Name: Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Leer een protocol voor differentiatie, expansie en cryopreservatie van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze methode onderzoekt bloed-hersenbarrière-eigenschappen en functionele integriteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (to R.K.), een National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). een National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (to R.K.), a Sydney R Baer Jr Foundation Grant (to P.L.) the Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (to R.K.), the Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (to R.K.), the Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (naar R.K.), het Harvard Stem Cell Institute (naar R.K.) en door Steve Willis en Elissa Freud (naar R.K.). We danken Dr. Annie Kathuria voor haar kritische lezing en feedback op het manuscript.

Menselijke iPSC 's werden geherprogrammeerd vanuit de fibroblasten van gezonde donoren met behulp van een protocol dat werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van het Massachusetts General Hospital en McLean Hospital, en werd gekenmerkt zoals beschreven in eerdere studies44,45,46.
OPMERKING: Kortom, fibroblasten werden geherprogrammeerd naar iPSC via mRNA-gebaseerde genetische herprogrammering47. De iPSC's werden onderhouden in stamcelmedium (SCM) (zie materiaallijst) en opgeslagen bij een dichtheid van ~1,2 x 102 cellen/ml met 1 ml SCM, 10 μM met rho-geassocieerde eiwitkinaseremmer (ROCKi) Y-27632, en 10% (v/v) dimethylsulfide (DMSO), in cryopreserveerde flacons in vloeibare stikstof bij -160 °C. Alle onderstaande procedures worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast, tenzij anders vermeld.
1. Keldermembraanmatrixverdunning en plaatcoating
<ol><li>Verdun (1:50) groeifactor verminderde keldermembraanmatrix gezuiverd van Engelbreth-Holm-Swarm tumor in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) zonder fenolrood.</li>
	<li>Bedek celkweekplaten met de juiste hoeveelheid verdunde keldermembraanmatrix (d.w.z. 6-putplaat = 1 ml, 12-putplaat = 0,5 ml) en incubeer deze platen gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C.</li>
</ol>2. iPSC onderhoud
OPMERKING: De maximale samenvloeiing per put in een plaat met een vlakke bodem van 6 putten is ~ 1,2 x 106 cellen.
<ol><li>Ontdooi cryopreserveerde iPSC's in SCM met 10 μM Y-27632 en plaat op een 6-put plaat bedekt met verdunde groeifactor verminderde keldermembraanmatrix.</li>
	<li>Onderhoud iPSC's in SCM met 10 μM Y-27632 gedurende de eerste 24 uur na ontdooien. Schakel na 24 uur over op vers medium.</li>
	<li>Onderhoud iPSC's in SCM totdat cellen 80-90% gelijktijdigheid bereiken voordat ze passeren.<ol>
<li>Bereken hoeveel iPSC's nodig zijn voor differentiatie door de gewenste dichtheid voor differentiatie (15.600 cellen/cm2)te vermenigvuldigen met het oppervlak van de put. Vermenigvuldig voor een plaat met een vlakke bodem van 6 putten 15.600 cellen/cm2 met 9,6 cm2 voor een totaal van 149.760 cellen/put.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was de cellen met Hanks' Balanced Salt Solution (HBBS). Incubeert vervolgens de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C met niet-enzymatisch ethyleendiaminetetraacetisch zuur (EDTA) (zie materiaallijst).<ol>
<li>Gebruik een celschraper om de cellen voorzichtig op te tillen. Verzamel cellen in verse SCM.</li>
		<li>Plaatcellen op celkweekplaten bedekt met verdunde SCM en onderhouden cellen zoals beschreven in stap 2.3 of bewaren ze op ~1,2 x 106 cellen/ml in 1 ml SCM, 10 μM Y-27632 en 10% DMSO (v/v) in cryopreserveerde flacons in vloeibare stikstof bij een temperatuur van -160 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Differentiatie van iPSC's naar BMECs
OPMERKING: Niet-enzymatische EDTA scheidt cellen in klonten. Enzymatische EDTA (zie Tabel met materialen)scheidt cellen in eencellige suspensie. Retinoïnezuur (RA) moet worden beschermd tegen licht.
<ol><li>Was iPSC's eenmaal met Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS). Incubeer met enzymatische EDTA (1 ml voor 6-putplaat, 0,5 ml voor 12-putplaat en 0,25 ml voor 24-putplaat) gedurende ongeveer 5 minuten bij 37 °C om een suspensie met één cel op te leveren.</li>
	<li>Verzamel cellen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g (relatieve centrifugaalkracht). Resuspend celkorrels in SCM met 10 μM Y-27632.</li>
