Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Dit protocol is belangrijk omdat het de mogelijkheid biedt om bestaande celvrije translatiesystemen te gebruiken voor de analyse van actieve eukaryotische translatie op enkele molecuulniveau. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het de bulk-translatie-eigenschappen behoudt, single molecule resolutie biedt en relatief eenvoudig aan te passen is vanuit andere bulk-translatie-assays. Deze methode kan worden toegepast op elk celvrij translatiesysteem waarvan is geverifieerd dat het efficiënte cap-afhankelijke translatie onder bulkomstandigheden mogelijk maakt.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Hongyun Wang, een onderzoeksmedewerker, en Anthony Gaba, een senior onderzoekswetenschapper uit het laboratorium van Xiaohui Qu. Zet minstens drie uur voor het uitvoeren van een enkele molecuulexperiment de microscoop-incubator aan en verlaag de luchtstroom naar een lage snelheid om overmatige akoestische verstoring van het experiment te voorkomen. Stel vervolgens de incubatortemperatuur in op de optimale temperatuur die specifiek is voor het celvrije translatiesysteem.

Minstens een uur voor het experiment, druk op de laservermogenknop achter de laserbox, draai de laserstekker om en druk op de startknop om de laser aan te zetten. Zet de microscoop aan en selecteer de beeldvormingsmodus, het objectief en het filterset. Schakel de EMCCD-camera, de stagecontroller, de spuitpomp en de computer in en open de camera-, laser-, gemotoriseerde stage- en spuitpompsoftware.

In de laserbesturingssoftware, klik op verbinden om de laserintensiteit in te stellen, vink het sluitervakje uit en klik op besturing om de intensiteitsschuifregelaar in het pop-upvenster van de laserbesturing te slepen. Voer de penetratiediepte in om de laser in te stellen op de gewenste hoek en bevestig dat het sluitervakje gesloten is om de laser in de uitstand te houden wanneer er niet wordt geïmagerd. Wanneer de camera is afgekoeld en is gestabiliseerd tot de aangegeven werktemperatuur, selecteer in de camerasoftware de kinetische voor de acquisitiemodus en voer de belichtingstijd, de kinetische serielengte en de waarde van het vermenigvuldigingsversterkingswaarde in.

Selecteer de map en wijs bestandsnamen toe voor het opslaan van het data-afbeeldingsbestand. Stel de spuitpomp in op een matig tot snelle stroomsnelheid en voeg 500 microliter 70%ethanol toe aan een microcentrifugebuisje. Plaats het uiteinde van de spuitpompslang in de ethanoloplossing en gebruik de spuitpompsoftware om de spuitpomp tussen de aftrek- en uitdeelmodi te schakelen om de slang drie keer met ethanol en drie keer met RNase-vrij water te spoelen.

Na de laatste waterwas, tik de slanguiteinden op een schone doek om eventueel resterend water uit de binnenkant van de slang te verwijderen en plaats het uiteinde van de slang in een schone microcentrifugebuis. Voor immobilisatie van biotinyleerd mRNA met een drie-prime-uiteinde, plaats de stromingskamer in de microscoopmonsterhouder met de dekglaszijde naar beneden en zet de kamer vast met tape. Gebruik de tape om de in- en uitlaatopeningen van de stromingskamer die niet in gebruik zijn te dekken en voeg 1,5 keer het volume van een streptavidineoplossing van 200 microgram per milliliter toe aan de stromingskamer.

Na 10 minuten bij kamertemperatuur, spoel en veeg de kanaal drie keer met drie keer het volume van T50-wasbuffer per wassing en het gevouwen laboratoriumweefsel. Na de laatste wassing, plaats een druppel duikvloeistof op de microscoopobjectief en plaats de houder en de kamer op de microscoopstandaard. Breng vervolgens het objectief dicht bij het dekglas totdat de duikvloeistof op het objectief contact maakt met het dekglas en verplaats de monsterstandaard zodat de positie van het stromingskanaal zich direct boven het objectieflens bevindt.

Selecteer op de touchscreen van de microscoopbesturing de focustab en klik op focuszoeken en starten. Er zal een pieptoon worden gehoord wanneer het focusvlak met succes is bereikt. Selecteer in de camerasoftware de livemodus.

In de laserbesturingssoftware, open de lasersluiter en pas het laserintensiteitsniveau aan. Observeer het real-time fluorescentiebeeld in livemodus en op de touchscreen van de microscoopbesturing met behulp van de fijne stapcontrole om de objectiefpositie aan te passen. In de camerasoftware, verplaats de stage om het niveau van de fluorescentieachtergrond op verschillende gebieden van het detectieoppervlak van het stromingskanaal te evalueren.

Als de fluorescentie laag is, stop de livemodus en sluit de lasersluiter in de laserbesturingssoftware en vervang de wasbuffer van het stromingskanaal door tweemaal het volume van de biotinyleerd mRNA-oplossing. Was na 15 minuten het kanaal drie keer met drie keer het volume van translatie-compatibele buffer per wassing. Voor detectie op enkele molecuulniveau, monteer drie keer het volume van vers ontdooid translatiemengsel zonder mRNA en aangevuld met een geoptimaliseerde concentratie van fluorescent gelabelde antilichamen in een microcentrifugebuisje op ijs en draai de buis kort door om het mengsel aan de onderkant van de buis te verzamelen.

Breng het translatiemengsel over naar de binnenkant van de dop van een microcentrifugebuisje van 700 microliter en stel de spuitpomp in op de aftrekmodus. Plaats het uiteinde van de spuitpompslang in het translatiemengsel en start de spuitaftrek. Wanneer het translatiemengsel volledig in de slang van de spuitpomp is getrokken, stop met aftrekken, draai de instellingen van de spuitpomp om naar de uitdeelmodus en stel de stroom in op een optimale snelheid voor translatiemengselaflevering.

Start en stop de spuit om de translatiemix tot het einde van de slang te laten komen zoals nodig en plaats het uiteinde van de spuitpompslang in de inlaat van het stromingskanaal, waarbij u erop moet letten geen luchtbellen te veroorzaken. Schroef de op maat gemaakte metalen beugel op de plaat van de microscoopmonsterhouder om de verbinding te stabiliseren en beoordeel de microscoopfocus en de fluorescentie van het beeldvormingsgebied. Bevestig dat de parameters voor filmacquisitie correct zijn en dat de juiste bestandsnaam en map zijn ingevoerd voor het opslaan van de bestanden.

Verplaats de stage om beeldvorming van een gebied in het midden van het detectieoppervlak van het strom