Name: GM-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer een GM-vrije methode om neuronale cellen te genereren uit perifeer bloed zonder genetische modificatie. Deze techniek maakt veilige autologe stamcellen voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Opgedragen aan de nagedachtenis van Dr. Rainer Saffrich.
De auteurs zijn josé Manuel García-Verdugo en Vicente Herranz-Pérez bijzonder dankbaar voor het uitvoeren van EM-experimenten en -analyses in het Laboratorium voor Vergelijkende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Universiteit van Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanje, dat werd ondersteund door onderzoeksfinanciering van de Prometeo Grant for Excellence Onderzoeksgroepen PROMETEO/2019/075. De rest van dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.

Ethische goedkeuringen werden verkregen bij het uitvoeren van de experimenten.
1. Isolatie van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMNCs)
<ol><li>Zorg ervoor dat alle donoren geïnformeerde toestemming hebben ondertekend voordat het bloed zich terugtrok in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.</li>
	<li>Neem 30 ml bloed van gezonde donoren door opgeleid medisch personeel volgens het standaardprotocol.</li>
	<li>Isoleer PBMNCs op dichtheidsgradiëntmedia. Gebruik 10 ml media met 25 ml 1:1 bloed verdund met fosfaatbufferoplossing (PBS) en centrifugeer gedurende 30 minuten op 300 x g.</li>
	<li>Isoleer de interfaselaag tussen het plasma en de dichtheidsgradiëntmedia door pipetten. Was de geïsoleerde cellen met 5 ml steriel PBS en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g. Herhaal dit tweemaal.</li>
	<li>Tel het aantal cellen met standaardmethoden met behulp van een telkamer.</li>
</ol>2. Activering van humaan GPI-verankerd glycoproteïne door kruiskoppeling van antilichamen op het oppervlak van PBMNCs
<ol><li>Plaats de 6 x 106 mononucleaire cellen (MNC's) in buizen van 15 ml en voer kruiskoppeling van antilichamen uit door de cellen gedurende 30 minuten te incuberen met humaan GPI-gebonden membraaneiwitspecifiek antilichaam (30 μg/ml) in PBS met 1% runderserumalbumine (BSA) bij 37 °C.</li>
	<li>Vervang incubatiemedium door Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS).</li>
	<li>Kweek cellen in polystyreenbuizen van 15 ml, plaats de buizen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 8-10 dagen (zonder schudden). Voeg op D5 een extra 1-2 ml iscove's medium aangevuld met 10% FBS toe aan elke buis van 15 ml.</li>
</ol>3. Sorteren van nieuw gegenereerde gedifferentieerde cellen
<ol><li>Tel cellen met een geautomatiseerde celteller (18 μL celsuspensie + 2 μL fluorescentiekleurstof) of in een telkamer.</li>
	<li>Centrifugeer gekweekte celsuspensie (5-7 x10 6) bij 300 x g gedurende 10 minuten en aspireer het resulterende supernatant met een steriele Pasteur pipet.</li>
	<li>Hang de celkorrel opnieuw op in 90 μL voorgekoelde PBS pH 7,2, 0,5% BSA en 2 mM EDTA.</li>
	<li>Voeg CD45 positieve nanogrote magnetische kralen (80 μL) toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.</li>
	<li>Was de cellen door 2 ml PBS-buffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 10 minuten op 300 x g.</li>
	<li>Sgroeper de cellen opnieuw in 500 μL PBS-buffer.</li>
	<li>Was de kolom met 500 μL voorgekoelde PBS-buffer en plaats deze in het magnetisch veld.</li>
	<li>Plaats de celsuspensie op de kolom en was deze met 500 μL PBS-buffer (twee keer) en de centrifugestroom met CD45-negatieve cellen. Verzamel ze in het medium van Iscove aangevuld met 1% BSA.</li>
	<li>Tel de cellen in de telkamer.</li>
</ol>4. Celkweekgerechten voorbereiden voor neuronale differentiatie van nieuw gegenereerde stamcellen
<ol><li>Bedek de kweekvaten met poly-L-ornithine en lag voor het kweken van neuronale cellen.</li>
	<li>Plaats de glasafdekkingslips in 4-putplaten en bekleed deze met 1:5 verdunde poly-L-ornithine (0,1 mg/ml in ddH2O) in ddH2O. Plaats de afdeklips gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Was vervolgens met ddH2O.</li>
	<li>Ontdooi langzaam lag (0,5-2,0 mg/ml) en voeg toe aan de bovenkant van de afdeklips. Incubeer het bij 37 °C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Bereid neurale inductiemedium N2 voor bestaande uit 49 ml D-MEM/F12, 500 μL N2-supplement, 400 μL niet-essentiële aminozuren (NEAA), basisch FGF-oplossing bij 20 ng/ml eindconcentratie (bereid uit 100 μg/ml stamoplossing) en heparine bij 2 ng/ml eindconcentratie.</li>