	<li>Bepaal de celdichtheid met behulp van Trypan Blue en een geautomatiseerde celteller of een hemocytometerapparaat. Plaatcellen met een dichtheid van 15.600 cellen/cm2 of 149.760 cellen/put van een 6-put vlakke bodemplaat (met een oppervlakte van 9,6 cm2/put) in SCM met 10 μM Y-27632 gedurende 24 uur.</li>
	<li>Start differentiatie na 24 uur door SCM naar E6 medium te veranderen. Verander E6 medium dagelijks voor de komende 4 dagen.</li>
	<li>Vervang op dag 4 van differentiatie E6 medium door hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27 supplement, 20 ng/ml bFGF en 10 μM RA. Verander dit medium de komende 48 uur niet.</li>
	<li>Bereid 200 ml hESFM met verdunde (1:200) B27, meng 1 ml van 50x geconcentreerd B27-supplement tot 199 ml hESFM.</li>
	<li>Bereid 20 ng/ml bFGF voor door 50 μg bFGF te reconstitueren in 250 μL Tris-buffer (5 mM Tris, pH 7,6, 150 mM NaCl) om 200 μg/ml voorraadoplossing te maken. Bereid 200 ml hESFM met 20 ng/ml bFGF door 20 μL van 200 μg/ml bFGF te mengen met 200 ml hESFM.</li>
	<li>Bereid 10 μM RA door eerst een 40 mg/ml RA-stamoplossing te maken door 2,5 ml DMSO toe te voegen aan 100 mg RA-poeder. Verdun deze concentratie tot 3 mg/ml om 10 mM voorraadoplossing te maken. Bereid 200 ml hESFM met 10 μM RA door 200 μL 10μM RA te mengen in 200 ml hESFM.</li>
</ol>4. Coating collageen IV (COL4) en fibronectine (FN) Matrix voor zuivering van iPSC-afgeleide BMEC
<ol><li>Voeg 2 ml steriel water toe aan 2 mg FN om 1 mg/ml FN-voorraadoplossing te maken. Voeg 5 ml steriel water toe aan 5 mg COL4 om een voorraadoplossing van 1 mg/ml COL4 te maken.<ol>
<li>Laat FN minstens 30 minuten oplossen bij 37 °C en de COL4 lost op bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdun de FN-stamoplossing in steriel water tot een uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml en COL4-stamoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 400 μg/ml.</li>
	<li>Bedek de gewenste platen (6-putplaat = 1 ml COL4/FN-oplossing, 12-putplaat = 0,5 ml, 24-putplaat= 0,25 ml en 12-transwell gefilterde plaat = 0,25 ml) met het mengsel van 400 μg/ml COL4 en 100 μg/ml FN.</li>
	<li>Incubeer platen gedurende ten minste 2 uur of 's nachts bij 37 °C; voor transwell gefilterde platen wordt een minimum van 4 uur aanbevolen.</li>
</ol>5. Subcultuur en zuivering van iPSC-afgeleide BMECs
OPMERKING: Incubatie met enzymatische EDTA kan langer dan 15 minuten duren, afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen op dag 6 van differentiatie.
<ol><li>Was op dag 6 van differentiatie twee keer cellen met DPBS. Incubeer met 1 ml enzymatische EDTA gedurende ten minste 15 minuten bij 37 °C totdat een suspensie met één cel is verkregen.</li>
	<li>Verzamel cellen via centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend celkorrels met verse hESFM met verdund (1:200) B27 supplement, 20 ng/ml bFGF en 10 μM RA.</li>
	<li>Zaadcellen op platen bedekt met een mengsel van 400 μg/ml COL4 en 100 μg/ml FN. Zaadcellen met een verhouding van 1 put van een plaat met 6 putten tot 3 putten van een plaat met 12 putten, 3 putten van een gefilterde plaat met 12 transwells of 6 putten van een plaat met 24 putten.</li>
	<li>Zaad ongedifferentieerde iPSC's van dezelfde cellijn naar COL4/FN gecoate 12-transwell gefilterde plaat als negatieve controle voor TEER-analyse.</li>
	<li>Na 24 uur sub-culturing, verander medium naar hESFM met B27 supplement alleen. Na deze stap zijn er geen middelgrote wijzigingen meer nodig.</li>
</ol>6. Ontspruitende test
<ol><li>Verzamel dag 8 iPSC-afgeleide BMECs en zaai ze op 100.000 cellen/put op een 24-put platbodemplaat vers bedekt met 200 μL/cm2 keldermembraanmatrix.</li>
	<li>Behandel deze cellen met hESFM met verdunde (1:200) B27 en 40 ng/ml vasculaire endotheelgroeifactor A (VEGFA165).</li>
	<li>Observeer cellen om de 24 uur en verander het medium om de twee dagen.</li>
</ol>7. Immunocytochemie (ICC)
OPMERKING: ICC wordt uitgevoerd op platen met een vlakke bodem van 24 putten.
<ol><li>Na 48 uur sub-culturing (dag 8), was cellen twee keer met DPBS. Fixeer cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Was cellen drie keer met DPBS, 5 minuten per wasbeurt. Blokkeer cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in DPBS met 5% ezelserum en 0,3% Triton X-100 (v/v).</li>
