Name: Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Leer immunohistochemie met de vrij zwevende techniek voor weefselanalyse met muizenhersenweefsel. Deze methode maakt dikke secties en opslag op lange termijn mogelijk voor onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag het National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 tot JMR), het George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), het College of Pharmacy aan de Universiteit van Rhode Island (EP, GC, JMR) en Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR) erkennen. We bedanken promovenda Rebecca Senft, die traint bij professor Susan Dymecki, Department of Genetics, Harvard Medical School, voor het introduceren van de free-floating methode. Sommige afbeeldingen die in figuur 1 worden gebruikt, zijn verkregen uit "gratis te gebruiken, te delen of te wijzigen, zelfs commercieel": muis- en microcentrifugebuis (Pixabay), muizenhersenen (Jonas Töle, Wikimedia Commons), cryostat- en muizenhersensectie (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), glazen container (OpenClipart, FreeSvg.org) en microscoop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Weefselvoorbereiding voor cryosectie
<ol><li>Integreer vaste weefsels in een geschikte insluitvorm (zie Tabel van Materialen) om een monsterblok te maken met behulp van een geschikte monstermatrix (zie Tabel van Materialen) en vries in op droogijs. Bewaar de blokken van het monster bij -80 °C totdat u klaar bent om te worden doorgesneden. OPMERKING: Vaste weefsels worden meestal bereid door volwassen (ca. 2,5 - 30 maanden oud) mannelijke of vrouwelijke knaagdieren (muis of rat) te perfuseren 34, in overeenstemming met de beschikbare ethische vergunning, met een geschikt fixatief (bijv. 10% formaline), gevolgd door postfixatieweefsels in hetzelfde fixatief gedurende 12 uur bij 4 °C, driemaal wassen met 1x PBS, en het plaatsen van weefsels in 15% en vervolgens 30% sucrose in 1x PBS voor een nacht of totdat de weefsels35 zinken. Onderzoekers kunnen proberen dit algemene protocol aan te passen aan verschillende ontwikkelingsstadia.</li>
</ol>2. Cryosectie
<ol><li>Wanneer u klaar bent om te sectieren, acclimatiseert u monsters in de cryostaat gedurende ten minste 1-2 uur voorafgaand aan het snijden om verbrijzeling van weefsel te voorkomen.</li>
	<li>Snijd met behulp van een cryostaat weefsel in secties (20-50 μm) en verzamel in 6 of 12-well inserts (zie Materiaaltabel) gevuld met 1x PBS-oplossing. OPMERKING: Afhankelijk van de sectiedikte, hoeveel weefsel moet worden verzameld en het aantal putinzetstukken dat wordt gebruikt, bevat elke put een variabel aantal secties van ongeveer 10 tot 40 plakjes voor put. Als bijvoorbeeld een volledig brein op 40 μm wordt gesneden, worden ongeveer 18-24 secties in elke put verzameld met behulp van 12-putinzetstukken. Ook kunnen secties van 20 μm enigszins uitdagend zijn om te hanteren, dus 40 μm wordt aanbevolen voor bulkkleuring (zie Discussie).</li>
</ol>3. Secties opslaan
<ol><li>Eenmaal verzameld, was de secties met vers bereide 1x PBS gedurende 5 minuten. Herhaal dit 3 keer.</li>
	<li>Breng de secties over in 2 ml microcentrifugebuizen gevuld met 1-1,5 ml opslagoplossing (meng voor 250 ml 70 g sucrose, 75 ml ethyleenglycol en breng tot volume met 0,1 M fosfaatbuffer).</li>
	<li>Bewaren bij -80 °C totdat het klaar is voor kleuring.</li>
</ol>4. Vlekkendag I
<ol><li>Verwijder monsters uit de vriezer en balanceer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 - 20 min.</li>
	<li>Giet secties in een putinzetstuk in een 6-wellsplaat om de opslagoplossing van secties te scheiden.</li>
	<li>Verplaats de putinzet naar een andere put met ongeveer 6 ml 1x TBS. Was 3 keer met 1x TBS gedurende elk 5 minuten op een orbitale schudder met lage snelheid bij RT.</li>
	<li>Bereid tijdens het wassen 7 ml (per monster) van een blokkerende-permeabiliserende oplossing bestaande uit 1x TBS met 0,3% Triton X-100 en 3% normaal serum (bijv. Normaal paardenserum). Blok secties gedurende 30 minuten bij RT op orbitale shaker, met behulp van lage snelheid. OPMERKING: Blokkeren met sera voorkomt niet-specifieke binding van antilichamen aan weefsel of niet-specifieke Fc-receptoren - een serum dat overeenkomt met de soort van het secundaire antilichaam wordt aanbevolen, maar indien niet beschikbaar, kan elk normaal serum van een andere soort dan het primaire antilichaamgastdier worden gebruikt. Het wasmiddel Triton X-100 zorgt voor een betere penetratie van antilichamen door het weefsel te permeabiliseren.</li>
