen.

Incubeer het monster nog een minuut bij kamertemperatuur, voordat u de cellen op ijs plaatst. Breng de gesuspendeerde pellet over in een 0,65 milliliter laagbindend buisje op ijs, voordat u het buisje op de buishouder van een sonicator plaatst. Vul eventuele openingen met balanceerbuisjes met 70 microliter water en laat de cellen ongeveer een minuut stabiliseren in het waterbad voordat u met de sonicatie begint.

Verwijder na drie cycli de monsters van de sonicator voor voorzichtig vortexen en pulseer de buisjes voordat u ze terug in de houder plaatst. Voeg voor histonmodificatie 100 microliter complete tC1-buffer toe aan elk buisje van twee chip achtbuisjesstrips en breng 20 microliter van elk van de 16 chromatine-gedeelde monsters over in afzonderlijke buisjes van de chip achtbuisjesstrips. Was de chromatinebuisjes met 80 microliter complete tC1-buffer en pool de wasbeurten in de juiste buisjes van de chip achtbuisjesstrips voor een eindvolume van 200 microliter oplossing per buisje.

Voeg het juiste volume antilichaam toe aan 500 microliter TBW1-buffer, en vortex snel en pulseer. Voeg vervolgens 70 microliter tBW1 en 30 microliter antilichaamoplossing toe aan elk buisje van een nieuwe chip achtbuisjesstrip. Vortex vervolgens een container met een proteïne A-kraaloplossing grondig en voeg vijf microliter kralen toe per 0,5 microgram antilichaam aan een nieuwe buisjesstrip.

Pulseer de strip met kralen en vul de laatste rij van de chip vloeistofvloeiende lade met gelabelde, lege, chip achtbuisjesstrips. Volg vervolgens de chip 16-I pure 200 D-programmaspecificaties voor de plaatsing van de rest van de strips en laad de buffers in de juiste posities. Na de sequencing, vangen de kralen in een achtbuisjesstripmagneet en breng 25 microliter tagmatischeringbuffer over naar elk buisje.

Met de buisjes uit de magneet, meng voorzichtig totdat de beadoplossingen homogeen zijn, voordat u de opnieuw afgesloten buisjes in een voorverwarmde ThermoMixer plaatst voor drie minuten. Aan het einde van de incubatie, verwijder de chip achtbuisjesstrips in de laatste rij van de chip vloeistofvloeiende lade en voeg twee microliter Rnase A toe aan elk monster. Pulseer vervolgens de opnieuw afgesloten buisjes en meng voorzichtig totdat de beadoplossingen homogeen zijn.

Voor een zuivering van de getagmenteerde DNA-fragmenten, breng 100 microliter van de D cross-linked DNA-monsters over naar afzonderlijke 1,5 milliliterbuisjes en was de buisjes met 100 microliter DNA-bindende buffer per buisje. Pulseer de wasbeurten in de juiste buisjes en laad de monsters op kolommen. Plaats de kolommen in nieuwe 1,5 milliliter verzamelbuisjes en voeg negen microliter 55 graden Celsius Tris-EDTA-buffer toe aan de kolommatrices.

Centrifugeer de kolommen na één minuut en breng de negen microliter eluaat van elke kolom over in een nieuwe achtbuisjesstrip op ijs. Eluteer de DNA-fragmenten opnieuw zoals gedemonstreerd, maar met acht microliter Tris-EDTA-buffer en pool het eluaat met de eerder geoogste DNA-fragmentoplossing. Om de gezuiverde DNA-fragmentmonsters te versterken, meng de monsters met een multikanaals pijp en voer een versterkingsprogramma uit met het juiste aantal cycli.

Na de versterking, gebruik een plaatmagneet om de kralen te vangen en gooi het supernatant weg. Was de kralen drie keer met 200 microliter verse 80% ethanol per was, zonder de bead-pellet te verstoren. Na de laatste wassing, gebruik een 20-microliter pipettip om eventueel overtollig ethanol te verwijderen en laat de kralen 10 minuten drogen, of tot er scheuren in de bead-pellets verschijnen.

Voeg 40 microliter voorverwarmd water toe aan elk gedroogd monster en verzegel de plaat voordat u grondig vortext en kort pulseert. Kwantificeer vervolgens het DNA met behulp van een fluorescentie-kwantificeringstest volgens standaardprotocollen. Metingen van de grootte van de gebroken chromatinefragmenten tonen een grote reproduceerbaarheid met meer dan 70% van de monsters tussen 100 en 500 basenparen voor 14 cycli.

Zoals geïllustreerd, is de cyclus waarbij de intensiteit van het getagmenteerde monster de helft van het gemiddelde maximum is, optimaal voor cyclusbepaling. De beste sequencinggegevens worden verkregen wanneer meer dan 85% van de DNA-fragmenten tussen 200 en 1000 basenparen varieert. In deze representatieve verrijkingstracks voor vier genloci tonen individuele tracks voor elk monster een hoge mappingkwaliteit en signaal-ruisverhouding.

De eerste twee loci bevatten goed tot expressie gebrachte genen in deze celtypen, terwijl de genen in de laatste twee loci niet tot expressie worden gebracht en dienen als achtergrondcontroles. Voor de meeste paarsgewijze vergelijkingen tonen Pearson-correlatie-indexen meer dan 90% correlatie, wat duidt op een hoge mate van consistentie tussen de biologische replica's. Terwijl celtype-specifieke loci een hoge verrijking in de juiste cellen vertonen, toont een housekeeping-gen zeer consistente histonmodificatie.

Correlatie-analyse tussen ChIP-Seq-gegevensset uitgevoerd van monsters met minder dan 100.000 cellen toont nog steeds een hoge reproduceerbaarheid en correlatie tot 10.000 cellen. Er is echter een verhoogde achtergrond wanneer het aantal cellen wordt verminderd, evenals een afname in hun correlatiecoëfficiënten. Goede lyse van de cellen is essentieel voor het genereren van hoogwaardige gegevens, aangezien we hebben vastgesteld dat onvolledige cellyse de rest van het protocol beïnvloedt.