Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties
August 25th, 2020
De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.
Deze vrij zwevende techniek kan worden gebruikt om verminderde immunohistologie uit te voeren op muisbreinweefselmonsters. De vrij zwevende techniek biedt verschillende voordelen. Het verkrijgen van dikkere weefselsneden, het uitvoeren van grootschalige studies, het gebruik van 30 tot 40 plakjes per aliquot en de langdurige opslag van monsters.
Als u deze techniek voor de eerste keer probeert, raden we u aan om secties te monteren die niet cruciaal zijn voor uw experiment om ervaring met de methode op te doen. Acclimatiseer ten minste een tot twee uur voor het snijden de monsters van belang in de cryostaat op de juiste snijtemperatuur van het weefsel. Wanneer de weefsels klaar zijn.
gebruik de cryostaat om 20 tot 50 micron dikke secties te verkrijgen en plaats de secties in individuele inserts in PBS-gevulde putjes van een zes- of 12-putjesplaat. Wanneer alle secties zijn verkregen, bedek de monsters met ongeveer zes milliliter per wasbeurt voor drie wasbeurten van vijf minuten voordat u elke put met secties overbrengt naar microcentrifugebuisjes van twee milliliter, die een tot 1,5 milliliter opslagoplossing per buisje bevatten. Bewaar de monsters vervolgens op min 80 graden Celsius tot het kleuren.
Voor het kleuren van weefselsneden, brengt u de monsters 10 tot 20 minuten op kamertemperatuur voordat u de secties afgiet in inserts in een nieuwe zes-putjesplaat. Wanneer alle opslogoplossing is afgegoten, verplaatst u de inserts naar nieuwe putjes, die ongeveer zes milliliter TBS per put bevatten voor drie wasbeurten van vijf minuten met verse TBS per wasbeurt op een orbitale shaker op lage snelheid bij kamertemperatuur. Voeg na de laatste wasbeurt zeven milliliter vers bereide blokkerende permeabiliseringsoplossing toe aan elke put voor een 30 minuten durende incubatie op de shaker bij kamertemperatuur.
Aan het einde van de incubatie, voegt u een milliliter van de primaire antilichaamoplossing van belang toe aan een microcentrifugebuisje van twee milliliter per insert en brengt u alle secties in elke insert over naar de juiste buis van twee milliliter. Plaats vervolgens de buisjes op een roterende mixer. Voeg ongeveer zeven omwentelingen per minuut toe voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.
De volgende ochtend, giet u de secties van elk buisje in individuele putjes in een nieuwe zes-putjesplaat en was de secties twee keer gedurende 30 seconden per wasbeurt en één keer gedurende 10 minuten in verse TBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, brengt u de groepen secties over naar individuele microcentrifugebuisjes van twee milliliter, die een milliliter van de juiste secundaire antilichaamoplossing per buisje bevatten en incubeert u de monsters gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker op lage snelheid, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, giet u de secties in inserts in een nieuwe zes-putjesplaat en was de monsters twee keer gedurende 30 seconden en één keer gedurende 15 minuten in verse TBS per wasbeurt, beschermd tegen licht.
Na de laatste wasbeurt, giet u de secties in een glazen rechthoekige histologische kamer, drie kwart gevuld met TBS en dompelt u een glazen plaatje in de TBS. Gebruik een fijn penseel en een vergrootlamp indien gewenst, en leid de secties voorzichtig naar de plaat en tik voorzichtig een sectie op de plaat, zorg ervoor dat er geen rimpels of plooien zijn. Wanneer alle secties op een plaatje zijn vastgelegd, laat u de plaatjes ongeveer 10 tot 15 minuten drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, totdat de secties ondoorzichtig zijn en brengt u een geschikte waterige montagemiddel aan op de secties.
Gebruik pincetten om een dekglas op het medium te plaatsen en gebruik een stuk filterpapier om stevig op het dekglas te drukken om eventueel overtollig medium te verwijderen. De secties kunnen vervolgens worden geïmagineerd, met behulp van een geschikte microscoop of opgeslagen in een donkere plaatjesdoos ingesteld op vier graden Celsius. Zoals te zien is in deze representatieve afbeeldingen, kan fluorescente immunohistochemische analyse, met behulp van de vrij zwevende methode, worden uitgevoerd op muisbreinweefselsecties om de expressie van gliale fibrillaire zure eiwitten te onderzoeken.
Deze aanpak is ook geschikt voor het onthullen van eiwitten met lage expressie, zoals GFP, in een laag expresserend transgeen muisbreinmonster of in niet-fluorescente histochemische kleuringsprotocollen, zoals cresylviolet. Andere perifere weefsels zijn ook geschikt voor het gebruik van deze techniek zonder dat er aanpassingen nodig zijn, zoals waargenomen voor deze laag GFP-expresserende leverweefselmonsters. Het belangrijkste om te onthouden met de vrij zwevende techniek is om voorzichtig te zijn met de secties, vooral tijdens overdrachten en wanneer de monsters op de shakers of rotators zijn.