	<li>Verwijder overtollige lag door pipetten en voeg neuronaal medium N2 toe aan kweekgerechten.</li>
</ol>5. Cultivering van neuronale gedifferentieerde bloedcellen
<ol><li>Kweek BD-afgeleide CD45 negatieve cellen op laminine/ornithine-gecoate glasafdekkingslips gedurende 2 dagen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 in N2-medium om een neuronale differentiatie van nieuw BD-gegenereerde cellen te initiëren.</li>
	<li>Kweekcellen verder in neuronaal differentiatiemedium bestaande uit 48 ml neurobasaal medium, 500 μL L-glutamine, 1 ml B27-supplement, 500 μL NEAA, 50 μL recombinante menselijke glial-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) bij 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA, en 50 μL recombinante humane hersen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL van recombinante humane hersenafwisselingsfactor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniët (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefinale neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniëtum neurotrofe factor (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefinie (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 μL recombinante humane hersendefiniëtatie (BDNF) bij 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA en 50 Plaats platen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
</ol>6. Immunofluorescentiemicroscopieanalyse van bloedafname neurale cellen
<ol><li>Kweek de cellen zoals hierboven beschreven gedurende 16 dagen en verwijder de media.<ol>
<li>Incubeer met voorverwarmd fixatief bestaande uit 75 ml steriel water, 4 g paraformaldehyde. Voeg indien nodig 10 N NaOH toe en roer tot de oplossing op is. Voeg vervolgens 10 ml 10x PBS, 0,5 ml MgCl2, 2 ml 0,5 m EGTA en 4 g sacharose toe. Titreer tot pH 7,4 met 6 N HCl en breng tot 100 ml steriel water gedurende 15 minuten, volgens Marchenko et al.7.</li>
		<li>Gooi het fixatief weg en was de cellen elke keer 3 keer gedurende 5 minuten. Voeg onmiddellijk een vers gemaakte 0,3% Triton X-oplossing toe en permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten. Was 3 keer met PBS en voeg een blokkeeroplossing van PBS en 5% BSA toe.</li>
		<li>Blokkeer de cellen bij kamertemperatuur op een schommelplaat gedurende 1 uur.</li>
		<li>Bereid de juiste verdunning van antilichamen voor in 1% BSA/PBS en incubeer de cellen met antilichaamverdunningen op de tuimelplaat gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen 3 keer met PBS gedurende elk 5 minuten, incubeer de cellen met DAPI en monteer de afdeklips met montagemedia voor visualisatie op een microscoop. OPMERKING: Direct gelabelde antilichamen die in dit experiment worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Transmissie elektronenmicroscopie analyse van nieuw gegenereerde cellen
<ol><li>Zaai de cellen voor TEM in 8-well chamber slides.</li>
	<li>Bevestig de cellen in 3,5% glutaraldehyde gedurende 1 uur bij 37 °C, postfixeer in 2% OsO4 gedurende een extra uur bij kamertemperatuur en bevlek in 2% uranylacetaat in het donker bij 4 °C gedurende 2 uur en 30 min.</li>
	<li>Spoel ten slotte de cellen af in gedestilleerd water, dehydrateer het in ethanol en sluit het 's nachts in epoxyhars in. Breng de volgende dag de monsters gedurende 72 uur over in een oven van 70 °C voor harsverharding.</li>
	<li>Maak de ingebedde celculturen los van kamerschuif en lijm tot aralditeblokken.</li>
	<li>Snijd seriële halfdunne secties (1,5 μm) met een machine, monteer op glasglijbanen en bevlek licht met 1% toluidineblauw.</li>
	<li>Lijm geselecteerde halfdunne secties op araldite blokken en maak ze los van de glazen schuif door herhaaldelijk in te vriezen (in vloeibare stikstof) en te ontdooien.</li>
	<li>Bereid ultraduinesecties (0,06-0,08 μm) voor met een machine en contrasteer verder met loodcitraat.</li>
	<li>Verkrijg micrografen met behulp van elektronenscanmicroscoop met digitale camera.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glial%22%5BJournal%5D)">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li>
<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