	<li>Incubatie met primaire antilichamen: muisanti-mens-PECAM1 (1:100, stam 0,5 mg/ml), konijn anti-mens-TJP1 (1:200, stam 0,53 mg/ml), muis anti-mens-CLDN5 (1:200, voorraad 0,5 mg/ml), muisanti-mens-OCLN (1:200, voorraad 0,5 mg/ml) en konijn anti-mens-SLC2A1(1:100, voorraad 0,2 mg/ml) in DPBS met 5% ezelserum 's nachts bij 4°C.<ol>
<li>Spoel de cellen eenmaal af met DPBS en was vervolgens vijf keer gedurende 5 minuten per wasbeurt met DPBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incub cellen met secundaire antilichamen: ezel-anti-konijn Alexa Fluor 555 (1:200) en ezel-anti-muis 488 (1:200) in DPBS met 5% ezelserum gedurende 1 uur.</li>
	<li>Voeg na deze incubatie Hoechst 33342 trihydrochloridetrihydraat verdund (1:1000) gedurende 10 minuten toe aan DPBS.<ol>
<li>Verwijder de Hoechst 33342-oplossing en spoel eenmaal met DPBS en was vier keer met DPBS gedurende 5 minuten per wasbeurt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualiseer cellen op fluorescentiemicroscopen om te zoeken naar expressie en lokalisatie van celmakers.</li>
</ol>8. TEER-meting en -analyse
OPMERKING: Corning 12-Transwell gefilterde platen zijn uitgerust met filters bestaande uit 1,12 cm2 polyethyleen tereftalaat membranen en 0,4 micrometer poriën. TEER-metingen worden verkregen in technische (3 per put) en biologische replica's (3 putten per cellijn en/of toestand).
<ol><li>Meet 24 uur na sub-culturing (dag 7) elke 24 uur TEER met behulp van eetstokelektrodes en een voltohmmeter. Raadpleeg de gebruikershandleiding van de Voltohmmeter voor specifieke instructies voor het verkrijgen van metingen.<ol>
<li>Om TEER te meten, laadt u het voltohmmeter-instrument de avond ervoor op. Veeg het instrument en de eetstokelektrodes licht af met 70% ethanol voordat u ze in de veiligheidskap plaatst.</li>
		<li>Schakel de stroom in en kalibreer de ohm-meter zoals aanbevolen door de fabrikant.</li>
		<li>Sluit de eetstokelektrodes aan en spoel elektroden af met 70% ethanol gevolgd door DPBS.</li>
		<li>Plaats de kortere eindelektrode in de transputinzet (de apicale kamer) en het langere uiteinde in de basolaterale kamer.</li>
		<li>Meet eerst een lege put die alleen is bedekt met COL4 / FN. Meet vervolgens de andere putten.</li>
		<li>Spoel eetstokelektrodes snel af met 70% ethanol gevolgd door DPBS bij het meten van verschillende omstandigheden (d.w.z. het meten van verschillende cellijnen).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nadat alle metingen (in Ω) zijn geregistreerd, spoelt u eetstokelektrodes af met 70% ethanol en vervolgens steriel water. Veeg de elektrode voorzichtig af en laat deze aan de lucht drogen in de veiligheidskap.</li>
	<li>Gemiddelde van de driedubbele TEER-waarden (in Ω) van de lege put en trek deze gemiddelde waarde af van elke ruwe TEER-waarde op voorwaarde.<ol>
<li>Gemiddelde van de afgetrokken waarden en vermenigvuldig ze met 1,12 cm2 (het oppervlak van de 12-transwell insert).</li>
		<li>Gebruik getransformeerde waarden uit stap 6 om de grafiek te genereren met TEER-waarde en standaardfouten voor elke dag TEER-meting.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Efflux Transporter Activiteit en Analyse
OPMERKING: Efflux transporter activiteitstest wordt uitgevoerd op een 24-put vlakke bodemplaat. Efflux transporteurs van belang zijn onder andere ABCB1 en ABCC1. Het wordt aanbevolen om elke aandoening in drievoud uit te voeren met controleputten (d.w.z. lege putten zonder de respectieve remmers).
<ol><li>Na 48 uur sub-culturing (dag 8) gedurende 1 uur bij 37 °C cellen incuberen met 10 μM Valspodar (ABCB1-remmer) of 10 μM MK571 (ABCC1-remmer).<ol>
<li>Bereid 10 mM Valspodaire bouillon door 5 mg poeder (1214,64 g/mol) op te lossen in 412 μL DMSO en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM met 10 μM Valspodar te maken, mengt u 10 μL valspodarvoorraad van 10 mM met 10 ml hESFM.</li>
		<li>Bereid 10 mM MK571 voorraad door 5 mg poeder (537,07 g/mol) op te lossen in 931 μL en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM te maken met 10 μM MK571, mengt u 10 μL van 10 mM MK571 voorraad met 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer na 1 uur cellen met 10 μM rhodamine 123 (ABCB1-substraat) of 10 μM 2',7'-dichloorhydrofluoresceïnediacetaat (H2DCFDA, ABCC1-substraat) met of zonder hun respectieve remmers gedurende 1 uur bij 37 °C.<ol>