	<li>Bereid 1 ml per monster van primaire antilichaamoplossing bestaande uit geselecteerd primair antilichaam (op de juiste manier verdund) in 1x TBS met 0,3% Triton X-100 en 1% normaal serum (zie stap 4.4 Opmerking). Breng secties over van putinzet in een microcentrifugebuis van 2 ml met primaire antilichaamoplossing om te binden aan het (de) antigeen (en) van belang. OPMERKING: Er kunnen meerdere primaire antilichamen worden gebruikt (gegenereerd in verschillende gastheersoorten).</li>
	<li>Plaats 2 ml microcentrifugebuis met secties op een roterende mixer met een lage snelheid (bijv. snelheid 7 rpm) en incubeer 's nachts gedurende 12-16 uur bij 4 °C.</li>
</ol>5. Kleuring Dag II
<ol><li>Giet de volgende dag secties in een putinzetstuk in een 6-wellsplaat om secties van de primaire antilichaamoplossing te scheiden. OPMERKING: Antilichaamoplossing kan worden verzameld en hergebruikt; voeg 0,02% (w/v) natriumazide toe om de microbiële groei te remmen.</li>
	<li>Was secties 3 keer met 1x TBS bij RT (30 s voor de eerste 2 wasbeurten en 10 min voor de laatste wasbeurt).</li>
	<li>Bereid 1 ml per monster secundaire antilichaamoplossing bestaande uit geschikt secundair antilichaam (dienovereenkomstig verdund) in 1x TBS met 0,3% Triton X-100 en 1% normaal serum (schildoplossing tegen licht). OPMERKING: Indirecte etikettering met een geconjugeerd secundair antilichaam versterkt het signaal en maakt colorimetrische of fluorescerende visualisatie van het eiwitdoel mogelijk.</li>
	<li>Breng secties over in een microcentrifugebuis van 2 ml met secundaire antilichaamoplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij RT op orbitale schudder met lage snelheid (beschermoplossing tegen licht).</li>
	<li>Giet secties in een putinzetstuk in een 6-wellsplaat om secties te scheiden van secundaire antilichaamoplossing.</li>
	<li>Blijf monsters afschermen van licht, was 2 keer met 1x TBS gedurende 30 s op RT. Daarna 15 min wassen in 1x TBS, indien gewenst DAPI (1-0,1 μg/ml) toevoegen.</li>
</ol>6. Montage
<ol><li>Giet secties in een glazen, rechthoekige histologische kamer gevuld met driekwart gevuld met 1x TBS.</li>
	<li>Dompel een glazen glijbaan onder in de 1x TBS en gebruik een fijne kwast om de secties naar de glijbaan te leiden.</li>
	<li>Tik de secties voorzichtig op de dia en zorg ervoor dat er geen rimpels of plooien zijn.</li>
	<li>Herhaal dit totdat alle secties op de dia('s) zijn gemonteerd. OPMERKING: Wanneer een volledig brein bijvoorbeeld wordt gesneden op 40 μm, verzameld in 12-well inserts met één aliquot met 18-24 secties; segmenten worden meestal op 1-2 dia's gemonteerd, maar er kunnen ook minder secties per dia worden gemonteerd, afhankelijk van de voorkeur van de onderzoeker.</li>
</ol>7. Coverslipping
<ol><li>Nadat secties op de dia('s) zijn gedroogd, ongeveer 10-15 minuten bij RT of totdat secties er ondoorzichtig uitzien (vergeet niet om dia's tegen licht af te schermen), breng je een geschikt waterig montagemedium aan (verhardend of niet-verhardend). Antifading heeft de voorkeur bij gebruik van een fluorescerend geconjugeerd secundair antilichaam. OPMERKING: De fluorescentiekwaliteit kan minder zijn bij gebruik van een verhardingsmedium, maar dia's moeten langer meegaan.</li>
	<li>Plaats met een pincet een coverslip op het medium. Dek af met filtreerpapier en druk stevig aan om overtollig montagemedium te verwijderen. OPMERKING: Als u een niet-verhardende houder gebruikt, verft u de randen van de afgedekte dia met heldere nagellak om af te dichten.</li>
	<li>Beeldsecties met behulp van een geschikte microscoop. Bewaren in een donkere schuifdoos bij 4 °C. OPMERKING: Secties kunnen worden afgebeeld met behulp van verschillende microscopen, zoals laserscanning confocale en omgekeerde of rechtopstaande widefield fluorescentie, bij vergrotingen (bijv. 10x, 20x, 40x) op basis van de behoeften van de onderzoeker.</li>
</ol>

