Name: Visualisatie van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer hoe je Pseudomonas aeruginosa en Psl-polysaccharide visualiseert in sputum van patiënten met cystische fibrose. Deze methode onthult de ruimtelijke organisatie van bacteriën en hun effect op antimicrobiële gevoeligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag de Cystic Fibrosis Foundation bedanken die dit onderzoek financierde en MedImmune voor hun genereuze donatie van anti-Psl0096-antilichamen. Voor deze studie werd beeldvorming uitgevoerd in de CAMiLoD-beeldvormingsfaciliteit van de Universiteit van Toronto.

Goedkeuring van de Research Ethics Board (REB) is vereist om sputummonsters van menselijke proefpersonen te verzamelen en op te slaan. De hierin gepresenteerde studies zijn goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB#1000058579.
1. Sputum-collectie
<ol><li>Bewaar slijm in een steriele opvangbeker en bewaar onmiddellijk bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur voorafgaand aan de fixatie. OPMERKING: Als u het sputum te lang op 4 °C laat staan zonder fixatie, kan dit leiden tot cellulaire afbraak, met name afbraak van witte bloedcellen. Zo snel mogelijk fixeren heeft de voorkeur.</li>
	<li>Breng de sputummonsters over in een steriele buis van 15 ml.</li>
	<li>Voeg een gelijk volume van 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan de sputummonsters. Als het sputummonster bijvoorbeeld 0,5 ml is, voeg dan 0,5 ml 4% PFA toe. Meng door zachte inversie.</li>
	<li>Incubeer het sputum een nacht bij 4 °C.</li>
	<li>Was het monster door 5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen aan elke 2 ml vast sputum. NOTITIE: Er is geen centrifugeren nodig voor deze wasstap.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig met een pipet. NOTITIE: Vermijd het opzuigen van het sputum met de pipet door de punt van het sputum af te richten en zeer langzaam de oppervlaktevloeistof op te zuigen. De wasstap omvat geen centrifugeren om de structurele integriteit van de sputumpluggen niet te verstoren.</li>
	<li>Herhaal stap 1.6-1.7 nog twee keer.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 2x het volume PBS met 0,01 % (m/v) natriumazide.</li>
	<li>Bewaar het sputum bij 4 °C.</li>
</ol>2. MiPACT (tissue clearing technique) verwerking van sputum
<ol><li>Ontgas de hydrogelcomponenten (30% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide, verharder en PBS) in een afgesloten container met een anaërobe verpakking voorafgaand gedurende 72 uur. NOTITIE: De anaërobe verpakking en de verzegelde container zijn nodig omdat zuurstof de polymerisatie van acrylamide remt. Als alternatief kan zuurstof worden verwijderd door deze stap uit te voeren in een anaërobe kap, door een vacuüm toe te passen op een afgesloten container of doorN2-gas door het acrylamidemengsel te laten borrelen.<ol><li>Voeg 2 ml van een 30% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide-oplossing toe aan een tube van 15 ml met de dop eraf in de afgesloten anaërobe container.</li>
		<li>Maak een geconcentreerde bouillon van 10% (m/v) verharder door 0,5 g verharder toe te voegen aan 5 ml PBS in een tube van 15 ml. Laat de dop van de tube en bewaar in de afgesloten anaërobe container.</li>
		<li>Laat een paar ml steriele PBS in een buisje, met de dop eraf, in de anaërobe container.</li>
	</ol></li>
	<li>Maak 5 ml hydrogeloplossing met een eindconcentratie van 0,2% verharder en 4% 29:1 acrylamide:bis-acrylamide in PBS in een tube van 15 ml. Meng door inversie en filter steriliseren.</li>
	<li>Haal sputummonsters uit de koelkast en snijd ze vervolgens onder steriele omstandigheden met een scalpel in kleine secties (ongeveer 5 mm in diameter). OPMERKING: Als het sputum vrij vloeibaar is, kan deze stap nog steeds worden uitgevoerd, maar het vergt meer geduld en oefening om het sputum met een pincet uit de bewaaroplossing te verwijderen voordat u het scalpel gebruikt om de gewenste fracties te scheiden.</li>
	<li>Plaats de gesneden sputummonsters in een putje van een dekglaasje met 8 kamers.</li>
	<li>Voeg 300 μL filter gesteriliseerde hydrogeloplossing uit stap 2.2 toe aan elk van de putjes die sputum bevatten.</li>
