Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren
9 juli 2020
Dit protocol presenteert een methode voor het weergeven van neuronale populatieactiviteit met eencellige resolutie bij niet-transgene ongewervelde soorten met behulp van absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode array. Deze aanpak maakt een snelle workflow mogelijk, waarbij beeldvorming en analyse in één dag kunnen worden nagestreefd.
Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe een fotodiodenarray en spanningsgevoelige kleurstoffen kunnen worden gebruikt om actiepotentialen van grote aantallen neuronen gelijktijdig op te nemen. In vergelijking met calciumbeeldvorming van neurale activiteit, die indirect is, registreren de spanningsgevoelige kleurstoffen die we gebruiken actiepotentialen direct, vergelijkbaar met scherpe elektrode-opnames, maar over vele neuronen tegelijk. Onze optische beeldvormingsworkflow kan worden aangepast om netwerkactiviteit snel te visualiseren met single neuron- en single actiepotentiaalresolutie in een verscheidenheid aan niet-transgene ongewervelde en zelfs gewervelde systemen.
Bovendien zal Evan Hill uit mijn laboratorium de procedures in ons protocol demonstreren. Begin met het verdoven van een 40 gram Aplysia californica dier en prik het met de buikzijde omhoog in een gewaxte dissectieschaal. Gebruik dissectiescharen om een twee tot drie centimeter lange middenincisie te maken langs de meest voorste uiteinden van de voet en prik de flappen van de voet aan beide zijden van de incisie vast om een deel van het centrale zenuwstelsel en de buccale massa te onthullen.
Gebruik pincetten en dissectiescharen om voorzichtig het buccale mass te dissecteren, waardoor de hersenganglia zichtbaar worden, en snij de zenuwen door die het lichaam van het dier innerveren om het centrale zenuwstelsel te verwijderen, waarbij een lange lengte van de zenuw overblijft om te stimuleren. Gebruik minutian-pins om het centrale zenuwstelsel in een met zoutoplossing gevulde elastomeer-gevulde schaal te positioneren en perfundeer de schaal met zoutoplossing die door een Peltier-koelapparaat is gepasseerd om de bereidingstemperatuur op 15 tot 16 graden Celsius te houden. Gebruik de pincetten en microdissectiescharen om overtollig bindweefsel van de zenuwen te verwijderen en een oppervlakkig deel van de schede op het of de ganglia die moeten worden afgebeeld, weg te snijden.
Dompel vervolgens het schoongemaakte centrale zenuwstelsel 20 seconden in een oplossing van 0,5% glutaaraldehyde in zoutoplossing voordat het centrale zenuwstelsel wordt teruggeplaatst in de met zoutoplossing geperfundeerde elastomeer-gevulde schaal om eventuele overtollige glutaaraldehyde weg te spoelen. Om een werkoplossing van spanningsgevoelige kleurstof te bereiden, voegt u 500 microliter zoutoplossing toe aan een eerder bereide vaste aliquot van RH 155 om een uiteindelijke kleurstofconcentratie van 0,3 milligram per milliliter te bereiken. En gebruik een handbediende microdispenser om 200 microliter oplossing in een stuk polyethyleenbuis te laden met een vergelijkbare diameter als die van de ganglia die moeten worden gekleurd.
Gebruik een micromanipulator om voorzichtig het uiteinde van de buis over het doelganglion te plaatsen, waarbij de buis wordt verlaagd tot deze een strakke afdichting over het ganglion vormt. Draai de applicatorknop van de microdispenser elke vijf minuten gedurende een uur om meer kleurstof op het ganglion te forceren, en controleer het monster na 30 minuten om te bevestigen dat voldoende kleuring plaatsvindt. Na het kleuren, met de lichten gedimd, plaatst u een geschikt buffermateriaal links en rechts van waar de voorbereiding in de zoutoplossingsbevattende beeldvormingskamer zal worden geplaatst, en dompelt u vervolgens het centrale zenuwstelsel in de kamer.
Druk een geschikt formaat van een dekglas over het weefsel en druk stevig op het dekglas om het weefsel plat te maken zonder de neuronen te beschadigen. Plaats vervolgens de beeldvormingskamer onder een dissectiescoop. Als u een zenuw stimuleert om een fictief motorisch programma te eliciteren, smelt u voorzichtig een segment van PE100 polyethyleenbuis over een vlam terwijl u zachtjes aan beide uiteinden van het buissegment trekt en snijd het resulterende taps toelopende uiteinde op het gewenste punt.
Bevestig vervolgens een lengte van dikwandige flexibele polymeerbuis aan het achtereind van een polyethyleen zuigelektrode. Gebruik vervolgens een mondelinge sectie om negatieve druk te creëren en een klein volume zoutoplossing door de taps toelopende uiteinden van de zuigelektrode te trekken. Trek het uiteinde van de zenuw die moet worden gestimuleerd in de elektrode onder de microscoop en controleer of de zoutoplossing in de elektrode geen luchtbellen bevat die de elektrische geleiding kunnen onderbreken.
Voor het beeldvormen van het ganglion, verplaatst u de kamer naar de beeldvormingsinstallatie en start u de zoutoplossingsperfusie door de opnamekamer heen. Plaats een temperatuursensor nabij de voorbereiding en stel de temperatuur in zoals passend voor de soort die wordt afgebeeld. Plaats een gechloreerde zilverdraad neer de zuigelektrode in, ervoor zorgen dat deze contact maakt met de zoutoplossing in de elektrode en plaats een zilver-zilverchloridedraad in de badzoutoplossing nabij de zuigelektrode.