<ol><li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV%3A+Techniques+in+Experimental+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies%3A+indispensable+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li>
<li>Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+SN+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22">The Quarterly Review of Biology</a>. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374(1999).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+NationalAcademy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Hermersdörfer, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermersd%C3%B6rfer%2C+H+%22Immunocytochemistry.+A+Practical+Approach%22">Immunocytochemistry. A Practical Approach</a>. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Review+of+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphoproliferative+Diseases%22%5BJournal%5D)">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li>
<li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+%26+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).</li>
<li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).</li>
<li>Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).</li>
<li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focus+on+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A focus on fixation.</a> Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li>
<li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fos%3A+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li>
<li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li>
<li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofClinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li>
<li>Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+%28ANIT%29+induced+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li>
<li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li>
<li>Lönnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li>
<li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+%28GnRH%29+and+Pro-GnRH%2C+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li>
<li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li>
<li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li>
<li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain%3A+a+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li>
<li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury%3A+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li>
<li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li>
<li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papel+da+imuno-histoqu%C3%ADmica+no+diagn%C3%B3stico+do+c%C3%A2ncer+de+pulm%C3%A3o%5BTitle%5D)+AND+%22Jornal+Brasileiro+de+Pneumologia%22%5BJournal%5D)">Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurry%2C+RW+%22Immunocytochemistry%22">Immunocytochemistry</a>. , 65-77 (2009).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarr%2C+WB+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+Methods%22">Neuroanatomical Tract-Tracing Methods</a>. , Springer. 207-262 (1981).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cresyl+violet%3A+A+red+fluorescent+Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li>
</ol>

