Lipidico Injection Protocol voor seriële kristallografie metingen bij de Australische Synchrotron
23 september 2020
Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe seriële kristallografiemonsters kunnen worden voorbereid voor het verzamelen van gegevens op een hoge stroperige injector, Lipidico, onlangs in opdracht van de Australische synchrotron.
Dit protocol biedt wetenschappers de mogelijkheid om eiwitkristallen te karakteriseren die in zeer stroperige materialen zijn ingebed, evenals andere zachte materialen die momenteel moeilijk te karakteriseren zijn met bestaande opstellingen. Met behulp van deze methode worden de monsters bereid in glazen spuiten, direct op de injector gemonteerd, waardoor het injectorsysteem gemakkelijk te gebruiken is en monsterverspilling wordt geminimaliseerd. Om kristallen in een hoog viskeus medium te bereiden, centrifugeer eerst de kristaalvormende oplossing bij lage snelheid om een zachte kristalpellet te vormen.
Na het verwijderen van het overtollige medium, bevestigt u een koppelstuk aan het uiteinde van een glazen spuit van 100 microliter en laadt u 28 microliter van de kristaalvormende oplossing in de spuitcilinder. Breng de plunjer langzaam in de bovenkant van de spuit in en duw de oplossing voorzichtig naar het uiteinde van de koppeltip. Om luchtbellen te verwijderen, gebruikt u één behandschoende vinger om zeer lichte druk uit te oefenen op de bovenkant van de stompe koppelnaaldpunt om een afdichting te maken en trekt u de plunjer terug om de oplossing weg van de naaldpunt te trekken om een druk opbouw in de spuit te creëren, en verwijder vervolgens de vinger om de druk snel vrij te geven en om eventuele luchtbellen in de spuit te doen barsten.
Alternatief, houd de spuit in één hand met de naald naar boven en de plunjer tussen twee vingers en draai snel de arm die de spuit vasthoudt twee tot drie keer in één richting. De resulterende centrifugale kracht zal eventuele luchtbellen uit de spuit duwen. Wanneer alle luchtbellen zijn verwijderd, gebruikt u een fijne spatel om 42 microliter hoog-vacuüm siliconenvet rechtstreeks op de bovenkant van een tweede spuit van 100 microliter te plaatsen en drukt u de plunjer helemaal naar het uiteinde om eventuele luchtbellen te verwijderen en om ervoor te zorgen dat er geen luchtspleet is in het uiteinde van de spuit.
Wanneer alle luchtbellen uit beide spuiten zijn verwijderd, houdt u beide spuiten bij de uiteinden vast, bevestigt u de spuiten met de koppeling. Om de monsters samen te mengen, drukt u voorzichtig en achtereenvolgens 50 tot 100 keer de plunjer van de kristaalvormende oplossing en de siliconenvetspuit in om de materialen grondig te mengen en homogeen te laten lijken. Beeld vervolgens de kristallen onder een optisch microscoop.
Om de kristalconcentratie in het siliconenvet te bepalen, telt u het aantal kristallen in een specifiek gebied met behulp van de optische microscoopbeelden. Om de kristalconcentratie te verlagen, herhaalt u de kristalvoorbereiding met een groter volume siliconenvet of verdunt u de kristalpellet in kristallisatiebuffer voorafgaand aan de spuitopstelling. Om de kristalconcentratie te verhogen, herhaalt u de kristalvoorbereiding met een kleiner volume siliconenvet, waarbij u er rekening mee houdt dat de viscositeit niet lager dan 10 pascal seconden mag worden verlaagd.
Wanneer de juiste kristalconcentratie is verkregen, verplaatst u het hele monster naar een enkele spuit en vervangt u de koppeling door een injectienaald met een binnendiameter van 108 micron die stevig in de basis van de spuit is geschroefd. Om de injector in te stellen, selecteert u gereedschap en homemodus en negatieve limietschakelaar en start u het homen en laat u de software draaien totdat de schroef voldoende is teruggetrokken voor een spuit van 100 microliter onder de schroef past. Steek de naald van een lege spuit door de spleet in de spuithouder om de spuit op de injector te monteren en lijn de spuit uit tegen de beugel.
