Histologische kleuringen met behulp van vrij zwevende weefselsecties
25 augustus 2020
De vrij zwevende techniek stelt onderzoekers in staat om histologische kleuringen uit te voeren, waaronder immunohistochemie op vaste weefselsecties om biologische structuren, celtype en eiwitexpressie en lokalisatie te visualiseren. Dit is een efficiënte en betrouwbare histochemische techniek die nuttig kan zijn voor het onderzoeken van een groot aantal weefsels, zoals hersenen, hart en lever.
Deze vrij zwevende techniek kan worden gebruikt om verminderde immunohistologie uit te voeren op muisbreinweefselmonsters. De vrij zwevende techniek biedt verschillende voordelen. Het verkrijgen van dikkere weefselsneden, het uitvoeren van grootschalige studies, het gebruik van 30 tot 40 plakjes per aliquot en de langdurige opslag van monsters.
Als u deze techniek voor de eerste keer probeert, raden we u aan om secties te monteren die niet cruciaal zijn voor uw experiment om ervaring met de methode op te doen. Acclimatiseer ten minste een tot twee uur voor het snijden de monsters van belang in de cryostaat op de juiste snijtemperatuur van het weefsel. Wanneer de weefsels klaar zijn.
gebruik de cryostaat om 20 tot 50 micron dikke secties te verkrijgen en plaats de secties in individuele inserts in PBS-gevulde putjes van een zes- of 12-putjesplaat. Wanneer alle secties zijn verkregen, bedek de monsters met ongeveer zes milliliter per wasbeurt voor drie wasbeurten van vijf minuten voordat u elke put met secties overbrengt naar microcentrifugebuisjes van twee milliliter, die een tot 1,5 milliliter opslagoplossing per buisje bevatten. Bewaar de monsters vervolgens op min 80 graden Celsius tot het kleuren.
Voor het kleuren van weefselsneden, brengt u de monsters 10 tot 20 minuten op kamertemperatuur voordat u de secties afgiet in inserts in een nieuwe zes-putjesplaat. Wanneer alle opslogoplossing is afgegoten, verplaatst u de inserts naar nieuwe putjes, die ongeveer zes milliliter TBS per put bevatten voor drie wasbeurten van vijf minuten met verse TBS per wasbeurt op een orbitale shaker op lage snelheid bij kamertemperatuur. Voeg na de laatste wasbeurt zeven milliliter vers bereide blokkerende permeabiliseringsoplossing toe aan elke put voor een 30 minuten durende incubatie op de shaker bij kamertemperatuur.
Aan het einde van de incubatie, voegt u een milliliter van de primaire antilichaamoplossing van belang toe aan een microcentrifugebuisje van twee milliliter per insert en brengt u alle secties in elke insert over naar de juiste buis van twee milliliter. Plaats vervolgens de buisjes op een roterende mixer. Voeg ongeveer zeven omwentelingen per minuut toe voor een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius.
De volgende ochtend, giet u de secties van elk buisje in individuele putjes in een nieuwe zes-putjesplaat en was de secties twee keer gedurende 30 seconden per wasbeurt en één keer gedurende 10 minuten in verse TBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, brengt u de groepen secties over naar individuele microcentrifugebuisjes van twee milliliter, die een milliliter van de juiste secundaire antilichaamoplossing per buisje bevatten en incubeert u de monsters gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker op lage snelheid, beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, giet u de secties in inserts in een nieuwe zes-putjesplaat en was de monsters twee keer gedurende 30 seconden en één keer gedurende 15 minuten in verse TBS per wasbeurt, beschermd tegen licht.
Na de laatste wasbeurt, giet u de secties in een glazen rechthoekige histologische kamer, drie kwart gevuld met TBS en dompelt u een glazen plaatje in de TBS. Gebruik een fijn penseel en een vergrootlamp indien gewenst, en leid de secties voorzichtig naar de plaat en tik voorzichtig een sectie op de plaat, zorg ervoor dat er geen rimpels of plooien zijn. Wanneer alle secties op een plaatje zijn vastgelegd, laat u de plaatjes ongeveer 10 tot 15 minuten drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, totdat de secties ondoorzichtig zijn en brengt u een geschikte waterige montagemiddel aan op de secties.