Niets bekend te maken

Immunohistochemie (IHC) is een veelzijdige techniek die cruciaal is geworden bij het identificeren van eiwitexpressie en lokalisatie binnen weefselsecties. Deze test wordt in de hele wetenschappelijke gemeenschap gebruikt om de kenmerken van weefsel verder te begrijpen in stadia van normale functie tot ziektetoestanden. IHC wordt op verschillende gebieden ingezet, van klinische diagnose van ziekten zoals kanker tot eerste ontdekkingen in preklinisch onderzoek10,36</sup...

Immunostaining is een populaire onderzoekspraktijk die 130 jaar geleden begon met de ontdekking van serumantistoffen in 1890 door Von Behring1. In het begin van de20e eeuw werden kleurstoffen gehecht aan antigenen en later aan antilichamen als een manier om reacties te kwantificeren en te visualiseren1, en in 1941 ontwikkelde Albert Coons de eerste fluorescerende antilichaamlabels, een ontdekking die een revolutie teweegbracht in lichtmicroscopie 2,3. De term "immunostaining" omvat vele technieken die zijn ontwikkeld met behulp van dit principe, waaronder Western blot, flowcytometrie, ELISA, immunocytochemie en immunohistochemie 3,4. Western blot detecteert de aanwezigheid van specifieke eiwitten uit weefsel- of celextracten5. Eiwitten worden gescheiden op grootte met behulp van gel-elektroforese, overgebracht naar een membraan en onderzocht met behulp van antilichamen. Deze techniek geeft de aanwezigheid van eiwit aan en hoeveel eiwit er aanwezig is; het onthult echter geen informatie over de lokalisatie van het eiwit in cellen of weefsels. Een andere methode, immunocytochemie (ICC), labelt eiwitten in cellen, meestal cellen die in vitro worden gekweekt. ICC toont zowel eiwitexpressie als lokalisatie binnen cellulaire compartimenten6. Om een specifiek eiwit op weefselniveau te detecteren en te visualiseren, wordt immunohistochemie (IHC) gebruikt.
IHC is een methode die onderzoekers gebruiken om specifieke antigenen in weefsel aan te pakken, gebruikmakend van chemische eigenschappen van het immuunsysteem 7,8. Door specifieke primaire en secundaire antilichamen te genereren die verband houden met een enzym of een fluorescerende kleurstof, kunnen antigenen van belang worden gelabeld en onthuld in de meeste weefsels (zoals besproken in Mepham en Britten)9. De term "immunohistochemie" op zichzelf specificeert niet de etiketteringsmethode die wordt gebruikt om het antigeen van belang te onthullen; deze terminologie wordt dus vaak gecombineerd met de detectietechniek om de etiketteringsmethode duidelijk af te bakenen: chromogene immunohistochemie (CIH) om aan te geven wanneer het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan een enzym, zoals peroxidase; of fluorescerend IHC om aan te geven wanneer het secundaire antilichaam is geconjugeerd aan een fluorofoor, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) of tetramethylrhodamine (TRITC). De selectiviteit van IHC stelt clinici en onderzoekers in staat om eiwitexpressie en -distributie door weefsels te visualiseren, over verschillende gezondheidstoestanden en ziekte10. In het klinische domein wordt IHC vaak gebruikt om kanker te diagnosticeren, evenals om verschillen in verschillende soorten kanker te bepalen. IHC is ook gebruikt om verschillende soorten microbiële infecties in het lichaam te bevestigen, zoals Hepatitis B of C11. In biomedisch onderzoek wordt IHC vaak gebruikt om eiwitexpressie in weefsels in kaart te brengen en is het belangrijk bij het identificeren van abnormale eiwitten die worden gezien in ziektetoestanden. Neurodegeneratie gaat bijvoorbeeld vaak gepaard met accumulatie van abnormale eiwitten in de hersenen, zoals Αβ-plaques en neurofibrillaire klitten bij de ziekte van Alzheimer. Diermodellen worden dan vaak ontwikkeld om deze pathologische toestanden na te bootsen, en IHC is een methode die onderzoekers gebruiken om de eiwitten van belang te lokaliseren en te kwantificeren 10,12,13. Op onze beurt kunnen we meer te weten komen over de oorzaken van deze ziekten en de complicaties die ermee gepaard gaan.
Er zijn veel stappen betrokken bij het uitvoeren van IHC. Eerst wordt het weefsel van belang verzameld en voorbereid voor kleuring. Aantoonbaar bereiden de meeste onderzoekers vaste weefselmonsters voor, waarbij de perfusie van het fixatief via de bloedsomloop optimaal is omdat het morfologie behoudt 14,15. Postfixatie van weefselmonsters kan ook worden gebruikt, maar kan minder dan ideale resultaten opleveren16. Crosslinking fixatieven, zoals formaldehyde, werken door chemische bindingen te creëren tussen eiwitten in het weefsel17. Vast weefsel wordt vervolgens in zeer dunne lagen of secties gesneden met behulp van een microtoom, waarbij veel onderzoekers er de voorkeur aan geven bevroren secties te verzamelen met behulp van een cryostaat. Van daaruit wordt het weefsel verzameld en ofwel rechtstreeks op een microscoopglaasje gemonteerd (slide-mounted methode), ofwel gesuspendeerd in een oplossing (free-floating methode), zoals fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)18. De gebruikte verzamelmethode is vooraf bepaald op basis van de behoeften van de onderzoeker, waarbij elk van deze twee methoden zijn eigen voor- en nadelen heeft.
