Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

In dit deeltje introduceren we een in vitro reconstitution platform dat de lipide omgeving van mitochondriën binnenmembraan nabootst. Dit platform kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen van mitochondriën binnenmembraanfusie te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kwantitatief onderzoek van integrale membraaneiwitten en membraan-geassocieerde eiwitten in een bijna inheemse omgeving mogelijk maakt.

Om te beginnen, meng oplossingen A en B volgens manuscriptrichtingen, dan het lipidemengsel produceren door het berekende volume van opslagoplossing in amberfuitjes met een glasspuit toe te voegen. Match het uiteindelijke volume door extra chloroform toe te voegen aan de flesjes. Bak microscoop coverglass dia's op 520 graden Celsius gedurende 30 minuten.

Na het bakken, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg ongeveer 10 gram natriumhydroxide toe aan 500 milliliter methanol tijdens het roeren. Roer gedurende twee uur, blijven natriumhydroxide toe te voegen aan de oplossing tot neerslag beginnen te laten zien.

Reinig de glazen glijbanen in 10% natrium dodecylsulfaatoplossing, methanol verzadigd met natriumhydroxide en 50 millimolar zoutzuur, achtereenvolgens bad sonicating de dia's onder elke voorwaarde gedurende 30 minuten. Reinig de glazen glijbanen in ultrazuiver water gedurende 10 minuten tussen elke voorwaarde. Bewaar de gereinigde coverglass verzegeld in zoutzuuroplossing voor maximaal twee weken om een goede tweelaagse kwaliteit te garanderen.

Reinig de polytetrafluorethyleentrog van het Langmuir-Blodgett dompelen systeem met behulp van chloroform en ultrazuiver water totdat er geen bevochtiging wordt waargenomen. Spray chloroform op het trogoppervlak en veeg het drie keer grondig af met cellulosedoekjes, spoel het vervolgens drie keer af met ultrazuiver water en verwijder het water via zuiging. Bedek het oppervlak van de trog met schoon ultrazuiver water.

Neem twee stukken van het oppervlak behandelde coverglass van de reinigingsoplossing en spoel ze met ultrazuiver water voor ongeveer 30 seconden. Plaats de afdekglas op een back-to-back manier met behulp van het substraat klem om de glazen dia's te houden. Dompel de glazen schuif onder het wateroppervlak door handmatig op het Langmuir-besturingssysteem te klikken.

Nul de film balans en zorgvuldig verspreid oplossing B druppel voor druppel op de lucht water interface. Zorg ervoor dat lipiden zich alleen verspreiden op de luchtwaterinterface zonder chloroforme en lipidedruppels die naar de bodem van het polytetrafluorethyleenoppervlak zinken, waardoor een lipidekanaal ontstaat en de monolaagvorming wordt voorkomen. Stop met het toevoegen van lipiden wanneer de filmbalans uitlezing ongeveer 15 tot 20 millinewton per meter is.

Wacht 10 tot 15 minuten en start vervolgens de barrièrecontroller om het oppervlak te wijzigen door op startexperiment te klikken. Wacht tot de uitlezing van de filmbalans toeneemt tot 37 millinewton per meter en houd de druk ongeveer 20 tot 30 minuten. Verhoog de coverglass met een snelheid van 22 millimeter per minuut met behoud van de oppervlaktespanning op 37 millinewton per meter.

Een lipide monolayer met polymeer tethering zal worden overgedragen van de luchtwater interface naar het oppervlak van coverglass door middel van de Blodgett dipproces, de vorming van de onderste bijsluiter van de lipide bi-laag. Reinig de luchtwaterinterface door de trog af te zuigen en spoel de trog af met ultrazuiver water. Na het reinigen van een een-welled glazen glijbaan met chloroform, ethanol, en ultrazuiver water, zet het op de trog onder de waterlaag.

Zorg ervoor dat de put naar boven naar de luchtwaterinterface gericht is en giet vers ultrazuiver water totdat de glazen glijbaan volledig is afgedekt en dompel de glazen glijbaan onder het wateroppervlak zoals eerder beschreven. Houd de coverglass met de lipide monolayer met behulp van een siliconen zuignap en duw de lipide monolayer voorzichtig naar de luchtwaterinterface. Houd het afdekglas twee tot drie seconden op de interface en duw het vervolgens tegen de glijbaan.

Neem de glijbaan met de coverglass. Neem de coverglass en de bi-laag naar een epifluorescentie microscoop en beeld de lipide bi-laag volgens tekst manuscript richtingen. Bereid een kristallisatieschotel met ultrazuiver water en plaats een schone microscoop beeld ring onder de schotel.

Dompel deze glijbaan en coverglass onder die de lipide bi-laag onder het water bevatten. Scheid voorzichtig de schuif en het afdekglas, houd de coverglass dia van de bodem en breng de coverglass in de afbeelding ring. Vervang het ultrazuivere water in de beeldring door bis-tris natriumchloridebuffer, zodat de lipide bilaag niet wordt blootgesteld aan luchtbellen.