	<li>Plaats het afdekglas met 8 kamers gedurende 3 uur bij 37 °C in een afgesloten container met een anaërobe verpakking. OPMERKING: Eenmaal gepolymeriseerd, moet de hydrogel met ingebed sputum de consistentie van stevige gel hebben.</li>
	<li>Breng de gestolde hydrogel-sputummonsters over in een kweekbuis van 15 ml met 5 ml 8% natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8, en laat de monsters 3-14 dagen klaren bij 37 °C (met of zonder schudden), totdat het sputum transparant wordt. OPMERKING: De opruimingstijden zijn afhankelijk van de samenstelling van het sputum en kunnen over het algemeen worden verkort door te schudden. Zorg er echter voor dat u de schudsnelheid niet zodanig verhoogt dat de integriteit van het monster wordt verstoord. Meer DNA-rijke monsters hebben meer tijd nodig om te wissen in vergelijking met slijmrijke monsters.</li>
	<li>Doe de 8% SDS-oplossing in een afvalcontainer. Breng met een steriel pincet elk in hydrogel ingebed monster over in een steriele conische buis van 50 ml. Voeg 10 ml PBS toe aan elk van de conische buizen van 50 ml om de hydrogels te wassen en laat de oplossing 30 minuten tot 1 uur intrekken voordat u het decanteert. Herhaal dit nog 2x meer. NOTITIE: Bij deze wasstap wordt niet gecentrifugeerd. Overtollig vocht en supernatans worden voorzichtig verwijderd met een pipet.</li>
	<li>Bewaar gewassen monsters in PBS met 0,01% (m/v) natriumazide en 1x RNaseremmer bij 4 °C.</li>
</ol>3. Hydrogel fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) protocol
<ol><li>Haal de hydrogelmonsters met een steriel pincet uit hun bewaaroplossing en plaats de monsters op een steriel oppervlak (zoals een glasplaatje of petrischaal).</li>
	<li>Snijd de hydrogels met een steriel scalpel in plakjes van ~ 1 mm dik.</li>
	<li>Plaats de stukjes hydrogel van 1 mm in steriele buisjes van 1,5 ml.</li>
	<li>Bereid 1 ml de hybridisatiebuffer (25% formamide, 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,01% SDS, gezuiverd en gedeïoniseerd H2O) in een buisje van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg de fluorescerend gelabelde PseaerA-sonde (150,7 nM12) toe aan de hybridisatiebuffer en meng door inversie. NOTITIE: Formaline-oplossing moet uit de buurt van open vuur worden gehouden. De hybridisatiebuffer kan vooraf worden bereid en in aliquots bij -20 °C13 worden opgeslagen.</li>
	<li>Voeg 200-500 μL hybridisatiebuffer toe aan elk stuk hydrogel van ~1 mm en zorg ervoor dat het hele hydrogelmonster wordt ondergedompeld.</li>
	<li>Laat de PseaerA-sonde hybridiseren met de hydrogelmonsters door ze ~ 18-24 uur in het donker te plaatsen, bij 46 °C, zonder te schudden.</li>
	<li>Decanteer de hybridisatiebuffer in een afvalcontainer.</li>
	<li>Spoel de monsters eenmaal af met een gesteriliseerde wasbuffer met filter (337,5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) [pH 7,2], 0,01% SDS en gezuiverde en gedeïoniseerde H2O) door 1 ml wasbuffer toe te voegen aan elk van de 1,5 ml buizen en deze vervolgens te verwijderen. NOTITIE: De wasbuffer kan van tevoren worden gemaakt en bij kamertemperatuur (RT) worden bewaard.</li>
	<li>Voeg 1 ml verse wasbuffer toe aan de buizen en incubeer de monsters vervolgens gedurende 6 uur in het donker bij 48 °C, zonder te schudden.</li>
</ol>4. Hydrogel en Psl0096-antilichaambinding
<ol><li>Verwijder de wasbuffer steriel met een pipettor van 1 ml.</li>
	<li>Spoel de monsters met een 2% BSA (w/v) in PBS-oplossing door 1 ml van de 2% BSA-oplossing toe te voegen en te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 500 μL van de 2% BSA/PBS-oplossing toe aan de hydrogelmonsters om niet-specifieke eiwitbinding te blokkeren. Incubeer de monsters vervolgens 's nachts, in het donker, bij RT, zonder te schudden.</li>
	<li>Verwijder de blokkerende oplossing steriel met behulp van een pipet van 1 ml.</li>
	<li>Bereid de Psl0096-Texas Red-antilichaamoplossing voor door het antilichaam te verdunnen tot een eindconcentratie van 0,112 μg/ml in 500 μL verse 2% BSA/PBS.</li>