<li>Bereid 10 mM rhodamine 123 door 10 mg poeder (380,82 g/mol) op te lossen in 875 μL DMSO en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM te maken met 10 μM rhodamine 123, mengt u 10 μL van 10 mM rhodamine 123 voorraad met 10 ml hESFM.</li>
		<li>Bereid 10 mM H2DCFDA door 50 mg poeder (487,29 g/mol) op te lossen in 10,26 ml DMSO en verdun tot een werkconcentratie van 10 μM. Om bijvoorbeeld 10 ml hESFM te maken met 10 μM rhodamine 123, mengt u 10 μL van 10 mM rhodamine 123 voorraad met 10 ml hESFM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Was cellen tweemaal met 0,5 ml DPBS en lyse met DPBS met 5% Triton-X (v/v).</li>
	<li>Meet de fluorescentie van de gelyseerde cellen met behulp van een meerplaats- of microplaatlezer (zie materiaallijst).<ol>
<li>Stel het instrument van de fluorescerende plaatlezer in op 485 nanometer excitatie en 530 nanometer emissie en meet fluorescentie op deze golflengten.</li>
		<li>Voor putten die niet in de transportertest worden gebruikt, was cellen twee keer met DPBS voordat u ze bevestigt met 4% PFA voor celkernenkwantificering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer cellen met Hoechst 33342 trihydrochloridetrihydraat verdund (1:1000) in DPBS gedurende 10 minuten. Beeld meerdere visuele velden in elke put om het gemiddelde aantal celkernen te berekenen met behulp van fluorescentiemicroscopen.</li>
	<li>Tel kernen met Fiji en normaliseer fluorescentiewaarden per cel voor deze tellingen.<ol>
<li>Bereken de gemiddelde accumulatie van fluorescentie door de ruwe fluorescentieaccumulatiewaarde voor elke voorwaarde af te trekken van de respectieve lege waarde.</li>
		<li>Gemiddelde afgetrokken waarden voor elke voorwaarde.</li>
		<li>Deel de gemiddelde waarden van stap 9.6.1 door het gemiddelde aantal cellen. Gebruik deze waarden om fluorescentiewaarden per cel te normaliseren.</li>
		<li>Gebruik genormaliseerde waarden om een grafische weergave te genereren voor elke remmeraandoening en voer de nodige statistische analyses uit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. Passaging, Expanding en Cryopreserving BMECs
<ol><li>Vul dag 8 BMEC-culturen aan met verse hESFM aangevuld met verdunde (1:200) B27 en laat cellen nog twee dagen uitbreiden op de COL4/FN-matrix.</li>
	<li>Bedek een nieuwe 12-Transwell gefilterde plaat en een 24-put vlakke bodemplaat met 400 μg/ml COL4 en 100 μg/ml FN en incubeer gedurende 4 uur.</li>
	<li>Was op dag 10 cellen met DPBS en incubeer met 1 ml enzymatische EDTA gedurende ten minste 15 minuten bij 37°C totdat een suspensie met één cel is verkregen.</li>
	<li>Verzamel cellen via centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.<ol>
<li>Om deze cellen cryopreserveer te maken, resuspend celkorrels met verse hESFM met 30% Foetaal Runderserum (FBS) en 10% DMSO.</li>
		<li>Bewaar iPSC-afgeleide BMECs in cryopreserveerde flacons in een isopropanolcontainer gedurende de eerste 24 uur bij -80 °C en plaats deze vervolgens in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -160 °C.</li>
		<li>Om deze cellen te passeren, resuspend celkorrels met verse hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaadcellen op gecoate platen bereid in stap 10.2. Zaadcellen met een verhouding van 1 put van een 6-puts plaat tot 3 putten van een 12-transwell gefilterde plaat en tot 6 putten van een 24-put plaat. Laat cellen 24 uur groeien en uitzetten.</li>
	<li>Meet teer op dag 11 door de stappen in stap 8 te volgen.</li>
	<li>Voer icc op dag 12 uit door de stappen te volgen die zijn vermeld in stap 9.</li>
	<li>Om cryopreserveerde BMECs te ontdooien, plaatst u de cryopreserveerde flacons in een warm water of kraalbad op 37oC. Breng vervolgens de ontdooide BMECs over naar 5 ml hESFM aangevuld met verdunde (1:200) B27.<ol>
<li>Verzamel cellen via centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27, 10 μM RA en 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Schakel na 24 uur medium naar hESFM aangevuld met verdund (1:200) B27 en 10 μM Y-27632 zonder RA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wijzigingen en probleemoplossing
In dit protocol hebben we enkele wijzigingen aangebracht in het gebruik van een veelgebruikte extracellulaire matrix en celkweekmedia tijdens iPSC-culturing voor afleiding van BMECs (figuur 1). Deze wijzigingen hadden geen invloed op het vermogen om BMECS af te leiden van menselijke iPSC 's zoals beschreven in het Lippmann-protocol1. Een iPSC-lijn van een andere gezonde donor werd gebruikt o...