De slide-mounted methode is veruit de meest gebruikte, met als belangrijk voordeel dat zeer dunne secties (10-14 μm) kunnen worden bereid, wat bijvoorbeeld belangrijk is om eiwit-eiwitinteracties te onderzoeken. Er is ook een minimale behandeling van het monster, wat potentiële schade aan de structurele integriteit van het weefsel vermindert19. Onderzoekers gebruiken deze techniek vaak met vers ingevroren weefsel (weefsel dat onmiddellijk wordt ingevroren met behulp van droogijs, isopentane, enz.), Dat zeer delicaat is in vergelijking met vast weefsel en veel zorg moet worden genomen om ontdooiing van het monster te voorkomen. Een ander voordeel van het gebruik van op dia's gemonteerde secties is dat grote hoeveelheden oplossingen voor vlekken meestal niet nodig zijn4. Onderzoekers kunnen dus een kleinere hoeveelheid dure antilichamen of andere chemicaliën gebruiken om de vlek te voltooien. Bovendien is het mogelijk om secties van verschillende experimentele groepen op dezelfde dia te monteren, wat voordelig kan zijn, vooral tijdens beeldacquisitie. Aan de andere kant zijn er enkele nadelen van het gebruik van op dia's gemonteerde secties, met name dat het weefselgedeelte aan de dia wordt gehecht, waardoor de penetratie van antilichamen aan één kant van de sectie wordt beperkt, wat de sectiedikte en de 3D-weergave van het weefsel beperkt. Het kan ook gebeuren dat tijdens het wassen de randen van het weefsel en hele secties los kunnen komen van de dia, waardoor het hele experiment nutteloos wordt. Bovendien moet IHC meestal relatief snel worden uitgevoerd bij gebruik van de op glijden gemonteerde benadering om degradatie van het antigeenepithop20,21 te voorkomen, waarbij onbewerkte dia's meestal worden opgeslagen bij -20 of -80 °C, vaak bedekt en horizontaal of in schuifdozen worden opgeslagen, wat resulteert in een relatief grote opslagvoetafdruk. Ten slotte kan de op dia's gemonteerde techniek ook tijdrovend zijn als onderzoekers grote aantallen dia's moeten verwerken om grote aantallen weefselsecties te verwerken.
Vanwege enkele van deze uitdagingen met behulp van de op dia's gemonteerde methode, is een wijziging genaamd de free-floating-methode een populair alternatief geworden. Deze techniek kwam in de literatuur in de jaren 1960-70 22,23,24, won aan populariteit in de jaren 1980 25,26,27,28,29, en is nu een gevestigde methode waarbij de vlek op de verzamelde secties in suspensie wordt uitgevoerd in plaats van vast te kleven aan een dia 12,30,31 . De vrij zwevende methode wordt niet aanbevolen wanneer weefselsecties minder dan 20 μm bedragen; in onze ervaring is het echter de benadering van keuze wanneer dikkere (40-50 μm) secties moeten worden gekleurd. Een duidelijk voordeel is dat antilichamen vanuit alle hoeken vrij zwevende secties kunnen binnendringen en minder achtergrondvlekken kunnen genereren als gevolg van effectiever wassen, wat allemaal resulteert in een betere signalering bij beeldvorming. Bovendien worden de secties na verwerking op de dia's gemonteerd, waardoor de mogelijkheid van weefselloslating wordt geëlimineerd en de tijd die de cryostaat in beslag neemt, wordt verkort. De free-floating methode kan ook veel minder arbeidsintensief zijn, vooral voor grootschalige biomedische studies. Het is bijvoorbeeld mogelijk om veel (18-40) secties van hetzelfde monster samen in dezelfde put te kleuren, wat tijd bespaart bij het uitvoeren van zowel de was- als antilichaamincubatiestappen. Bovendien, omdat een groter aantal (12-16) secties per dia kan worden gemonteerd met behulp van deze aanpak, is het vaak handiger en sneller voor de onderzoeker om secties te bekijken en af te beelden. Met name tijdens het monteren van weefselplakken op de dia's kunnen secties worden bevestigd en losgemaakt totdat de gewenste oriëntatie is verkregen. Onderzoekers gebruiken ook vaak iets lagere concentraties antilichamen met behulp van de vrij zwevende methode, en omdat de incubaties worden uitgevoerd in microcentrifugebuizen, kunnen de antilichamen gemakkelijk worden verzameld en bewaard met natriumazide voor hergebruik (zie stap 5.1). Een ander voordeel is dat de secties direct bij -80 °C kunnen worden opgeslagen in kleine microcentrifugebuizen met cryoprotectantoplossing32, waardoor de opslagruimte wordt geminimaliseerd en de levensduur van de monsters wordt gemaximaliseerd33. Een nadeel van het gebruik van deze techniek is dat de secties veel worden behandeld en dus vatbaar zijn voor schade. Dit kan echter worden verzacht door lage schud- en rotatiesnelheden te gebruiken en onderzoekers goed te trainen hoe ze de monsters kunnen overbrengen en de secties op de dia's kunnen monteren.
Alles bij elkaar is IHC een gevestigd, essentieel hulpmiddel voor het visualiseren en lokaliseren van eiwitexpressie in zowel het klinische als het biomedische onderzoek. Free-floating IHC is een efficiënte, flexibele en economische methode, vooral bij het uitvoeren van grootschalige histologische studies. Hier presenteren we een betrouwbaar vrij zwevend fluorescerend IHC-protocol voor de wetenschappelijke gemeenschap dat dienovereenkomstig kan worden aangepast voor chromogene IHC en andere kleuringen zoals hematoxyline en eosine of cresylvioletkleuring.