Laat de waterimmersielens in de zoutoplossing zakken en sluit de basisdiafragma. Verhoog of verlaag de sub-traps condensor en pas de focus aan tot de randen van het diafragma scherp in beeld staan, waardoor Kohler-verlichting ontstaat. Richt u op het gebied van de voorbereiding dat moet worden afgebeeld en neem een afbeelding van het ganglion van belang op met de parfocale digitale camera.
Stel de bedieningspaneelversterkingsschakelaar op 1X en klik op de knop voor de rustlichtintensiteit om de gemiddelde rustlichtintensiteit van de diodes te controleren. Pas het spanningsniveau aan dat van een stimulator naar de LED-lampvoeding wordt gestuurd en blijf de gemiddelde rustlichtintensiteit controleren totdat deze in het gewenste bereik ligt. Stel vervolgens de bedieningspaneelversterkingsschakelaar in op 100X voor de opname en controleer nogmaals of de veer- of luchttafel drijft.
Met de lichten nog gedimd, stelt u de bestandsduur, het pad en de naam in de beeldvormingssoftware in en klikt u op gegevens opnemen om bestanden op te nemen tot de capaciteit van het beschikbare RAM van de computer. Zorg ervoor dat u stil blijft tijdens het opnemen, omdat kleine trillingen grote artefacten in de optische opnamegegevens kunnen veroorzaken. Om de gegevens onmiddellijk na de opname te bekijken, gebruikt u de super
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het beeldvormen van neuronale populatieactiviteit met enkelcelresolutie bij ongewervelden, specifiek met behulp van spanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode-array. Deze techniek maakt de snelle visualisatie van netwerkactiviteit mogelijk over meerdere neuronen binnen een enkele dag.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Neurowetenschappen
- Neuronale beeldvormingstechnieken
- Ongewervelde modelsystemen
Achtergrond
- Uitdagingen bij het beeldvormen van neurale activiteit bij niet-transgene soorten
- Vergelijking van spanningsgevoelige kleurstoffen met traditionele calciumbeeldvorming
- Belang van directe opname van actiepotentialen voor het begrijpen van neuronale functie
Gebruikte methoden
- Optische beeldvorming met spanningsgevoelige kleurstoffen
- Ongewervelde modellen, met name Aplysia californica
- Gebruik van fotodiode-arrays voor gelijktijdige opnamen
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle opname van actiepotentialen van vele neuronen gelijktijdig
- Een protocol vastgesteld dat aanpasbaar is voor verschillende soorten
- Aangetoonde effectiviteit van de beeldvormingstechniek in complexe neurale netwerken
Conclusies
- De studie biedt een gevalideerd protocol voor het beeldvormen van neuronale dynamiek bij ongewervelden
- Het draagt bij aan het veld van de neurowetenschappen door nieuwe inzichten te bieden in neuronale populatieactiviteit
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables direct, high-resolution monitoring of neuronal network dynamics in non-transgenic species, supporting comparative neuroscience and target validation in preclinical models. By capturing action potentials across dozens of neurons simultaneously, it provides mechanistic de-risking for neurotherapeutic discovery. The approach enhances predictive confidence in early-stage screening by linking network activity to behaviorally relevant outputs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct observation of action potential patterns in native neural circuits.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking neuronal activity to motor programs without genetic manipulation.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by revealing network-level responses that correlate with behavioral phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, action potential-resolved readouts for assessing compound effects on network excitability.
- Operational Value: Enables assay standardization via reproducible staining and imaging protocols across invertebrate species.
- Scalability: Supports parallel screening through extended recording durations and minimal phototoxicity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by preserving native network physiology in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Identifies functional ensembles and dynamical trajectories that inform target engagement and pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on network-level biomarkers of efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by transforming raw optical data into network-level insights through spike sorting and dimensionality reduction, enabling hypothesis-driven screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by resolving single-neuron contributions to motor programs.
- Screening: Delivers assay readiness through stable, long-duration recordings with single-action-potential resolution.
- Analytics: Provides spike sorting and principal component analysis outputs for comparing network states across conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical by capturing behaviorally relevant network dynamics in native tissue.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cross-species comparative neuropharmacology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neuronal network responses.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dye loading, imaging, and environmental controls.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid, multi-parameter screening in native preparations.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization via network biomarkers that predict functional outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology-compatible optical imaging and voltage-sensitive dye handling.
- Dependent on stable photodiode array systems and temperature-controlled perfusion setups.
- Necessitates cross-team standardization for dissection, staining, and stimulus timing across species.
- Involves adaptation considerations for ganglion size, sheath permeability, and dye penetration in diverse invertebrates.
- Limited by dye photobleaching over extended runs, though multiple recordings per preparation are feasible with minimal signal loss.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Aplysia californica Dissection
2:21
Voltage-Sensitive Dye (VSD) Staining
3:20
Nerve Stimulation Preparation
3:53
Suction Electrode Preparation
4:40
Imaging Preparation and Optimization
6:04
Optical Recording
7:32
Results: Representative Photodiode-Based Optical Imaging in Non-Transgenic Invertebrates
9:14
Conclusion