Gebruik pincetten om een dekglas op het medium te plaatsen en gebruik een stuk filterpapier om stevig op het dekglas te drukken om eventueel overtollig medium te verwijderen. De secties kunnen vervolgens worden geïmagineerd, met behulp van een geschikte microscoop of opgeslagen in een donkere plaatjesdoos ingesteld op vier graden Celsius. Zoals te zien is in deze representatieve afbeeldingen, kan fluorescente immunohistochemische analyse, met behulp van de vrij zwevende methode, worden uitgevoerd op muisbreinweefselsecties om de expressie van gliale fibrillaire zure eiwitten te onderzoeken.
Deze aanpak is ook geschikt voor het onthullen van eiwitten met lage expressie, zoals GFP, in een laag expresserend transgeen muisbreinmonster of in niet-fluorescente histochemische kleuringsprotocollen, zoals cresylviolet. Andere perifere weefsels zijn ook geschikt voor het gebruik van deze techniek zonder dat er aanpassingen nodig zijn, zoals waargenomen voor deze laag GFP-expresserende leverweefselmonsters. Het belangrijkste om te onthouden met de vrij zwevende techniek is om voorzichtig te zijn met de secties, vooral tijdens overdrachten en wanneer de monsters op de shakers of rotators zijn.
Naast een immunofluorescentiekleuring, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor andere histochemische kleurstoffen zoals hematoxyline en eosine en cresylviolet of voor chromogeen immunohistologie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De free-floating-techniek wordt gebruikt voor het uitvoeren van immunohistochemie op gefixeerde weefselcoupes, waardoor biologische structuren, celtypen en eiwitexpressie kunnen worden gevisualiseerd. Deze methode is bijzonder effectief voor het onderzoeken van diverse weefsels, zoals hersenen, hart en lever, en biedt voordelen zoals dikkere weefselcoupes en geschiktheid voor grootschalige studies.
Belangrijke onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Histologie
- Immunohistochemie
- Weefselanalyse
Achtergrond
- Voordelen van de free-floating techniek zijn onder meer een eenvoudigere hantering en de mogelijkheid tot langdurige bewaring van monsters.
- Deze methode is zonder aanpassingen toepasbaar op meerdere biologische weefsels.
- Het verbetert de detectie van eiwitten met een lage expressie in diverse monstertypes.
Gebruikte methoden
- Immunohistochemische kleuring
- Hersenweefselmonsters van muizen
- Fluorescentiemicroscopie
Belangrijkste resultaten
- De techniek maakt het mogelijk om de expressie van gliaal fibrillair zuur proteïne te identificeren.
- Het is effectief in contexten met een lage proteïnexpressie, zoals in GFP-transgene muizenmonsters.
- Andere kleuringsmethoden, zoals hematoxyline en eosine, kunnen eveneens met deze techniek worden toegepast.
Conclusies
- De studie benadrukt de veelzijdigheid van de vliegende-methode (free-floating techniek) voor weefselkleuring en -analyse.