Bloed-hersenbarrièrefunctie De bloed-hersenbarrière (BBB) vormt een grens die de beweging van stoffen van het bloed naar de hersenen beperkt. De BBB bestaat uit microvasculaire endotheelcellen (BMECs) die een monolaag vormen langs de vasculatuur. BMECs vormen samen met astrocyten, neuronen, pericyten, microglia en extracellulaire matrix de neurovasculaire eenheid. BMECs hebben een strak gereguleerde paracellulaire structuur die de BBB in staat stelt een hoge trans-endotheel elektrische weerstand (TEER) te handhaven, die passieve diffusie beperkt en dient als indicator voor barrière-integriteit1,2. BMECs hebben ook eiwitten die helpen bij transcellulaire beweging zoals endocytose, transcytose en transmigratie, evenals extravasatie van leukocyten tijdens een immuunrespons3. BMECs vertrouwen op influx en efflux transporters voor voeding en verwijdering van afvalproducten, om een homeostatische balans in de hersenen te behouden3. Solute Carrier Family 2 member 1 (SLC2A1) is bijvoorbeeld een influx transporter die verantwoordelijk is voor de beweging van glucose over de BBB4, terwijl efflux transporters zoals de ATP binding cassette subfamilie B lid 1 (ABCB1) en de ATP binding cassette subfamilie C lid 1 (ABCC1) verantwoordelijk zijn voor het terugbrengen van substraten terug in de bloedstroom3,5,6,7. ABCB1-substraten omvatten morfine, verapamil4en antipsychotica zoals olanzapine en risperidon8, terwijl de ABCC1-transporteur een verscheidenheid aan substraten heeft, waaronder sulfaatconjugaten, vincristine en glucuronideconjugaten4.
Toepassing van BBB-modellen bij psychiatrische stoornissen BBB-disfunctie is betrokken bij een aantal neurologische en psychiatrische stoornissen, waaronder schizofrenie en bipolairestoornis 9,10. Onlangs werden van iPSC afgeleide ex vivo cellulaire modellen gebruikt om de cellulaire en moleculaire onderbouwing van psychiatrische stoornissen te ondervragen, maar deze modellen houden momenteel geen rekening met de potentiële rol van de neurovasculatuur11,12,13. Er wordt aangenomen dat perifere inflammatoire cytokinen die in het bloed circuleren een negatieve invloed kunnen hebben op de BBB14,15,16,17, maar er is ook bewijs voor paracellulaire18,19,20,21,22, transcellulaire23,24,25,26,27,28,29, en extracellulaire matrix20,29,30,31,32 afwijkingen die bijdragen aan BBB-disfunctie. Verstoring van de BBB kan ertoe leiden dat de inhoud van het bloed het hersenparenchym binnendringt en astrocyten en/of microglia activeert om pro-inflammatoire cytokinen vrij te geven, die op hun beurt een ontstekingsreactieinitiëren 33 die schadelijke effecten op de hersenen kan hebben34. BMECs zijn de primaire component van de BBB en het onderzoeken van de structuur en functie van deze cellen kan het begrip van BBB-disfunctie bij neurologische en psychiatrische stoornissen verbeteren.
Alternatieve BMEC-modellen Voorafgaand aan de ontwikkeling van efficiënte protocollen voor het afleiden van BMECs uit iPSC's1,6,35,36,hadden onderzoekers vereeuwigde BMECs37 gebruikt om de BBB-functie te bestuderen. Veel van deze modellen slaagden er echter niet in om wenselijke BBB-fenotypen te bereiken, zo'n fysiologisch bereik van TEER-waarden38,39. Het gebruik van iPSC's heeft het voordeel dat de genetische achtergrond van het individu waaruit de cellen zijn afgeleid, behouden blijft. Wetenschappers werken actief aan het opzetten van iPSC-afgeleide ex vivo micromilieumodellen die de structuur en functie van het menselijk brein samenvatten. Onderzoekers hebben methoden ontwikkeld om BMECs af te leiden die structureel en fysiologisch vergelijkbaar zijn met BMECs gevonden in vivo. Methoden voor het verkrijgen van gezuiverde populaties van iPSC-afgeleide BMECs vereisen een aantal verschillende stappen waarbij protocollen in de afgelopen jaren zijn geoptimaliseerd1,6,35,36. Over het algemeen worden iPSC-afgeleide BMECs gedurende 4 dagen gekweekt in Essential 6 (E6) medium, gevolgd door 2 dagen in humaan endotheel serumvrij medium (hESFM) aangevuld met basis fibroblast groeifactor (bFGF), retinoïnezuur (RA) en B27 supplement. De cellen worden vervolgens gekweekt op een collageen IV (COL4) en fibronectine (FN) matrix om >90% homogene BMECs te verkrijgen1.
De identiteit van BMECs wordt bevestigd door immunofluorescentie die de co-expressie van BMEC-eiwitten laat zien, waaronder bloedplaatjes-endotheelcelhechtingsmolecuul-1 (PECAM1), SLC2A1 en strakke verbindingseiwitten zoals tight junction protein 1 (TJP1), occludin (OCLN) en claudin-5 (CLDN5)6. Kiemtests zijn gebruikt om het angiogene potentieel van van iPSC afgeleide BMECs te bevestigen. 6 De BBB-integriteit van BMECs wordt beoordeeld door de aanwezigheid van fysiologische in vitro TEER-waarden (~2000Ω x cm2)37 en meetbare activiteit voor effluxtransporters zoals ABCB1 en ABCC11,6,36. Recente methodologische vooruitgang van de Lippmann-groep heeft geleid tot iPSC-afgeleide BMEC-protocollen met verminderde experimentele variabiliteit en verbeterde reproduceerbaarheid1. Het is echter niet bekend of ze kunnen worden uitgebreid en voorbij het sub-culturing stadium kunnen worden doorgetrokken. Ons gewijzigde protocol is bedoeld om dit probleem aan te pakken door iPSC-afgeleide BMECs na dag 8 door te geven en te beoordelen of ze verder kunnen worden uitgebreid om BBB-eigenschappen te behouden na cryopreservatie. Hoewel er geen studies zijn beschreven over het passeren van iPSC-afgeleide BMECs, bestaat er een protocol voor BMEC cryopreservatie dat fysiologische BBB-eigenschappen behoudt na het ondergaan van een vriesdooicyclus40. Het is echter niet bekend dat BMECs na cryopreservatie kunnen worden doorgegang en BBB-eigenschappen behouden.