Wikt u een O-ring over het middengedeelte van de spuit, bevestigt u de ring aan de haken aan weerszijden van de spuit en wikkelt u een tweede O-ring om de haken aan de bovenkant van de spuit. Zorg ervoor dat een deel van de tweede O-ring op de glazen spuit is gepositioneerd. Om de monsterspuit voor te bereiden, primet u de spuit, plaatst u de injectordop op het zuigerhoofd van de monsterspuit en laadt u de spuit op de injector.
Beweeg de aandrijfschroef naar de bovenkant van de dop. Selecteer in de injectorbesturingssoftware snelheidsmodus en activeer snelheidsmodus. Stel de instellingswaarde in op 3.000 omwentelingen per minuut en klik op instellingswaarde toepassen.
Terwijl de schroef de dop op het zuigerhoofd nadert, wijzigt u de instellingswaarde in nul. Zodra contact is gemaakt, klikt u op instellingswaarde toepassen om de voorinstelling te activeren en de schroef onmiddellijk te stoppen. Wieg vervolgens voorzichtig de dop om ervoor te zorgen dat deze stevig op zijn plaats wordt gehouden.
Om de injector te laten lopen, wijzigt u de instellingswaarde in 100 omwentelingen per minuut en inspecteert u visueel de punt om het monster te observeren terwijl het begint uit te drukken. Na het sluiten van de hut, verlaagt u de instellingswaarde met stappen van 10 totdat een langzame maar stabiele stroom van materiaal wordt waargenomen. Als de monsterstroom niet goed stroomt, verhoogt u de instellingswaarde met stappen van 10 omwentelingen per minuut totdat de stroom rechter wordt.
Als de stroom zich niet stabiliseert, plaatst u een polystyreen monstersnijder onder de monsterstroom om de monsterstroom te helpen leiden. Als alternatief plaatst u een Venturi-zuigtrechter in de monstersnijder, die kan worden aangesloten op de luchtuitlaatbuis in de hut van de Australische synchrotron. Gebruik de Lipidico-apparaatstroomcalculator om de stroomsnelheid van de stroom te bepalen.
Het bepalen van de optimale monstersnelheid voor de injector is cruciaal voor de stabiliteit van de stroom. Een langzame stroomsnelheid resulteert in een expansie van het siliconenvet dat uit de injector wordt geperst, terwijl een snellere stroomsnelheid een dunnere stroom produceert. Het krullen van de viskeuze mediastroom is regelmatig waargenomen.
Om dit probleem bij hooggeladen monsters te overwinnen, kan een polystyreen catcher worden gebruikt om een zwakke elektrostatische kracht te introduceren. In deze analyse werd een glazen spuit met 26 microliter lys
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert de bereiding van seriële kristallografie-monsters met behulp van een hoog-visceuze injector, Lipidico, bij de Australische synchrotron. Hiermee kunnen proteïnekristallen die zijn ingebed in visceuze materialen worden gekarakteriseerd, wat de gegevensverzameling vergemakkelijkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Kristallografie
- Biofysica
- Materiaalkunde
Achtergrond
- Karakterisering van proteïnekristallen is essentieel voor het begrijpen van hun structuur.
- Bestaande methoden hebben moeite met zachte materialen en omgevingen met een hoge viscositeit.
- Innovatieve technieken kunnen de monstervoorbereiding verbeteren en verspilling minimaliseren.
- Het gebruik van glazen spuiten maakt directe montage op de injector mogelijk.
Doel van de studie
- Om een methode te bieden voor het bereiden van eiwitkristallen in viskeuze media.
- Om de bruikbaarheid van het Lipidico-injectiesysteem te verbeteren.
- Om monsterverlies tijdens het kristallografische proces te verminderen.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie van de kristaloplossing om een zachte pellet te vormen.
- Laden van de kristaloplossing in een glazen spuit.
- Toepassen van druk om luchtbellen uit de spuit te verwijderen.
- Direct monteren van de spuiten op de injector voor gegevensverzameling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle preparatie van monsters met minimale verspilling.
- Effectieve verwijdering van bellen om de integriteit van het monster te waarborgen.
- Gestroomlijnd proces voor het gebruik van de injector voor hoogviskeuze vloeistoffen.