<table><tbody><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Klare nagellak</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Inbeddingsvormen</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleenglycol</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formaline-oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum, hitte-inactivering</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglasjesdozen</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primaire antilichaam</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rechthoekige dekglasjes</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Rechthoekige kleurplaat</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>Ronde schilderskwast #2</td><td>Princeton Select Series</td><td>3750R</td><td>Merk niet belangrijk</td></tr><tr><td>Secundair antilichaam</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Specimen matrix voor inbedding</td><td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kleurplaat &ndash; plaatkleuringssysteem</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71396-B</td><td>Gebruik donker deksel</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>Gebruikersvoorkeur</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade montagemedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Niet hard wordend</td></tr><tr><td>Welpjes voor 12-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Welpjes voor 6-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>Whatman-filterpapier</td><td>Millapore-Sigma</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemie is een veelgebruikte techniek om specifieke weefselstructuren te visualiseren, evenals eiwitexpressie en lokalisatie. Twee alternatieve benaderingen worden veel gebruikt om de weefselsecties tijdens de kleuringsprocedure te behandelen, één benadering bestaat uit het rechtstreeks op glasplaten monteren van de secties, terwijl een tweede benadering, de vrij zwevende, het mogelijk maakt om vaste secties te behouden en te kleuren terwijl ze in oplossing worden opgehangen. Hoewel op dia's gemonteerde en vrij zwevende benaderingen vergelijkbare resultaten kunnen opleveren, zorgt de vrij zwevende techniek voor een betere penetratie van antilichamen en zou dus de voorkeursmethode moeten zijn wanneer dikkere secties moeten worden gebruikt voor 3D-reconstructie van de weefsels, bijvoorbeeld wanneer de focus van het experiment ligt op het verkrijgen van informatie over dendritische en axonale projecties in hersengebieden. Bovendien, omdat de secties in oplossing worden gehouden, kan een enkele aliquot gemakkelijk 30 tot 40 secties herbergen, waarvan de behandeling minder bewerkelijk is, vooral in grootschalige biomedische studies. Hier illustreren we hoe de vrij zwevende methode kan worden toegepast op fluorescerende immunohistochemische kleuring, met een grote focus op hersensecties. We zullen ook bespreken hoe de vrij zwevende techniek gemakkelijk kan worden aangepast aan de individuele behoeften van onderzoekers en kan worden aangepast aan andere weefsels en andere op histochemische basis gebaseerde kleuringen, zoals hematoxyline en eosine en cresylviolet, zolang weefselmonsters correct zijn gefixeerd, meestal met paraformaldehyde of formaline.