BMECs afgeleid van iPSC's die het Lippmann-protocol gebruiken, zijn gebruikt om BBB-verstoring bij neurologische aandoeningen zoals de Ziekte van Huntingtonte modelleren 7. Dergelijke van iPSC afgeleide BMECs zijn ook gebruikt om de effecten van bacteriële infectie zoals Neisseria meningitidis of Groep B Streptococcus op verstoring van de bloed-CSF-barrière en BBB respectievelijk41,42te onderzoeken . Ook, met behulp van iPSC-afgeleide BMECs van 22q deletiesyndroom patiënten met schizofrenie, onderzoekers waargenomen een toename van intercellulaire adhesie molecuul-1 (ICAM-1), een belangrijke adhesie molecuul in BMECs die helpen bij de werving en extravasatie van leukocyten in de hersenen43. Samen tonen deze studies het nut aan van iPSC-afgeleide BMECs voor het bestuderen van BBB-verstoring bij complexe neuropsychiatrische aandoeningen.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6964-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>3528S</td><td></td></tr><tr><td>CLDN5 (Claudin-5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV from human placenta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533-5mg</td><td></td></tr><tr><td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&nbsp;</td><td>Corning</td><td>&nbsp;8670</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td><td>Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td>Countess slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (without phenol red)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp;A1413202</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2438-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Donkey serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (+/+)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td><td>World Precision Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-2mg</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelial serum-free medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 6000</td><td>General Electric</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp;Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MK-571</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7571-5MG</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Stemgent</td><td>01-0005</td><td></td></tr><tr><td>Occludin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human VEGF 165</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702-10MG</td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 (GLUT-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA1-21041</td><td></td></tr><tr><td>SOX17</td><td>Cell Signaling</td><td>81778S</td><td></td></tr><tr><td>TJP-1 (ZO-1)</td><td>ThermoFisher</td><td>PA5-28869</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SML0572-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Versene solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td><td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMECs) kunnen worden onderscheiden van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) om ex vivo cellulaire modellen te ontwikkelen voor het bestuderen van de bloed-hersenbarrière (BBB) functie. Dit gewijzigde protocol biedt gedetailleerde stappen om BMECs af te leiden, uit te breiden en cryopreserve te maken van menselijke iPC's met behulp van een andere donor en reagentia dan die in eerdere protocollen. iPSC's worden behandeld met essentiële 6 medium gedurende 4 dagen, gevolgd door 2 dagen humaan endotheel serumvrij kweekmedium aangevuld met basis fibroblast groeifactor, retinoïnezuur en B27 supplement. Op dag 6 worden cellen gedurende 2 dagen onderverdeeld in een collageen/fibronectinematrix. Immunocytochemie wordt uitgevoerd op dag 8 voor BMEC-markeranalyse met behulp van CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 en SLC2A1. Western blotting wordt uitgevoerd om bmec-markeringsexpressie en afwezigheid van SOX17, een endodermale marker, te bevestigen. Angiogeen potentieel wordt aangetoond met een kiemende test. Trans-endotheel elektrische weerstand (TEER) wordt gemeten met behulp van eetstok elektroden en voltohmmeter vanaf dag 7. Efflux transporter activiteit voor ATP binding cassette onderfamilie B lid 1 en ATP binding cassette onderfamilie C lid 1 wordt gemeten met behulp van een multi-plate reader op dag 8. Succesvolle afleiding van BMECs wordt bevestigd door de aanwezigheid van relevante celmarkers, lage niveaus van SOX17, angiogeen potentieel, transportactiviteit en TEER-waarden ~2000 Ω x cm2. BMECs worden uitgebreid tot dag 10 alvorens over te gaan op vers gecoate collageen/fibronectine platen of cryopreserved. Dit protocol toont aan dat iPSC-afgeleide BMECs ten minste één keer kunnen worden uitgebreid en doorgegeven. Lagere TEER-waarden en een slechtere lokalisatie van BMEC-markers werden echter waargenomen na cryopreservatie. BMECs kunnen worden gebruikt in co-cultuur experimenten met andere celtypen (neuronen, glia, pericyten), in driedimensionale hersenmodellen (organ-chip en hydrogel), voor vascularisatie van hersenorganoïden, en voor het bestuderen van BBB-disfunctie bij neuropsychiatrische aandoeningen.