- Aangetoonde haalbaarheid van het karakteriseren van zachte materialen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bereiden van crystallografische monsters.
- Het verbetert de mogelijkheden van bestaande crystallografische opstellingen.
- Deze aanpak kan leiden tot een betere karakterisering van uitdagende materialen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol stelt biofarma R&D-teams in staat om proteïnekristallen in omgevingen met een hoge viscositeit te karakteriseren, wat structurele biologie-workflows ondersteunt waarbij traditionele methoden tekortschieten. Door seriële kristallografie bij kamertemperatuur met de Lipidico-injector te faciliteren, wordt de datakwaliteit voor target de-risking en lead-optimalisatie verbeterd. De methode verhoogt de monsterefficiëntie en reproduceerbaarheid, wat een directe impact heeft op de besluitvorming tijdens vroege discovery en de prioritering van de portfolio.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt structurele karakterisering mogelijk van eiwitdoelen ingebed in viskeuze matrices, wat bijdraagt aan functionele validatie en mechanisch inzicht.
- Operationele waarde: Vermindert monsterverlies door efficiënte voorbereiding met een spuit en directe montage van de injector, waardoor de doorvoersnelheid in validatiecampagnes voor doeleiwitten wordt verhoogd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert homogene kristalsuspensies in siliconenvet, waardoor betrouwbare diffractiegegevens kunnen worden verzameld voor hit-bevestiging.
- Operationele waarde: Standaardiseert het laden van monsters via glazen spuiten en een koppelingssysteem, wat zorgt voor consistente prestaties van de injector tijdens screening-runs.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt gegevensverzameling bij kamertemperatuur, waardoor natuurlijke proteïnetoestanden die relevant zijn voor fysiologische condities en translationele modellering behouden blijven.
- Operationele waarde: Integreert met synchrotron-beamlines voor high-throughput structurele analyse, wat de evaluatie van preklinische kandidaten versnelt.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-identificatie en levert structurele gegevens die bijdragen aan de hit-to-lead progressie en de verfijning van assays.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door hoogresolutie-visualisatie van eiwit-ligandinteracties in viskeuze omgevingen mogelijk te maken.
- Screening: Levert kwantitatieve diffractiegegevens die helpen bij het vergelijken van bindingsmodi en affiniteitstrends binnen series van verbindingen.
- Analytics: Biedt elektronendichtheidskaarten en debietsmetingen die inzicht geven in de structurele betrouwbaarheid en drempelwaarden voor monsterkwaliteit.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door de eiwitintegriteit tijdens de gegevensverzameling te behouden, wat een relevante biologische interpretatie ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor seriële kristallografie voor meerdere targets en projecten, waardoor redundante opstartinspanningen worden verminderd.
Operationele & Zakelijke Impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in de doelstructuur, vermindering van mechanische ambiguïteit in viskeuze formuleringen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van monstervoorbereiding en gegevensverzameling.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen op basis van structurele gegevens, kapitaalefficiëntie door verminderd monsterverbruik en verlaagd biologisch risico bij lead-optimalisatie.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van targets met gevalideerde structurele gegevens, waardoor geïnformeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk worden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in proteïnekristallisatie, het hanteren van viskeuze monsters en synchrotron-gebaseerde gegevensverzameling.
- Afhankelijk van toegang tot injectoren voor hoge viscositeit zoals Lipidico en compatibele beamline-infrastructuur (bijv. MX2 bij de Australian Synchrotron).
- Noodzaak van standaardisatie tussen teams van kristallografie, formulering en data-analyse voor een consistente monstervoorbereiding.
- Omvat aanpassingen voor variërende monsterviscositeiten, met een ondergrens van 10 Pa.s om de stabiliteit van de injector te waarborgen.
- Bevat praktische beperkingen zoals potentiële instabiliteit van de stroom bij bepaalde monstereigenschappen en de noodzaak voor optimalisatie van de stroomsnelheid om krullen of expansie van de geëxtrudeerde stroom te voorkomen.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
High Viscous Medium Crystal Preparation
2:37
Crystal Concentration Determination
3:28
Injector Mounting and Control
4:14
Sample Syringe Mounting
5:01
Running the Injector
5:59
Results: Representative Serial Crystallography Measurement
6:50
Conclusion