Het algemene schema van het gebruik van de vrij zwevende methode om een fluorescerende immunohistochemische test uit te voeren, wordt geïllustreerd in figuur 1. Representatief voorbeeld van fluorescerende IHC met behulp van de vrij zwevende methode in muizenhersenen die gliale fibrillaire zure eiwitexpressie (GFAP) onderzoeken, wordt weergegeven in figuur 2 bij zowel lagere als hogere vergroting om de algehele kwaliteit van de kleuring te illustreren. Deze aanpa...

De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.

Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

Deze vrij zwevende techniek kan worden gebruikt om verminderde immunohistologie uit te voeren op muisbreinweefselmonsters. De vrij zwevende techniek biedt verschillende voordelen. Het verkrijgen van dikkere weefselsneden, het uitvoeren van grootschalige studies, het gebruik van 30 tot 40 plakjes per aliquot en de langdurige opslag van monsters.Als u deze techniek voor de eerste keer probeert, raden we u aan om secties te monteren die niet cruciaal zijn voor uw experiment om ervaring met de methode op te doen. Acclimatiseer ten minste een tot twee uur voor het snijden de monsters van belang in de cryostaat op de juiste snijtemperatuur van het weefsel. Wanneer de weefsels klaar zijn.gebruik de cryostaat om 20 tot 50 micron dikke secties te verkrijgen en plaats de secties in individuele inserts in PBS-gevulde putjes van een zes- of 12-putjesplaat. Wanneer alle secties zijn verkregen, bedek de monsters met ongeveer zes milliliter per wasbeurt voor drie wasbeurten van vijf minuten voordat u elke put met secties overbrengt naar microcentrifugebuisjes van twee milliliter, die een tot 1,5 milliliter opslagoplossing per buisje bevatten. Bewaar de monsters vervolgens op min 80 graden Celsius tot het kleuren.Voor het kleuren van weefselsneden, brengt u de monsters 10 tot 20 minuten op kamertemperatuur voordat u de secties afgiet in inserts in een nieuwe zes-putjesplaat. Wanneer alle opslogoplossing is afgegoten, verplaatst u de inserts naar nieuwe putjes, die ongeveer zes milliliter TBS per put bevatten voor drie wasbeurten van vijf minuten met verse TBS per wasbeurt op een orbitale shaker op lage snelheid bij kamertemperatuur. Voeg na de laatste wasbeurt zeven milliliter vers bereide blokkerende permeabiliseringsoplossing toe aan elke put voor een 30 minuten durende incubatie op de shaker bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, voegt u een milliliter van de primaire antilichaamoplossing van belang toe aan een microcentrifugebuisje van twee milliliter per insert en brengt u alle secties in elke insert over naar de juiste buis van twee milliliter. Plaats vervolgens de buisjes op een roterende mixer. Voeg ongeveer zeven omwentelingen per minuut toe voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.De volgende ochtend, giet u de secties van elk buisje in individuele putjes in een nieuwe zes-putjesplaat en was de secties twee keer gedurende 30 seconden per wasbeurt en één keer gedurende 10 minuten in verse TBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, brengt u de groepen secties over naar individuele microcentrifugebuisjes van twee milliliter, die een milliliter van de juiste secundaire antilichaamoplossing per buisje bevatten en incubeert u de monsters gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker op lage snelheid, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, giet u de secties in inserts in een nieuwe zes-putjesplaat en was de monsters twee keer gedurende 30 seconden en één keer gedurende 15 minuten in verse TBS per wasbeurt, beschermd tegen licht.Na de laatste wasbeurt, giet u de secties in een glazen rechthoekige histologische kamer, drie kwart gevuld met TBS en dompelt u een glazen plaatje in de TBS. Gebruik een fijn penseel en een vergrootlamp indien gewenst, en leid de secties voorzichtig naar de plaat en tik voorzichtig een sectie op de plaat, zorg ervoor dat er geen rimpels of plooien zijn. Wanneer alle secties op een plaatje zijn vastgelegd, laat u de plaatjes ongeveer 10 tot 15 minuten drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, totdat de secties ondoorzichtig zijn en brengt u een geschikte waterige montagemiddel aan op de secties.Gebruik pincetten om een dekglas op het medium te plaatsen en gebruik een stuk filterpapier om stevig op het dekglas te drukken om eventueel overtollig medium te verwijderen. De secties kunnen vervolgens worden geïmagineerd, met behulp van een geschikte microscoop of opgeslagen in een donkere plaatjesdoos ingesteld op vier graden Celsius. Zoals te zien is in deze representatieve afbeeldingen, kan fluorescente immunohistochemische analyse, met behulp van de vrij zwevende methode, worden uitgevoerd op muisbreinweefselsecties om de expressie van gliale fibrillaire zure eiwitten te onderzoeken.Deze aanpak is ook geschikt voor het onthullen van eiwitten met lage expressie, zoals GFP, in een laag expresserend transgeen muisbreinmonster of in niet-fluorescente histochemische kleuringsprotocollen, zoals cresylviolet. Andere perifere weefsels zijn ook geschikt voor het gebruik van deze techniek zonder dat er aanpassingen nodig zijn, zoals waargenomen voor deze laag GFP-expresserende leverweefselmonsters. Het belangrijkste om te onthouden met de vrij zwevende techniek is om voorzichtig te zijn met de secties, vooral tijdens overdrachten en wanneer de monsters op de shakers of rotators zijn.Naast een immunofluorescentiekleuring, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor andere histochemische kleurstoffen zoals hematoxyline en eosine en cresylviolet of voor chromogeen immunohistologie.