BMEC Differentiatie Een paar kritieke stappen in dit protocol moeten nauwkeurig worden gevolgd (figuur 1). E6 gemiddeld gebruik op dag 1 is belangrijk, omdat het vaak wordt gebruikt voor het afleiden van neuro-ecomderm-afstamming van iPSC's binnen een relatief korte periode die reproduceerbare resultaten oplevert over meerdere cellijnen36. Een andere belangrijke stap is op dag 4 van differentiatie, waarbij E6 medium moet worden overgeschakeld op hE...

Dit protocol beschrijft een aangepaste methode om microvasculaire endotheelcellen van de hersenen af te leiden, uit te breiden en cryopreserveren, verkregen door het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en om de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière in een ex vivo model te bestuderen.

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

BMEC's die gegenereerd zijn uit iPSC bieden nieuwe experimentele modellen voor het bestuderen van de functie en disfunctie van de bloed-hersenbarrière. We hebben dit protocol gebruikt om te onderzoeken of BMEC's hun barrière-eigenschappen behouden na expansie en cryopreservering. Deze techniek maakt het mogelijk om ziektespecifieke BMEC's te genereren van patiënten met aandoeningen waarbij verstoring van de bloed-hersenbarrière een rol speelt in de pathofysiologie van de ziekte.Om BMEC-differentiatie uit menselijke iPSC's te induceren, was de confluente iPSC-cultuur eenmaal met DPBS voordat de cellen gedurende ongeveer vijf minuten bij 37 graden Celsius werden geïncubeerd met het juiste volume enzymatisch EDTA. Wanneer een enkele celsuspensie is verkregen, verzamel de cellen door centrifugatie en suspendeer de pellet in een geschikt volume stamcelmedium aangevuld met 10 micromolar ROCK-remmer voor het tellen. Verdun de cellen tot een concentratie van 1,56 keer 10 tot de vierde cellen per kubieke centimeter en zaai twee milliliter cellen in individuele putjes van een zes-putjesplaat met platte bodem.Na 24 uur in de cellenkweekincubator vervangt u het supernatant in elke put met E6-medium en zet de plaat terug in de incubator voor nog vier dagen. Om de iPSC-afgeleide BMEC's te zuiveren, bekleedt u de subcultuurplaten met het juiste volume van een vers bereide collageen IV- en fibronectine-oplossing per put en incubeert u de platen gedurende minimaal twee uur bij 37 graden Celsius. Op dag zes van differentiatie verzamelt u de cellen door centrifugatie en suspendeert u de pellets in het juiste volume vers humaan endotheel-serumvrij medium aangevuld met B27, basische fibroblastengroeifactor en retinoïnezuur.Voor TEER-analyse, plaatst u de gedifferentieerde cellen in elke put van een met collageen en fibronectine beklede 12-transwell gefilterde plaat. Voor effluxtransporteractiviteitsanalyse, plaatst u de cellen in elke put van een met collageen en fibronectine beklede 24-putten plaat met platte bodem. Na 24 uur subcultuur, vervangt u het supernatant in elke put met vers humaan endotheel-serumvrij medium aangevuld met alleen B27-supplement.Om de bloed-hersenbarrière-eigenschappen van de BMEC's te meten met behulp van TEER, laadt u het TEER-instrument overnacht en veegt u het instrument en de stokjeselektroden licht af met 70%ethanol voordat u ze in de veiligheidskast plaatst. Schakel het apparaat in en kalibreer de ohmmeter volgens de specificaties van de fabrikant. Sluit de elektroden aan en spoel ze eenmaal met 70%ethanol en eenmaal met DPBS.Plaats het kortere uiteinde van de elektrode in de atypische kamer van de insert en het langere uiteinde in de basolaterale kamer van een lege put. Na het meten van de negatieve controlereaktie, spoelt u de elektroden snel zoals gedemonstreerd en meet u de eerste experimentele put. Nadat alle metingen zijn vastgelegd, spoelt u de stokjeselektroden opnieuw, veegt u de elektroden voorzichtig af en laat u ze drogen in de veiligheidskast.Om de effluxtransporteractiviteit van de cellen te beoordelen, behandelde u op dag acht van het kweken het juiste aantal putten met een oplossing van 10 micromolar effluxtransporterremmer en plaatst u deze een uur in een incubatiekast bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, behandelde u de cellen gedurende een uur in de incubatiekast met een oplossing van 10 micromolar effluxtransportersubstraat. Aan het einde van de incubatie, spoelt u elke put twee keer met 500 microliter DPBS per put voordat u de cellen lyst met 500 microliter DPBS aangevuld met 5%Triton-X per put.Na vijf minuten, gebruikt u een microplaatlezer om de fluorescentie van de gelyste cellen te meten bij een excitatie van 485 nanometer en een emissie van 530 nanometer. Voor putten die niet worden gebruikt in de transportassay, wast u de cellen twee keer met DPBS voordat u ze fixeert met 4%paraformaldehyde per celkernkwantificering. Na één dag kweken in E6-medium is de celmorfologie vergelijkbaar met die van iPSC's.Tegen dag vier zijn de cellen duidelijk te onderscheiden van iPSC's en bedekken ze het grootste deel van de put. Twee dagen kweken in humaan endotheel-serumvrij medium induceert een langwerpige en kasseien-achtige verschijning in de cellen. Op dag acht vormen individuele cellen een grotendeels grote kasseien-achtige patroon.Een ontluikend assay kan worden uitgevoerd om het angiogeen potentieel van iPSC-afgeleide BMEC's te demonstreren. Dit leidt tot de ontwikkeling van buis-achtige structuren na drie dagen behandeling met groeifactoren. De iPSC-afgeleide BMEC's die met dit protocol zijn gegenereerd, co-exprimeerden strakke verbindingseiwitten die tot expressie worden gebracht in endotheelcellen in de hersenen, longen, lever en nieren, evenals vasculaire endotheelmarkers die tot expressie worden gebracht op de bloed-hersenbarrière.Zoals waargenomen, vertonen iPSC-afgeleide BMEC's 48 uur na subculture en mediumverversing TEER-waarden binnen het bereik dat wordt beschreven voor iPSC-afgeleide BMEC's die werden meegekweekt met ratten primaire astrocyten. Effluxtransporteractiviteit werd ook in dit stadium waargenomen. Na cryopreservering zijn de TEER-metingen lager vergeleken met vers afgeleid BMEC's.Western blot-analyse onthult verminderde niveaus van strakke verbindingsmarkers, zoals occludine, terwijl immunocytochemie sprokkelig en/of gerafelde patronen van strakke verbindingseiwitten toont. Een te hoge of te lage iPSC-dichtheid zal de differentiatie-efficiëntie beïnvloeden en de ontwikkeling van geschikte bloed-hersenbarrière-eigenschappen beïnvloeden. Deze methode maakt het mogelijk om de barrière-eigenschappen, cellulaire signalering en transporteractiviteit te onderzoeken met behulp van geïndividualiseerde BMEC's om de fysiologie en pathofysiologie van de bloed-hersenbarrièrefunctie te modelleren.