Voeg 1,1 nanomolar n-octyl-beta-glucopyranoside toe aan de lipide bi-layer en voeg onmiddellijk het mengsel van 1,2 nanomolar DDM en 1,3 picomoles gezuiverde L-OPA1 toe aan de beeldring. Broed het monster twee uur lang op een bench-top shaker bij lage snelheid. Verdeel 30 milligram SM-2 hars kralen in drie milliliter bis-tris buffer en schudden.

Gebruik een plastic pipet om 5 tot 10 microliter van de SM-2 hars kralen toe te voegen aan de beeldring en incubeer het gedurende 10 minuten, dan spoel de hars kralen. Het uiteindelijke volume van de buffer in de beeldring moet 1,5 milliliter zijn. Bereid een milligram lipidemengsel A in chloroform oplossing, dan verdampen chloroform onder stikstof stroom gedurende 20 minuten.

Houd het mengsel 's nachts onder vacuüm om een lipide film te vormen. Bereid 50 millimolar calciumhoudende buffer door het oplossen van 15,56 gram calceine in 50 milliliter van 1,5 molaire natriumhydroxide oplossing. Roer het mengsel op kamertemperatuur tot calceine volledig is opgelost.

Voeg 12,5 millimolar bis-tris en ultrapure water toe voor een eindvolume van 500 milliliter en pas de pH aan op 7,5. Doseer lipidefilm in calceine met buffer en hydrateer de lipide volledig door de suspensie 20 minuten op 65 graden Celsius te verwarmen. Vorm 200 nanometer liposomen via extrusie met een polycarbonaat membraan.

Voeg twee microgram L-OPA1 toe in 0,5 micromolar DDM, 2,2 milligram liposoom en ontcubeer de oplossing gedurende 1,5 uur bij vier graden Celsius. Verwijder de oppervlakteactieve agent door dialyse met een 3,5 kilodalton dialyse cassette tegen 250 milliliter van 25 millimolar bis-tris, 150 millimolar natriumchloride, en 50 millimolar calcium buffer op vier graden Celsius 's nachts, het veranderen van de buffer tweemaal. Verwijder extra calcein met behulp van een PD10 desalting kolom, ga dan verder met beeldvorming en data-analyse zoals beschreven in de tekst manuscript.

Epifluorescentie microscopie beelden van een lipide bi-layer en de lipide vloeibaarheid worden hier getoond. De lipideverdeling wordt voor en na fotobleken getoond en de homogeniteit wordt voor en na de reconstructie getoond. L-OPA1 gereconstitueerd en lipide bi-layer werd gevalideerd door fluorescentie correlatie spectroscopie of FCS.

De FCS-curven gaven aan dat 75% van de L-OPA1 werd gereconstitueerd in de lipide bi-laag wat suggereert dat L-OPA1 vrij verspreidt in het polymeer vastgebonden lipide bi-laag met het potentieel om zelf te monteren in functionele complexen. Fluorescentie stap bleken aangegeven dat een gemiddelde van twee tot drie exemplaren van L-OPA1 werden gereconstrueerd in een bepaald liposoom. De grootteverdeling van L-OPA1 gereconstrueerde proteoliposom werd na de reconstructie getest met DLS en geverifieerd met FCS.

Membraan tethering werd gecontroleerd door het observeren van het signaal van Texas Red op het oppervlak van de lipide bi-layer met behulp van TIRF microscopie. Membraan lipide de-mengen of hemifusion werd gecontroleerd door Texas Red als de liposoom marker verspreid in de lipide bi-layer. Calcein de-quenching hielp onderscheid maken volledige fusie porie vorming van alleen lipide de-mengen, waardoor vergelijking tussen de omstandigheden waar deeltjes vast te vallen op hemifusie en deeltjes die overgaan tot volledige fusie.

Membraan tethering werd aangegeven door een stabiel lipidesignaal van liposomen en effusiesignaal bevatte geen de-quenching in het calcein signaal, maar een snel verval van de Texas Red signaal aangegeven verspreiding van de kleurstof in de lipide bi-laag. Volledige fusie kenmerkte zowel lipide verval en content release. Bij een poging van dit deeltje, vergeet niet om grondig schoon zowel de coverglass en Langmuir trog om ervoor te zorgen bi-lagen van hoge kwaliteit worden vervaardigd.

Een goede luchtkwaliteit is ook van cruciaal belang om defecten in de bilaag te voorkomen. Deze techniek maakt de weg vrij voor ons om nieuwe vragen in mitochondriën membraandynamica en organisatie te verkennen. Spannend toekomstig experiment omvat het verkennen van de invloed van bi-layer assymetrie, membraan potentieel, en ziekte-gerelateerde mutanten in mitochondriën innerlijke membraan dynamiek.