	<li>Voeg de 500 μL antilichaamoplossing toe aan de hydrogelmonsters en incubeer ze gedurende 6 uur bij RT, beschermd tegen licht, zonder te schudden.</li>
</ol>5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-fenylindol) kleuring
<ol><li>Bereid de brekingsindex-matchingoplossing (RIMS) door 40 g niet-ionisch dichtheidsgradiëntmedium, 30 μl Tween20, 3 μg natriumazide en 30 ml PBS toe te voegen aan een kolf met een magnetische roerstaaf. Roer de oplossing gedurende 15 minuten op een magnetische roerder, of tot het volledig is opgelost.</li>
	<li>Filter steriliseer de oplossing in een conische buis van 50 ml met behulp van een spuit van 10 ml en een steriel filter van 0,2 μm. OPMERKING: De oplossing kan enkele maanden bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Verwijder de Psl0096-Texas Red-antilichaamoplossing met een steriele pipet van 1 ml.</li>
	<li>Spoel de hydrogelmonsters af door 1 ml PBS toe te voegen en vervolgens te verwijderen.</li>
	<li>Incubeer de hydrogelmonsters met 250 μL RIMS-oplossing en 10 μg/ml DAPI bij RT met zacht schudden, in het donker, gedurende een nacht.</li>
	<li>Voorafgaand aan confocale beeldvorming monteert u de monsters op perfusiekamers van 0,9 mm of 1,7 mm en sluit u ze af met een glazen dekglaasje. OPMERKING: Na FISH en/of immunohistochemie en vóór onderdompeling in RIMS kunnen fluorescerende lectinekleuringen worden aangebracht als visualisatie van sputumslijm gewenst is12.</li>
</ol>6. Beeldvorming
<ol><li>Voer confocale laserscanmicroscopiebeeldvorming uit met behulp van standaardtechnieken bij vergrotingen van 25x, 40x, 63x of 100x.</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis%3A+What+drug+and+which+way%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li>
<li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis%3A+Pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li>
<li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913(2019).</li>
<li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526(2013).</li>
<li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides%2C+alginate%2C+Pel%2C+and+Psl%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167(2011).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li>
<li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding%2C+clearing%2C+and+rRNA+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li>
<li>Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.molecularinstruments.com">www.molecularinstruments.com</a> 1-6 (2019).</li>
<li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+processing+time+and+storage+of+sputum+influence+quantitative+bacteriology+in+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis.</a> Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).</li>
<li>Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum%3A+Time+from+expectoration+to+processing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum: Time from expectoration to processing.</a> European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).</li>
<li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li>
<li>St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+fixation+methods+of+induced+sputum+specimens%3A+An+immunocytochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).</li>
<li>Hogardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+rapid+detection+by+fluorescent+situ+hybridization+of+bacteria+in+clinical+samples+obtained+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).</li>
<li>Hoffmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Novel+mouse+model+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+mimicking+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis.</a> Infection and Immunity. 73 (8), 5290(2005).</li>
<li>Nair, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+Gram+staining+for+evaluation+of+the+quality+of+cystic+fibrosis+sputum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).</li>
<li>Howlin, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Dose+Nitric+Oxide+as+Targeted+Anti-biofilm+Adjunctive+Therapy+to+Treat+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).</li>
<li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234(2019).</li>
</ol>

