Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Het protocol dat in deze video voor het eerst wordt getoond, combineert het gebruik van chemische epigenetische wissen met biomechanische signalen om pluripotentie te induceren en te behouden in volwassen terminaal gedifferentieerde cellen. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het geen transgene of virale vectoren vereist. Bovendien is het robuust, zeer reproduceerbaar en flexibel.

Deze techniek vereist geen gebruik van gentransfectie en vertegenwoordigt daarom een opmerkelijke technologische vooruitgang voor translationele geneeskunde en celtherapie, terwijl het ondersteuning biedt voor langdurige cultuur van cellen met hoge plasticiteit. De procedure zal worden gedemonstreerd door Georgia Pennarossa, een assistent-professor, en Teresina De Iorio, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin met het bereiden van verse 5-aza-CR-voorraadoplossing van één millimolair.

Weeg 2,44 milligram van 5-aza-CR en los het op in 10 milliliter DMEM met hoge glucose. Breng het poeder opnieuw in suspensie door te vortexen en steriliseer de oplossing met een 0,22-micrometerfilter. Bereid de werkoplossing van 5-aza-CR voor door één microliter van de voorraadoplossing te verdunnen in één milliliter fibroblast-kweekmedium.

Trypsiniseer de cellen zoals beschreven in het tekstmanuscript en verwijder ze door voorzichtig te pipetteren. Verzamel vervolgens de celsuspensie en breng deze over in een conische buis. Tel cellen met behulp van een telkamer onder een optische microscoop.

Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij 150 keer G. Verwijder vervolgens het supernatant en suspendeer de pellet om 40.000 cellen in 30 microliter fibroblast-kweekmedium te verkrijgen, aangevuld met 5-aza-CR van één micromolair. Vul een 35-millimeter petrischaal met PTFE-poeder om een bed te produceren en verdeel de 30 microliter celsuspensie over het poederbed.

Roteer de petrischaal voorzichtig in een cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat PTFE-poeder het oppervlak van de vloeistofdruppel volledig bedekt om een microbioreactor van vloeibare parel te vormen. Neem de microbioreactor van de vloeibare parel op met een 1000-microliter pipettepunt die is afgesneden om de diameter van de parel te kunnen bergen. Plaats de microbioreactor op een schone bacteriologische petrischaal om hem te stabiliseren.

Breng vervolgens de microbioreactor over van de petrischaal naar een 96-wellsplaat. Voeg langzaam 100 microliter medium toe vanaf de rand van de well. De microbioreactor zou bovenop het medium moeten drijven.

Incubeer de microbioreactor van de vloeibare parel gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator. Na de incubatie verzamelt u de microbioreactor van de vloeibare parel met een 1000-microliter pipettepunt en plaatst deze in een nieuwe 35-millimeter bacteriologische petrischaal. Gebruik een naald om de vloeibare parel te doorboren en te breken.

Herstel de gevormde sferoïden met een 200-microliter pipettepunt die aan de rand onder een stereomicroscoop is afgesneden. Om restanten van 5-aza-CR weg te wassen, brengt u de organoïdjes over in een petrischaal met ESC-medium. Bereid een nieuwe 35-millimeter petrischaal voor met het PTFE-poederbed en verdeel een enkele organoïd in een druppel van 30 microliter ESC-kweekmedium op het poeder met behulp van een 200-microliter afgesneden pipettepunt.

Roteer de schaal voorzichtig in een cirkelvormige beweging om een nieuwe microbioreactor van de vloeibare parel te vormen en breng deze over in een well van een 96-wellsplaat. Voeg 100 microliter medium toe vanaf de rand van de well om de parel langzaam te baden. Kweek de microbioreactoren van de vloeibare parel bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Morfologische analyses tonen aan dat na een incubatie van 18 uur met het demethylerende middel 5-aza-CR, fibroblasten van drie zoogdiersoorten die zijn ingekapseld in PTFE-microbioreactoren, zich verzamelen en 3D-bolvormige structuren met een uniforme groottegeometrie vormen. Onder 3D-omstandigheden wijzigde 86,31% van de ingekapselde cellen opmerkelijk hun fenotype. In tegenstelling daarmee waren post-5-aza-CR-cellen die in 2D-standaardcondities werden gekweekt aanzienlijk kleiner in grootte, met gegranuleerde kernen en behielden ze een monolaagdistributie.

De morfologische veranderingen gingen gepaard met het begin van pluripotentie-gerelateerde genexpressie, zowel in 3D als in 2D post-5-aza-CR-cellen. Transcriptie werd waargenomen voor POU klasse vijf homeobox een, NANOG homeobox, ZFP42 zinkvingereiwit en geslachtsbepalende regio Ybox2, die afwezig zijn in onbehandelde fibroblasten. Een significante upregulatie van de 10-11 translocatie 2 epitheelcel-adhesiemolecuul en cadherine 1-genen werd ook waargenomen in 3D post-5-aza-CR-cellen in vergelijking met cellen die werden gekweekt in 2D-standaard plastic schalen.

Parallel daaraan werd downregulatie van de fibroblast-specifieke marker Thy1-celoppervlakte-antigeen gedetecteerd in zowel 3D als 2D post-5-aza-CR-cellen. Een significante afname van de methylatieniveaus in zowel 3D als 2D post-5-aza-CR-cellen werd bevestigd met ELISA. DNA-methylatieniveaus waren significant lager in 3D post-5-aza-CR-cellen vergeleken met de cellen die werden gekweekt in 2D-condities.

Bovendien behielden 3D post-5-aza-CR-cellen de verkregen 3D-bolvormige structuur, hoge expressieniveaus van pluripotentie-gerelateerde genen en lage DNA-methylatieniveaus gedurende 28 dagen, waarna de cultuur werd gestopt. De microbioreactoren kunnen ook worden gebruikt om optimale omstandigheden voor progenitorcelculturen te handhaven, evenals om de efficiëntie van terminale differentiatie te verhogen.