De corresponderende auteur verklaart dat ze octrooihouder is met betrekking tot Novel Human GPI-linked Protein en ze is medeoprichter en werkt voor ACA CELL Biotech. De andere auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.

De niet-GM-methode voor het herprogrammeren van menselijke cellen die in dit werk wordt beschreven, is gebaseerd op membraan-naar-kernactivering van signaleringsmachines achter het GPI-gebonden menselijke membraanglycoproteïne dat het proces van dedifferentiatie initieert dat leidt tot de ex vivo generatie en uitbreiding van zelfvernieuwende PSC's verkregen uit niet-gemanipuleerd menselijk perifeer bloed. Deze cellen kunnen, wanneer ze in geschikte media worden gekweekt, opnieuw differentiëren in cellen die tot ...

De ontwikkeling van basis- en preklinische stamcelonderzoeksmethoden stimuleert de klinische toepassing van stamcelgebaseerde therapieën voor neurologische ziekten. Een dergelijke potentiële therapie hangt kritisch af van de methode voor het genereren van menselijke neurale cellen die leidt tot functioneel herstel1.
Neurale stamcellen (NSC's) vernieuwen zichzelf en differentiëren zich gedurende het hele leven in nieuwe neuronen in een proces dat volwassen neurogenese wordt genoemd. Alleen zeer beperkte hersengebieden herbergen NSC's die bevoegd zijn om pasgeboren neuronen op volwassen leeftijd te genereren. Dergelijke NSC's kunnen aanleiding geven tot volwassen neuronen, die betrokken zijn bij leren en geheugen, waardoor verloren of beschadigde neuronen worden vervangen. Helaas zijn deze NSC's in beperkte hoeveelheden aanwezig en neemt deze beperkte neurogenese snel af tijdens de ontwikkeling van de juvenieleontwikkeling 2. Daarom moeten andere bronnen van neurale cellen worden overwogen in een celtherapiedoelstelling.
Degeneratieve neurologische ziekten zijn moeilijk te genezen met behulp van standaard farmacologische benaderingen. Nieuwe therapeutische strategieën voor het omarmen van veel immedicable neurologische aandoeningen zijn gebaseerd op celvervangende therapieën van ziek en gewond weefsel. NSC-transplantatie kan beschadigde cellen vervangen en gunstige effecten hebben. Andere bronnen voor neurale celvervanging zijn menselijke embryonale stamcellen (ESC), die zijn afgeleid van de binnencelmassa van zoogdierblastocysten3, evenals iPSC's4, die een uitgebreid zelfvernieuwingsvermogen hebben zoals ESC's en in staat zijn om zich te onderscheiden in verschillende cellijnen. NSC's kunnen ook worden gegenereerd door directe herprogrammering van menselijke fibroblasten die pluripotente toestand vermijden5.
Celvervangingstherapie is nog steeds een uitdagend probleem. Hoewel ESC, foetale of iPS een bron kan zijn voor het genereren van neuronale cellen voor de behandeling van veel ongeneeslijke neurologische ziekten, is autologe volwassen SCs-celvervanging van beschadigde weefsels een beter alternatief dat immunologische, ethische en veiligheidsproblemen omzeilt.
Activering van humaan GPI-gebonden eiwit door antilichaam-crosslinking via fosforylering van PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initieert een dedifferentiatie van bloedvoorlopercellen en degeneratie van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's)6. Deze cellen onderscheiden in vitro naar neuronale cellen zoals bevestigd door middel van brightfield, immunofluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) analyse.
In dit werk beschrijven we de GM-vrije generatie van BD-PSC's en hun succesvolle herdifferentiatie in cellen met neuronaal fenotype.