Het doel van dit protocol is om een glimp op te vangen van de in-situ organisatie van P. aeruginosa-cellen in sputum van CF-patiënten. Sputummonsters moeten bij 4 °C worden bewaard totdat ze worden verwerkt als ze niet onmiddellijk kunnen worden gefixeerd. Het is aangetoond dat het aantal P. aeruginosa-cellen in sputum niet significant verandert als het wordt verwerkt om 1 uur, 24 uur of 48 uur, wanneer het wordt bewaard bij 4 °C, hoewel het aantal bacteriële cellen aanzienlijk zal toenemen als het gedu...

In deze studie werden experimenten ontworpen om de in vivo structuur van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van pediatrische cystische fibrose (CF) patiënten te visualiseren. P. aeruginosa-infecties worden chronisch bij 30-40% van de pediatrische CF-populatie; Als chronische infecties eenmaal zijn vastgesteld, zijn ze bijna onmogelijk te elimineren1. P. aeruginosa-isolaten van patiënten met een vroege infectie zijn over het algemeen vatbaarder voor antimicrobiële stoffen, daarom worden deze behandeld met antipseudomonale antibiotica om het ontstaan van chronische infectie tevoorkomen2. Helaas worden niet alle P. aeruginosa-isolaten effectief uit de longen verwijderd na antibioticatherapie. De precieze mechanismen die verband houden met antibioticafalen zijn niet volledig opgehelderd. Eerdere studies hebben aangetoond dat variaties in de dichtheid, aggregatie en productie van polysachariden van biofilmcellen de werkzaamheid van antibiotica kunnen beïnvloeden3. P. aeruginosa produceert drie extracellulaire polysachariden: Pel, Psl en alginaat4. De meeste stammen van P. aeruginosa hebben de genetische capaciteit om elk van de exopolysachariden tot expressie te brengen, hoewel vaak één type polysacharide overwegend tot expressie wordt gebracht5. Het exopolysacharide alginaat wordt in verband gebracht met chronische infecties in de CF-long, wat resulteert in een mucoïde fenotype 6,7. De polysachariden Pel en Psl hebben meerdere functies, waaronder het helpen bij de initiële hechting en het behoud van de biofilmstructuur, en het verlenen van antibioticaresistentie8.
Methoden gericht op het visualiseren van in vivo structuren van weefsels zijn ontwikkeld voor een verscheidenheid aan monstertypes 9,10,11. Meer recentelijk zijn ze op maat gemaakt om in vivo microbiële gemeenschappen in sputum van CF-patiënten te visualiseren12. De optimalisatie van een weefselopruimingsprotocol specifiek voor de identificatie van microbiële gemeenschappen in sputum is ontwikkeld door DePas et al., 201612. De term MiPACT, wat staat voor microbial identification after Passive CLARITY technique, werd bedacht voor het opruimen van CF-sputum11,12. Voor weefselopruimingstechnieken worden de monsters eerst gefixeerd en vervolgens transparant gemaakt, terwijl hun inherente architectuur intact blijft voor kleuring en microscopische visualisatie11. Door CF-sputummonsters te fixeren en op te ruimen, kunnen onderzoekers vragen beantwoorden met betrekking tot biofilmstructuur, bacteriële celdichtheid, polymicrobiële associaties en associaties tussen ziekteverwekkers en gastheercellen. Het voordeel van het direct onderzoeken van bacteriën die in het sputum bewaard zijn gebleven, is dat ze kunnen worden geanalyseerd en gevisualiseerd in een gastheerspecifieke context. Hoewel in vitro groei van klinische isolaten in het laboratorium voor experimenten zeer informatief kan zijn, zijn dergelijke methoden niet in staat om de CF-longomgeving volledig na te bootsen, wat resulteert in een discrepantie tussen laboratoriumresultaten en patiëntresultaten.
De hier gepresenteerde methoden kunnen worden gebruikt om sputum te fixeren en te verwijderen om bacteriën te visualiseren, of het nu gaat om CF-patiënten of patiënten met andere luchtweginfecties. Het specifieke type kleuring en microscopische analyse dat hierin wordt beschreven, is fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), gevolgd door anti-Psl-antilichaambinding in de hydrogel en daaropvolgende analyse via confocale laserscanningmicroscopie (CLSM). Na weefselopruiming kunnen ook andere immunohistochemie en microscopiemethoden worden toegepast.

