Detectie van genetische varianten in het CALR-gen met behulp van smeltanalyse met hoge resolutie

Deze methode definieert nauwkeurig calreticuline mutaties bij patiënten met een vermoedelijke hematologische aandoening, vooral waar andere diagnostische opties beperkt zijn of er sprake is van overlap met niet-hematologische aandoeningen. Het grote voordeel van de high-resolution mirror-techniek is het detecteren van de veelvoorkomende somatische genetische varianten in het hotspot-gebied van het calreticuline-gen op de aanvaardbare detectielimiet en tegen betaalbare kosten. Deze techniek maakt een snelle en niet-invasieve diagnose van myeloproliferatieve stoornissen mogelijk, met name essentiële trombocytemie en primaire myelofibrose.

Momenteel heeft het geen effect op de keuze van de therapie bij deze patiënten. Dit kan echter in de toekomst veranderen. Begin met het bereiden van de qPCR HRM-mastermix zoals beschreven in het tekstdocument, genoeg voor drie replica's van elk DNA-monster en controle.

Meng de reactie-inhoud door voorzichtig te tikken en de buis om te draaien en voor twee tot drie seconden te vortexen, draai de buis vervolgens kort door om de verspreide druppels te verzamelen. Breng 19 microliter van de qPCR HRM-mastermix over naar elk putje van de 96 Well Optical Reaction Plate. Pipetteer één microliter van de negatieve controles, positieve controles en monsters in de juiste putjes van de plaat voor de no template control of NTC op één microliter steriele RNA's en DNA's vrije water gebruikt voor het bereiden van de qPCR HRM-mastermix in plaats van DNA.

Versluit de reactieplaat stevig met de optische kleeffolie om verdamping tijdens de run te voorkomen. Draai het vervolgens gedurende één minuut bij 780 keer G op kamertemperatuur. Controleer of de vloeistof zich aan de onderkant van de putjes in de reactieplaat bevindt en voer de test uit.

Wijs de controles en monsters toe aan de juiste putjes in de instrumentsysteemsoftware en wijzig het standaard instrumentversterkingsprotocol. Programmeer het instrument zoals beschreven in het tekstdocument om de dissociatieanalyse onmiddellijk na qPCR uit te voeren. Wanneer de run eindigt, bekijk en verifieer de amplificatieplot.

Selecteer in het experimentmenu van de instrumentsysteemsoftware de optie voor de amplificatieplot. Als er geen gegevens worden weergegeven, klikt u op de groene analyseknop. In het tabblad Amplificatieplot, selecteert u vanuit het vervolgkeuzemenu voor plottype de plot die de amplificatiegegevens weergeeft als de fluorescentiemetingen, genormaliseerd naar de fluorescentie van de passieve referentie als functie van het cyclusnummer. In het vervolgkeuzemenu voor plotkleur, selecteert u monster.

Selecteer in het menu voor grafiektype de grafiek voor lineaire amplificatie, controleer of de start- en eindcyclus van de baseline correct is ingesteld. De eindcyclus moet een paar cycli voor de cyclusnummer worden ingesteld waar een significante fluorescente signaal wordt gedetecteerd. Selecteer in het menu voor grafiektype de grafiek voor log 10-amplificatie en toon de drempellijn op de grafiek door de optie drempelwaarde te selecteren en pas de drempelwaarde aan.

De drempellijn moet de exponentiële fase bij de qPCR-curves kruisen. Controleer of alle monster- en positieve controleputjes normale amplificatiecurven hebben en dat er geen amplificatie is in de NTC-putjes. Een normale amplificatieplot toont een exponentiële toename van de fluorescentie die de drempel tussen cycli 15 en 35 overschrijdt.

In de derivatie smeltcurven bekijkt u de pre- en post-smeltgebieden of temperatuurlijnen. De pre- en post-smeltgebieden moeten zich binnen een vlak gebied bevinden waar er geen grote pieken of hellingen zijn in de fluorescentieniveaus. Indien nodig stelt u het begin en einde van de pre- en post-smelttemperatuurlijnen in, ongeveer 0,5 graden Celsius van elkaar gescheiden.

Start de analyse opnieuw als de parameters zijn aangepast door op de knop analyseren te klikken. Kies in het tabblad plotinstellingen van het verschilpottabblad een van de wildtype control-replica's als de referentie-DNA en start de analyse opnieuw door op de knop analyseren te klikken. Bevestig in het tabblad uitgelijnde smeltcurven dat alle positieve controles de juiste genotype hebben en dat de NTC niet is versterkt.

Selecteer in de wel-tabel een controleweel om de corresponderende smeltcurve in de analyseplots te markeren en bevestig dat de kleur van de lijn overeenkomt met het juiste genotype. In het tabblad uitgelijnde smeltcurven bekijkt u zorgvuldig de plotweergaven voor de onbekende monsters en vergelijkt u deze met de plotweergaven voor controles. Selecteer de putjes met de onbekende monsterreplica's en lijn de smeltcurven uit met de controles in een geordende volgorde door de putjes met controles één voor één te selecteren.

Analyseer het resultaat voor het onbekende monster in het tabblad Verschilplot om te verifiëren dat de verkregen resultaten consistent zijn. Selecteer de putjes met de onbekende monsterreplica's en lijn de smeltcurven uit met de controles in een geordende volgorde, selecteer de putjes met controles één voor één. Voer qPCR HRM-producten uit op een 4% agarose pre-cast gel met een fluorescente nucleïnezuurstam.

Voer slechts één positieve negatieve NTC en monster qPCR HRM-replica's uit. Verwijder het pre-cast gel en de cassette uit de verpakking en verwijder vervolgens de kam en plaats het gel in de apparaat volgens de instructies van de fabrikant. Verdun een 10 microliter monster tot 20 microliters met steriele RNA- en DNA-vrije water en laad elk putje met 20 microliters van het verdunde monster.

Verdun drie microliter DNA-maatstaafoplossing tot 20 microliters en laad het in het markerputje. Vul eventuele lege putjes met 20 microliters steriele RNA- en DNA-vrije water. Selecteer onmiddellijk het programma volgens het percentage van de gel die wordt uitgevoerd en stel de runtime op het apparaat in op 20 minuten.

Start de elektroforese binnen één minuut na het laden van de monsters. Wanneer de elektroforese is voltooid, visualiseer het DNA en de gel met behulp van blauw licht of UV-transverlichting. En een succesvol versterkte DNA-regio van belang met een exponentiële toename van fluorescentie die de drempel tussen cycli 15 en 35 overschrijdt en zeer smalle waarden van het kwantificatiecyclus in alle replica's en controles is een voorwaarde voor de betrouwbare identificatie van genetische variantie door hoog-resolutie smeltanalyse.