<table><tbody><tr><td>Albumine Fraction V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP Cy3-conjugaat</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI celviabiliteitskit</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym niet meer leverbaar. Het product wordt geproduceerd door Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Ascorbinezuur 2-fosfaat sesquimagnes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serumvrij 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>Basic FGF oplossing</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td><td>Merck Millipore</td><td>L6115-BC</td><td>dichtheidsgradiëntmedia</td></tr><tr><td>BSA Frac V 7,5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>nano-grootte magnetische kralen</td></tr><tr><td>Celtellings slides Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym niet meer leverbaar. Het product wordt geproduceerd door Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>Chamber Slides Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>epoxyhars</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Niet meer leverbaar. Beschikbaar onder: TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF recombinant human</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-glutamine</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde graad</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparine natrium cel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Human BDNF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td><td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>Laminine muis</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Geautomatiseerde Celteller</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym niet meer leverbaar. Het product wordt geproduceerd door Logos Biosystems.</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml;ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Morada digitale camera</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterieel</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetaat C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

gm-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Veel menselijke neurologische aandoeningen worden veroorzaakt door degeneratie van neuronen en gliacellen in de hersenen. Vanwege beperkingen in farmacologische en andere therapeutische strategieën is er momenteel geen remedie beschikbaar voor de gewonde of zieke hersenen. Celvervanging verschijnt als een veelbelovende therapeutische strategie voor neurodegeneratieve aandoeningen. Tot op de dag van vandaag zijn neurale stamcellen (NSC's) met succes gegenereerd uit foetale weefsels, menselijke embryonale cellen (ES) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). Een proces van dedifferentiatie werd geïnitieerd door activering van het nieuwe menselijke GPI-gebonden glycoproteïne, wat leidt tot de generatie van pluripotente stamcellen. Deze van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) onderscheiden in vitro in cellen met een neuraal fenotype, zoals blijkt uit brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie. Ultrastructurele analyse van deze cellen door middel van elektronenmicroscopie bevestigt hun primitieve structuur, neuronale morfologie en subcellulaire kenmerken.

De resultaten leveren bewijs dat deze nieuwe GM-vrije methode in staat is om bloed voorlopercellen terug te brengen naar hun meest primitieve toestand zonder direct in te werken op het menselijk genoom.
We hebben eerder aangetoond dat GPI-gebonden eiwitspecifieke antilichaam crosslinking initieert via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulatie van sterk geconserveerde ontwikkelingsrelevante genen zoals WNT, NOTCH en C-Kit, waardoor een proces van dedifferentiatie wordt gestart dat leidt tot ...

We presenteren een genetisch gemodificeerde vrije (GM-vrije) methode om cellen met een neuronaal fenotype te verkrijgen uit geherprogrammeerde perifere bloedcellen. Activering van een signaleringsroute gekoppeld aan nieuwe menselijke GPI-gebonden eiwitten onthult een efficiënte GM-vrije methode voor het verkrijgen van menselijke pluripotente stamcellen.