<table><tbody><tr><td>29:1 acrylamide bisacrylamide, 30 % solution</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>Coverwell perfusion chambers</td><td>Electron Microscopry Sciences</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>Besteldetails: Product: Gemodificeerd DNA Oligo; Naam: PseaerA; Volgorde: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthese: 50 nmol; Zuivering: HPLC; Verzendtoestand: Volledige opbrengst (droog)</td></tr><tr><td>Psl0096-Texas Red</td><td>Medimmune</td><td></td><td>De Psl0096-Texas red antilichamen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Medimmune en het bedrijf dient te worden gecontacteerd voor bestellingen.</td></tr><tr><td>VA-044 Hardener</td><td>Wako</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Vroege opsporing en uitroeiing van Pseudomonas aeruginosa in de longen van patiënten met cystische fibrose kan de kans op het ontwikkelen van een chronische infectie verminderen. De ontwikkeling van chronische P. aeruginosa-infecties gaat gepaard met een afname van de longfunctie en verhoogde morbiditeit. Daarom is er een groot belang bij het ophelderen van de redenen voor het niet uitroeien van P. aeruginosa met antibiotische therapie, die voorkomt bij ongeveer 10-40% van de pediatrische patiënten. Een van de vele factoren die van invloed kunnen zijn op de klaring van P. aeruginosa door de gastheer en de gevoeligheid voor antibiotica, zijn variaties in ruimtelijke organisatie (zoals aggregatie of biofilmvorming) en polysaccharideproductie. Daarom waren we geïnteresseerd in het visualiseren van de in situ kenmerken van P. aeruginosa in het sputum van CF-patiënten. Een weefselopruimingstechniek werd toegepast op sputummonsters na het inbedden van de monsters in een hydrogelmatrix om de 3D-structuren ten opzichte van gastheercellen te behouden. Na het opruimen van het weefsel werden fluorescerende labels en kleurstoffen toegevoegd om visualisatie mogelijk te maken. Fluorescentie in situ hybridisatie werd uitgevoerd voor de visualisatie van bacteriële cellen, binding van fluorescerend gelabelde anti-Psl-antilichamen voor de visualisatie van het exopolysaccharide en DAPI-kleuring om gastheercellen te kleuren om structureel inzicht te verkrijgen. Deze methoden maakten het mogelijk om P. aeruginosa met hoge resolutie in het sputum van CF-patiënten te impliceren via confocale laserscanmicroscopie.

De algemene opzet van het experiment is samengevat in figuur 1 en figuur 2. Figuur 1 geeft een samenvatting van de protocollen voor sputumverwerking en sputumzuivering. Het verwerken en opruimen van sputum kan tot 17 dagen duren. Het protocol kan echter worden gestopt en monsters kunnen worden bewaard na fixatie met PFA (dag 2) of na weefselopruiming (dag 5-17, afhankelijk van de opruimtijd). In figuur 2</strong...

Dit protocol biedt methoden voor visualisatie van bacteriële cellen en polysaccharidesyntheselocus (Psl) polysaccharide in het sputum van cystische fibrosepatiënten.