derivation-expansion-cryopreservation-characterization-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We hebben een protocol voor de inductie van cardioblasts rechtstreeks van pluripotente menselijke embryonale stamcellen gehouden onder bepaalde voorwaarden met kleine moleculen, die afleiding van een groot aanbod van menselijke voorouders hart-en functionele cardiomyocyten voor hart-en reparatie mogelijk maakt.

Efficiënte Afleiding van de Mens Cardiac precursoren en cardiomyocyten uit pluripotente menselijke embryonale stamcellen met op kleine moleculen Inductie

This video demonstrates a protocol to induce the differentiation of induced pluripotent stem cells into brain endothelial cells.

Generating Brain Endothelial Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

This video demonstrates a multi-step process for differentiating human iPSCs into brain microvascular endothelial cells. The resulting differentiated cells closely mimic brain microvascular endothelial cells, characterized by tight junctions, making them ideal for research on brain diseases.

Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Brain Microvascular Endothelial Cells

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een meercellige neurovasculaire eenheid die hersenhomeostase strak regugugaat. Door menselijke iPSCs en organ-on-chip technologieën te combineren, hebben we een gepersonaliseerde BBB-chip gegenereerd, geschikt voor ziektemodellering en CNS-voorspellingen voor medicijndoordring. Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de productie en werking van de BBB-chip.

Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip

Het hier beschreven protocol belicht de belangrijkste stappen in de differentiërende geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenachtige endotheelcellen, de voorbereiding van Neisseria meningitidis voor infectie en het verzamelen van monsters voor andere moleculaire analyses.

Neisseria meningitidis Infectie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide endotheelcellen in de hersenen

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een protocol, de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), die differentiatie van pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC) -achtige cellen mogelijk maakt. Deze cellen vertonen endotheelceladhesiemolecuulexpressie en zijn dus een menselijk bloed-hersenbarrièremodel dat geschikt is om immuuncelinteracties in vitro te bestuderen.

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

Dit protocol presenteert een methode voor het genereren van vasculaire organoïden met behulp van menselijke pluripotente stamcellen.

Vasculaire organoïdegeneratie uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

We presenteren een protocol om een menselijke hersenorganoïde met residente microglia te genereren door geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide hematopoëtische voorlopercellen (HPC's) op te nemen in de ontwikkeling van organoïden.

Afleiding van een organoïde van het menselijk brein met microglia-ontwikkeling

Leer een protocol voor differentiatie, expansie en cryopreservatie van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze methode onderzoekt bloed-hersenbarrière-eigenschappen en functionele integriteit.

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (Video) | JoVE Journal

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Meer video's verkennen