GM-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

De betekenis van het protocol is afhankelijk van membraan-naar-kernsignalering en heeft geen directe invloed op het genoom, zoals het geval is bij geïnduceerde pluripotente stamcellen. Het niet-teratogene karakter van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen is het belangrijkste voordeel van de techniek, waardoor het geschikt is voor veilige klinische toepassing op verschillende gebied van regeneratieve geneeskunde. Dr.Anne-Kathrin Schott, projectleider, en Oksana Greenacre, een laboratoriumassistent in mijn laboratorium, demonstreren de procedure.Om PBMNC's te isoleren, voegt u 25 milliliter een-op-een bloed verdund met PBS toe aan 10 milliliter dichtheidsgradiëntmedia en centrifugeert u het mengsel gedurende 30 minuten op 300 maal G. Isoleer de interfacelaag tussen het plasma en de dichtheidsgradiëntmedia door pipetten. Was de geïsoleerde cellen gedurende 10 minuten met vijf milliliter steriel PBS en centrifugeer op 300 maal G.Nadat u de procedure twee keer hebt herhaald, telt u het aantal cellen met behulp van een telkamer. Voeg 6 bij 10 toe aan de 6e mononucleaire cellen aan een buis van 15 milliliter en voer vervolgens antilichaam cross-linking uit door menselijk GPI-gebond

gm-free-generation-of-blood-derived-neuronal-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een eenvoudige en betrouwbare methode op isolatie en de cultuur van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale corticale weefsel wordt beschreven. Culturen zijn afgeleid van bekende menselijke neurologische aandoeningen kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van pathologische cellulaire en moleculaire processen, maar ook als een platform om de farmacologische werkzaamheid beoordelen.

Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

This video demonstrates a technique to generate neuronal cells from blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs). The BD-PSCs are obtained via reprogramming blood progenitor cells. The undifferentiated BD-PSCs are cultured on cell culture substrate-coated coverslips using a neural induction medium and a neural differentiation medium, triggering differentiation into cells with a neuronal phenotype.

Generation of Neuronal Cells from Blood-Derived Pluripotent Stem Cells

The video demonstrates the generation of neurons from adult human dermal fibroblasts (aHDFs). The aHDFs are reprogrammed using a lentiviral vector carrying genes for neuronal transcription factors and short hairpin RNAs (shRNAs). The shRNAs inhibit the expression of a neuronal transcriptional repressor, and the neuronal transcription factors activate genes to differentiate aHDFs into neurons. These reprogrammed aHDFs are cultured in an early and a late neuronal conversion medium to generate...

Generating Neurons by Reprogramming Human Dermal Fibroblast Cells

Source: Becker-Kojić, Z. A., et. al., GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates a protocol for preparing neural cells derived from reprogrammed peripheral blood cells for fluorescence microscopy, showcasing distinct cell types and developmental stages through immunofluorescence imaging.

Immunofluorescence Microscopy of Neural Cells Differentiated from Peripheral Blood-Derived Cells 

Een werkwijze werd ontwikkeld om direct voort humane neurale stamcellen van hematopoïetische progenitorcellen verrijkte uit perifere bloedcellen.

Direct Inductie van Human neurale stamcellen uit perifeer bloed hematopoïetische voorlopercellen

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in een benchtop 3D-suspensie bioreactor.

Productie van menselijke neurogenine 2-induceerbare neuronen in een driedimensionale suspensie bioreactor

Deze studie schetst een nieuwe benadering voor de oprichting van menselijke monocyt-afgeleide microglia-achtige (iMG) cellen die de indirecte beoordeling van hersenontsteking mogelijk maken. Dit presenteert een cellulair model dat nuttig kan zijn voor onderzoek dat zich richt op mogelijke ontsteking van de hersenen en bijbehorende neuropsychiatrische stoornissen.

Engineering van door menselijk bloed geïnduceerde microglia-achtige cellen voor omgekeerd translationeel hersenonderzoek

Leer een GM-vrije methode om neuronale cellen te genereren uit perifeer bloed zonder genetische modificatie. Deze techniek maakt veilige autologe stamcellen voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde mogelijk.

GM-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen

Meer video's verkennen