- Het is essentieel dat onderzoekers de monsters voorzichtig behandelen om de integriteit tijdens de experimenten te behouden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De techniek van vrijdrijvende immunohistochemie maakt een efficiënte verwerking van dikke weefselsneden voor grootschalige studies mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie en mechanische risicoreductie in het neurowetenschappelijk onderzoek en onderzoek naar perifeer weefsel. Door de penetratie van antilichamen te verbeteren en de batchverwerking van 30-40 sneden per aliquot mogelijk te maken, wordt de reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid in discovery-workflows verhoogd. Deze benadering is bijzonder waardevol voor het bestuderen van eiwitexpressiepatronen in complexe weefsels zoals de hersenen, waar 3D-reconstructie van neurale projecties bijdraagt aan de betrouwbaarheid van targets en de prioritering van portfolio's.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt visualisatie van eiwitexpressie en lokalisatie in dikke weefselcoupes mogelijk, wat bijdraagt aan functionele doelwitvalidatie en het verduidelijken van signaalpaden.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt de verwerking van grote aantallen coupes per aliquot, waardoor de arbeidsintensiviteit bij grootschalige biomarker-screeningscampagnes wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Verbetert de antilichaampenetratie in vergelijking met methoden op objectglazen, waardoor de betrouwbaarheid bij de detectie van targets met een lage abundantie, zoals GFP in transgene modellen, toeneemt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Compatibel met meerdere histochemische kleuringen, waaronder hematoxyline en eosine, cresylviolet en chromogeen immunohistochemie, wat een flexibele assay-ontwikkeling mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Secties blijven gedurende de kleuring gesuspendeerd in de oplossing, wat een uniforme blootstelling aan reagentia waarborgt en variabiliteit tussen replicaten minimaliseert.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt langdurige bewaring bij -80°C, waardoor batchverwerking en retrospectieve analyse in discovery-pipelines mogelijk zijn.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Toepasbaar op zowel het centrale zenuwstelsel als perifere weefsels (bijv. lever, hart) zonder protocolwijzigingen, wat validatie over verschillende targets heen ondersteunt.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt 3D-reconstructie van axonale en dendritische projecties mogelijk, waardoor structurele context wordt geboden voor target-interactie en pathway-analyse.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Genereert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste proteïne-expressiegegevens die go/no-go-beslissingen bij de preklinische selectie van targets informeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De free-floating methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege toetsing van doelwithypothesen tot lead-identificatie en preklinische validatie, in het bijzonder binnen de neurowetenschappen en bij de beoordeling van systemische toxiciteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-gestuurde analyse van eiwitexpressiepatronen in gefixeerde weefsels, wat mechanistisch inzicht in de biologie van het doelwit mogelijk maakt.
- Screening: Genereert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie- of chromogene readouts die geschikt zijn voor geautomatiseerde beeldvorming en beeldgebaseerde screeningplatforms.
- Analytics: Levert ruimtelijk opgeloste expressiegegevens die gekwantificeerd en vergeleken kunnen worden over verschillende experimentele condities om doelwitmodulatie te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Maakt consistentie tussen discovery- en preklinische modellen mogelijk door identieke kleuringsprotocollen toe te passen over verschillende soorten en weefseltypen.
- Enterprise Reuse: Vormt een gestandaardiseerd, aanpasbaar platform voor histologische analyse dat kan worden ingezet in meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de detectiegevoeligheid en specificiteit bij immunohistochemie, waardoor het aantal fout-negatieve resultaten in targetvalidatiestudies wordt verminderd.
- Operationele waarde: Standaardiseert de weefselverwerking en kleuringsprocedures, wat de reproduceerbaarheid tussen laboratoria verbetert en technische variabiliteit vermindert.
- Strategische waarde: Verhoogt de doorvoer bij histologiegebaseerde screening, waardoor de kosten per monster dalen en de cycli voor target de-risking worden versneld.
- Impact op portfolio: Ondersteunt datagestuurde targetprioritering door betrouwbare, multiparametrische weefseluitlezingen te leveren die inzicht geven in biologische plausibiliteit en veiligheidsmarges.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in histologie, weefselcoupes en immunofluorescentie of chromogene detectiemethoden.
- Afhankelijk van toegang tot een cryostaat, microtoom, orbitale schudmers, rotermengers en fluorescentie- of lichtveldmicroscopen.
- Vereist gestandaardiseerde blokkerings-, permeabilisatie- en wasbuffers om aspecifieke binding te minimaliseren en consistentie van de kleuring te waarborgen.
- Vereist optimalisatie van antilichaamconcentraties en incubatietijden voor elk doelwit en weefseltype, in het bijzonder voor eiwitten met een lage abundantie.
- Vereist zorgvuldige, voorzichtige behandeling van vrijzwevende coupes om mechanische beschadiging tijdens overplaatsingen en incubatiestappen te voorkomen.
