Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

BMEC's die gegenereerd zijn uit iPSC bieden nieuwe experimentele modellen voor het bestuderen van de functie en disfunctie van de bloed-hersenbarrière. We hebben dit protocol gebruikt om te onderzoeken of BMEC's hun barrière-eigenschappen behouden na expansie en cryopreservering. Deze techniek maakt het mogelijk om ziektespecifieke BMEC's te genereren van patiënten met aandoeningen waarbij verstoring van de bloed-hersenbarrière een rol speelt in de pathofysiologie van de ziekte.

Om BMEC-differentiatie uit menselijke iPSC's te induceren, was de confluente iPSC-cultuur eenmaal met DPBS voordat de cellen gedurende ongeveer vijf minuten bij 37 graden Celsius werden geïncubeerd met het juiste volume enzymatisch EDTA. Wanneer een enkele celsuspensie is verkregen, verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer de pellet in een geschikt volume stamcelmedium aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer voor het tellen. Verdun de cellen tot een concentratie van 1,56 keer 10 tot de vierde cellen per kubieke centimeter en zaai twee milliliter cellen in individuele putjes van een zes-putjesplaat met platte bodem.

Na 24 uur in de cellenkweekincubator vervangt u het supernatant in elke put met E6-medium en zet de plaat terug in de incubator voor nog vier dagen. Om de iPSC-afgeleide BMEC's te zuiveren, bekleedt u de subcultuurplaten met het juiste volume van een vers bereide collageen IV- en fibronectine-oplossing per put en incubeert u de platen gedurende minimaal twee uur bij 37 graden Celsius. Op dag zes van differentiatie verzamelt u de cellen door centrifugatie en suspendeert u de pellets in het juiste volume vers humaan endotheel-serumvrij medium aangevuld met B27, basische fibroblastengroeifactor en retinoïnezuur.

Voor TEER-analyse, plaatst u de gedifferentieerde cellen in elke put van een met collageen en fibronectine beklede 12-transwell gefilterde plaat. Voor effluxtransporteractiviteitsanalyse, plaatst u de cellen in elke put van een met collageen en fibronectine beklede 24-putten plaat met platte bodem. Na 24 uur subcultuur, vervangt u het supernatant in elke put met vers humaan endotheel-serumvrij medium aangevuld met alleen B27-supplement.

Om de bloed-hersenbarrière-eigenschappen van de BMEC's te meten met behulp van TEER, laadt u het TEER-instrument overnacht en veegt u het instrument en de stokjeselektroden licht af met 70%ethanol voordat u ze in de veiligheidskast plaatst. Schakel het apparaat in en kalibreer de ohmmeter volgens de specificaties van de fabrikant. Sluit de elektroden aan en spoel ze eenmaal met 70%ethanol en eenmaal met DPBS.

Plaats het kortere uiteinde van de elektrode in de atypische kamer van de insert en het langere uiteinde in de basolaterale kamer van een lege put. Na het meten van de negatieve controlereaktie, spoelt u de elektroden snel zoals gedemonstreerd en meet u de eerste experimentele put. Nadat alle metingen zijn vastgelegd, spoelt u de stokjeselektroden opnieuw, veegt u de elektroden voorzichtig af en laat u ze drogen in de veiligheidskast.

Om de effluxtransporteractiviteit van de cellen te beoordelen, behandelde u op dag acht van het kweken het juiste aantal putten met een oplossing van 10 micromolar effluxtransporterremmer en plaatst u deze een uur in een incubatiekast bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, behandelde u de cellen gedurende een uur in de incubatiekast met een oplossing van 10 micromolar effluxtransportersubstraat. Aan het einde van de incubatie, spoelt u elke put twee keer met 500 microliter DPBS per put voordat u de cellen lyst met 500 microliter DPBS aangevuld met 5%Triton-X per put.

Na vijf minuten, gebruikt u een microplaatlezer om de fluorescentie van de gelyste cellen te meten bij een excitatie van 485 nanometer en een emissie van 530 nanometer. Voor putten die niet worden gebruikt in de transportassay, wast u de cellen twee keer met DPBS voordat u ze fixeert met 4%paraformaldehyde per celkernkwantificering. Na één dag kweken in E6-medium is de celmorfologie vergelijkbaar met die van iPSC's.

Tegen dag vier zijn de cellen duidelijk te onderscheiden van iPSC's en bedekken ze het grootste deel van de put. Twee dagen kweken in humaan endotheel-serumvrij medium induceert een langwerpige en kasseien-achtige verschijning in de cellen. Op dag acht vormen individuele cellen een grotendeels grote kasseien-achtige patroon.

Een ontluikend assay kan worden uitgevoerd om het angiogeen potentieel van iPSC-afgeleide BMEC's te demonstreren. Dit leidt tot de ontwikkeling van buis-achtige structuren na drie dagen behandeling met groeifactoren. De iPSC-afgeleide BMEC's die met dit protocol zijn gegenereerd, co-exprimeerden strakke verbindingseiwitten die tot expressie worden gebracht in endotheelcellen in de hersenen, longen, lever en nieren, evenals vasculaire endotheelmarkers die tot expressie worden gebracht op de bloed-hersenbarrière.

Zoals waargenomen, vertonen iPSC-afgeleide BMEC's 48 uur na subculture en mediumverversing TEER-waarden binnen het bereik dat wordt beschreven voor iPSC-afgeleide BMEC's die werden meegekweekt met ratten primaire astrocyten. Effluxtransporteractiviteit werd ook in dit stadium waargenomen. Na cryopreservering zijn de TEER-metingen lager vergeleken met vers afgeleid BMEC's.

Western blot-analyse onthult verminderde niveaus van strakke verbindingsmarkers, zoals occludine, terwijl immunocytochemie sprokkelig en/of gerafelde patronen van strakke verbindingseiwitten toont. Een te hoge of te lage iPSC-dichtheid zal de differentiatie-efficiëntie beïnvloeden en de ontwikkeling van geschikte bloed-hersenbarrière-eigenschappen beïnvloeden. Deze methode maakt het mogelijk om de barrière-eigenschappen, cellulaire signalering en transporteractiviteit te onderzoeken met behulp van geïndividualiseerde BMEC's om de fysiologie en pathofysiologie van de bloed-hersenbarrièrefunctie te modelleren.