Visualisatie van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Dit protocol is belangrijk omdat het de directe visualisatie van Pseudomonas aeruginosa en het exopolysacharide Psl binnen sputum van cystische fibrose mogelijk maakt. Deze techniek helpt om vragen te beantwoorden over hoe de ruimtelijke organisatie van P.aeruginosa zoals aggregatie of biofilms de hostclearance en de gevoeligheid voor antibiotica beïnvloedt. Bewaar het opgehoest sputum in een steriele opvangbeker bij vier graden Celsius gedurende maximaal 24 uur voorafgaand aan fixatie.Wanneer u klaar bent om de monsters te fixeren, brengt u ze over naar een steriele 15 milliliter buis en voegt u een gelijk volume van 4% PFA toe, en incubeert u het sputum een nacht bij vier graden Celsius. Was de monsters door vijf milliliter PBS toe te voegen voor elke twee milliliter gefixeerd sputum. Verwijder voorzichtig het supernatant met een pipet en herhaal de wassing nog twee keer.Resuspendeer de pellet in tweemaal het volume PBS met 0,01% natriumazid en bewaar het bij vier graden Celsius. Voeg twee milliliter van een 30%29 toe aan een acrylamide/bisacrylamide oplossing in een drie milliliter buis met het deksel eraf in een verzegelde anaërobe container, voeg vervolgens 0,5 gram verharder toe aan twee milliliter PBS in een drie milliliter buis. Laat het deksel van de buis eraf en bewaar het in de verzegelde anaërobe container.Laat een paar milliliter steriele PBS in de buis met het deksel eraf in de anaërobe container. Ontgast de hydrogelcomponenten in de verzegelde container met een anaërobe pakket gedurende 72 uur. Maak een 2,5 milliliter oplossing van hydrogel met een eindconcentratie van 0,2% verharder en 4% acrylamide/bisacrylamide in PBS in een 15 milliliter buis en meng de hydrogel door middel van inversie, vervolgens filter steriliseer de oplossing.Snijd de sputummonsters in twee kleine secties met een scalpel en plaats vervolgens elk monster in een putje van een glazen plaat met acht kamers. Voeg 300 microliter van de gefilterde hydrogeloplossing toe aan elke put die sputum bevat en plaats het in een verzegelde container met een anaërobe pakket gedurende drie uur bij 37 graden Celsius. Breng de verharde hydrogel sputummonsters over naar een 15 milliliter kweekbuis met vijf milliliter van 8% SDS bij pH acht en laat de monsters drie tot 14 dagen bij 37 graden Celsius klaren totdat het sputum transparant wordt.Gebruik steriele pincetten om elk hydrogel ingebed monster over te brengen naar een 50 milliliter conische buis en voeg 10 milliliter PBS toe om het hydrogel te wassen. Laat de oplossing 30 tot 60 minuten staan voordat u decanteerd, en herhaal de wassing nog twee keer. Bewaar de gewassen monsters in PBS met 0,01% natriumazid en RNase remmer bij vier graden Celsius.Verwijder de hydrogelmonsters uit hun opslagoplossing en plaats de monsters op een steriele oppervlakte. Gebruik een steriele scalpel om de hydrogels in ongeveer een millimeter dikke plakken te snijden en plaats de secties in 1,5 milliliter buisjes. Bereid een milliliter hybridisatiebuffer in een 1,5 milliliter buisje voor, voeg vervolgens de fluorescent gelabelde Seer A-probe toe en meng door middel van inversie.Voeg 200 tot 500 microliter hybridisatiebuffer toe aan elke sectie, zorg ervoor dat de gehele hydrogelmonster ondergedompeld is. Laat de Seer A-probe hybridiseren met de hydrogelmonsters door ze ongeveer 18 tot 24 uur in het donker te plaatsen bij 46 graden Celsius zonder te schudden, voeg vervolgens een milliliter verse wasbuffer toe aan de buisjes en incubeer ze in het donker gedurende zes uur bij 48 graden Celsius. Voeg 500 microliter van de 2% BSA en PBS toe aan de hydrogelmonsters om niet-specifieke eiwitbinding te blokkeren, en incubeer de monsters een nacht in het donker.De volgende dag bereidt u de Psl0096-Texas Red antilichaamoplossing voor door het antilichaam te verdunnen tot een eindconcentratie van 0,112 microgram per milliliter in 500 microliter verse 2% BSA in PBS. Voeg de antilichaamoplossing toe aan de hydrogelmonsters en incubeer ze in het donker gedurende zes uur. Vervolgens kleurt u de hydrogelmonsters met DAPI door ze te incuberen met 250 microliter RIMs oplossing en 10 microgram per milliliter DAPI gedurende een nacht in het donker met zacht schudden.Na het kleuren monteert u de monsters op 0,9 of 1,7 millimeter perfusiekamers en verzegelt u ze met een glazen dekglas. Voer confocale laserscanningmicroscopie uit met 25, 40, 63 of 100 keer vergroting. Dit protocol werd gebruikt om de hoge resolutie 3D beelden van P.aeruginosa cellen en hun NC2 structuur binnen sputum te verkrijgen.Een aggregaat van cellen binnen een sputummonster wordt hier getoond. Individuele staafvormige vormen werden gezien in groen door de soortspecifieke binding van de Seer A-488 sonde aan P.aeruginosa cellen. Het Psl0096-Texas Red antilichaam toont aan dat het Pseudomonal exopolysacharide binnen het sputum grotendeels overlapte met de P.aeruginosa cellen.Deze methode werd ook gebruikt voor de visualisatie van Pseudomonal cellen binnen het sputum in relatie tot andere bacteriële cellen en gastheerstructuren. Een cluster van P.aeruginosa cellen werd gezien te fagocyteren binnen een eukaryotische cel terwijl andere kleine coccal celclusters in de omgeving werden waargenomen. Het werd ook aangetoond dat het PSL 0096 antilichaam zich kon binden aan PSL geproduceerd door planktonische P.Aeruginosa.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een weefselklaringbenadering implementeert gevolgd door fluorescente in situ hybridisatie, antilichaamkleuring en confocale microscopie. Dit stelt onderzoekers in staat om te visualiseren en beeldverwerkingstechnieken te gebruiken om kwantitatieve verschillen in P.aeruginosa kolonisatiestructuren binnen CF sputum in relatie tot gezondheidsuitkomsten van patiënten te meten.