Naast een immunofluorescentiekleuring, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor andere histochemische kleurstoffen zoals hematoxyline en eosine en cresylviolet of voor chromogeen immunohistologie.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
De vrij zwevende techniek wordt gebruikt voor immunohistologische onderzoeken op gefixeerde weefselsneden, waardoor de visualisatie van biologische structuren, celtypen en eiwitexpressie mogelijk wordt. Deze methode is bijzonder effectief voor het onderzoeken van verschillende weefsels zoals hersenen, hart en lever, en biedt voordelen zoals dikkere weefselsneden en geschiktheid voor grootschalige studies.
Belangrijkste studieonderdelen
Onderzoeksgebied
- Histologie
- Immunohistochemische analyse
- Weefselanalyse
Achtergrond
- Voordelen van de vrij zwevende techniek zijn eenvoudiger hantering en de mogelijkheid van lange termijn monsteropslag.
- Deze methode is toepasbaar op meerdere biologische weefsels zonder aanpassingen.
- Het verbetert de detectie van laag-expresserende eiwitten in verschillende monstertypen.
Gebruikte methoden
- Immunohistochemische kleuring
- Muis hersenweefsel monsters
- Fluorescentiemicroscopie
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt de identificatie van gliaal fibrillair zuur proteïne mogelijk.
- Het toont effectiviteit in contexten met lage eiwitexpressie, zoals in GFP transgene muis monsters.
- Andere kleuringsmethoden zoals hematoxyline en eosine kunnen ook met deze techniek worden toegepast.
Conclusies
- De studie onderstreept de veelzijdigheid van de vrij zwevende techniek voor weefselkleuring en analyse.
- Het is essentieel voor onderzoekers om monsters voorzichtig te behandelen om de integriteit tijdens experimenten te behouden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The free-floating immunohistochemistry technique enables efficient processing of thick tissue sections for large-scale studies, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and peripheral tissue research. By improving antibody penetration and allowing batch handling of 30-40 sections per aliquot, it enhances reproducibility and throughput in discovery workflows. This approach is particularly valuable for studying protein expression patterns in complex tissues such as brain, where 3D reconstruction of neural projections informs target confidence and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of protein expression and localization in thick tissue sections, supporting functional target validation and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates handling of large numbers of sections per aliquot, reducing labor in large-scale biomarker screening campaigns.
- Predictive Value: Improves antibody penetration compared to slide-mounted methods, increasing confidence in detection of low-abundance targets such as GFP in transgenic models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with multiple histochemical stains including hematoxylin and eosin, cresyl violet, and chromogen immunohistochemistry, enabling flexible assay development.
- Operational Value: Sections remain suspended in solution during staining, ensuring uniform reagent exposure and minimizing variability across replicates.
- Scalability: Supports long-term storage at -80°C, allowing batch processing and retrospective analysis in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Applicable to both central nervous system and peripheral tissues (e.g., liver, heart) without protocol modifications, supporting cross-target validation.
- Mechanistic De-risking: Enables 3D reconstruction of axonal and dendritic projections, providing structural context for target engagement and pathway analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates quantitative, spatially resolved protein expression data that inform go/no-go decisions in preclinical target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The free-floating method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in neuroscience and systemic toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein expression patterns in fixed tissues, enabling mechanistic insight into target biology.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence or chromogenic readouts suitable for automated imaging and image-based screening platforms.
- Analytics: Produces spatially resolved expression data that can be quantified and compared across experimental conditions to assess target modulation.
- Translational Research: Enables consistency between discovery and preclinical models by applying identical staining protocols across species and tissue types.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable platform for histological analysis that can be deployed across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances detection sensitivity and specificity in immunohistochemistry, reducing false negatives in target validation studies.
- Operational Value: Standardizes tissue handling and staining procedures, improving inter-lab reproducibility and reducing technical variability.
- Strategic Value: Increases throughput in histology-based screening, lowering cost per sample and accelerating target de-risking cycles.
- Portfolio Impact: Supports data-driven target prioritization by providing reliable, multi-parameter tissue readouts that inform biological plausibility and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue sectioning, and immunofluorescence or chromogenic detection methods.
- Dependent on access to cryostat, microtome, orbital shakers, rotating mixers, and fluorescence or brightfield microscopes.
- Necessitates standardized blocking, permeabilizing, and washing buffers to minimize non-specific binding and ensure staining consistency.
- Requires optimization of antibody concentrations and incubation times for each target and tissue type, particularly for low-abundance proteins.
- Demands careful, gentle handling of free-floating sections to prevent mechanical damage during transfers and incubation steps.