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Hier demonstreren we de meest efficiënte methoden voor het invriezen, inbedden, cryosecteren en kleuren van spierbiopten om bevriezingsartefacten te voorkomen.

Do&#39;s en Don&#39;ts in de voorbereiding van Muscle Weefsel secties voor histologische analyse

Een protocol om vrij zwevende segment culturen van volwassen menselijk brein voor te bereiden wordt gepresenteerd. Het protocol is een variatie van de veelgebruikte segment cultuurmethode met behulp van membraan inserts. Het is eenvoudig, kosteneffectief, en aanbevolen voor het uitvoeren van korte termijn testen gericht op het ontrafelen van mechanismen van neurodegeneratie achter de leeftijd geassocieerde hersenziekten.

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Hier bieden we gedetailleerde, robuuste en complementaire protocollen voor het uitvoeren van kleuring en subcellulaire resolutie beeldvorming van vaste driedimensionale celkweekmodellen variërend van 100 μm tot enkele millimeters, waardoor de visualisatie van hun morfologie, celtypesamenstelling en interacties mogelijk wordt.

Kleuring en beeldvorming met hoge resolutie van driedimensionale organoïde en sferoïde modellen

Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.

Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen

Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.

Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs

Beschrijven we een betrouwbare methode voor immunolocalization binnen de opperhuid aangepast voor zowel diepvries-en paraffine secties die we zeer regelmatig gebruiken in ons laboratorium.

Immunohistochemie op paraffine secties van Mouse Opperhuid gebruik van fluorescerende antilichamen

De volledige genotypering van een muis staart monster, met inbegrip weefsel spijsvertering en PCR uitlezing, wordt gedaan in een en een half uur met behulp van Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Snelle genotypering van Mouse weefsel met behulp van Sigma&#39;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Leer immunohistochemie met de vrij zwevende techniek voor weefselanalyse met muizenhersenweefsel. Deze methode maakt dikke secties en opslag op lange termijn mogelijk voor onderzoek.

Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties

Meer video's verkennen