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De huidige diagnostische antimicrobiële gevoeligheid testen is gebaseerd op de groei van plankton isolaten in voedselrijk, aërobe omstandigheden. Hier maken we gebruik van een alternatieve kunstmatige sputum medium om antimicrobiële gevoeligheid van Pseudomonas aeruginosa biofilms te bestuderen onder zowel aërobe en Microaërofiele voorwaarden meer representatief zijn voor de cystic fibrosis long.

Het gebruik van kunstmatige Sputum Middelgrote tot antibiotica werkzaamheid te testen tegen<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In Voorwaarden relevanter voor de Cystic Fibrosis Lung

Source: Beaudoin, T., et al. Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates an in vitro method to assess how patient-derived cystic fibrosis sputum influences bacterial biofilm formation. Using chamber slides, fluorescent staining, and confocal microscopy, it reveals increased thickness, altered architecture, and higher viable biomass in biofilms grown with sputum, highlighting the role of host components...

Confocal Imaging of Bacterial Biofilms Induced by Sputum Filtrates from Cystic Fibrosis Patients

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

We beschrijven de agar-kralen methode om hardnekkige langdurige chronische Pseudomonas aeruginosa luchtweginfectie te vestigen in het muismodel.

Long Term Chronische<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Luchtweginfectie in Muizen

Dit protocol beschrijft de visualisatie van de ontwikkeling van biofilms na blootstelling aan gastfactoren met behulp van een glijkamermodel. Dit model maakt directe visualisatie van de ontwikkeling van biofilms mogelijk, evenals analyse van biofilmparameters met behulp van computersoftwareprogramma's.

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

We beschrijven een protocol voor een driedimensionaal co-cultuurmodel van geïnfecteerde luchtwegen, met CFBE41o- cellen, THP-1 macrofagen en Pseudomonas aeruginosa, gevestigd op de lucht-vloeibare interface. Dit model biedt een nieuw platform om tegelijkertijd de werkzaamheid van antibiotica, epitheelbarrièrefunctie en ontstekingsmarkers te testen.

P. aeruginosa Geïnfecteerde 3D Co-Cultuur van Bronchiale epitheelcellen en macrofagen bij Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

Deze workflow kan worden gebruikt om antibiotica gevoeligheidstests uit te voeren met behulp van een vastgesteld ex vivo model van bacteriële biofilm in de longen van personen met cystische fibrose. Het gebruik van dit model kan de klinische validiteit van MBEC-test (minimale biofilmuitroeiingsconcentratie) verbeteren.

Antibioticum werkzaamheid testen in een Ex vivo model van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Biofilms in de Cystic Fibrosis Lung

Synthetisch cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) kan worden gebruikt in combinatie met zowel confocale laserscanmicroscopie als fluorescentie-geactiveerde celsortering om bacteriële aggregaten met hoge resolutie te observeren. Dit artikel beschrijft methoden om geaggregeerde populaties te beoordelen tijdens antimicrobiële behandeling als een platform voor toekomstige studies.

Tools voor de real-time beoordeling van een Pseudomonas aeruginosa-infectiemodel

Het protocol hier demonstreert een snelle en gestandaardiseerde workflow voor microbiologische snelle evaluatie ter plaatse (M-ROSE), inclusief drie stappen: het maken van dia's, kleuring en interpretatie. Dit protocol helpt artsen om snel klinische beslissingen te nemen.

Microbiologische snelle evaluatie ter plaatse voor pulmonale infectieziekten

Dit protocol beschrijft een cystic fibrosis (CF) longrelevant vier-species polymicrobieel biofilmmodel dat kan worden gebruikt om de impact van bacteriële interacties tussen soorten te onderzoeken.

Het kweken van een cystische fibrose-relevante polymicrobiële biofilm om fenotypes van de gemeenschap te onderzoeken

Deze methodologie maakt het mogelijk om een polymicrobieel biofilmmodel in cystische fibrose op te zetten voor antimicrobiële gevoeligheidstesten in onderzoeks- en klinische laboratoria. Dit model biedt nauwkeurige en betrouwbare resultaten over een reeks outputs.

Ontwikkeling van een biofilmmodel voor polymicrobiële kolonies om antimicrobiële middelen bij cystische fibrose te testen

Leer hoe je Pseudomonas aeruginosa en Psl-polysaccharide visualiseert in sputum van patiënten met cystische fibrose. Deze methode onthult de ruimtelijke organisatie van bacteriën en hun effect op antimicrobiële gevoeligheid.

Visualisatie van Pseudomonas aeruginosa in het sputum van patiënten met cystische fibrose

Meer video's verkennen