Ultra-High-Speed Western Blot met behulp van Immunoreaction Enhancing Technology
26 september 2020
Een ultrasnelle westerse blotting-techniek wordt ontwikkeld door de kinetiek van antigeen-antilichaambinding te verbeteren door middel van cyclische draining- en replenishing (CDR)-technologie in combinatie met een immunoreactieverhogend middel.
Western blotting is een gevestigde methode die antigenen op een overgedragen membraan detecteert en wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek, maar het duurt uren of dagen om de hele procedure te voltooien. Door de combinatie van immuno-versterkende technologie met cyclisch afvoeren en aanvullen, kan de hele procedure, zodra je een geblokkeerd membraan hebt, in slechts 20 minuten worden voltooid zonder de gevoeligheid op te offeren. Omdat Western blotting in veel verschillende onderzoeksgebieden wordt gebruikt, heeft het een brede toepasbaarheid om onderzoek te versnellen.
Het succesvolle gebruik van dit protocol is afhankelijk van de optimalisatie van antilichaamverdunning met immunoreactieverhogende reagentia en incubatietijd. Begin door de PVDF-membranen gedurende een uur in te couveer in geschikte blokkeringsbuffers met agiteren bij kamertemperatuur. Terwijl de membranen incuberen, bereid 10% immunoreactieverhogende middel een oplossing of IRE1 voor met gedestilleerd water en klop het goed door elkaar, verdun vervolgens het primaire antilichaam met 10%IRE1, meng het voorzichtig en grondig.
Pak de PVDF-membraan met een pincet en laat de blokkeringsoplossing kort afvloeien. Plaats het membraan in een conische buis met primaire antilichaam, zorg ervoor dat het hele membraan tegen de wand van de buis blijft plakken en dat de kant van het membraan die oorspronkelijk in contact was met de gel naar binnen gericht is. Sluit de buis goed af.
Plaats de buis in een glazen fles voor de hybridisatieoven en zet de oven aan. Incubeer het membraan met een rotatie van zes RPM gedurende ten minste vijf minuten. Stop met roteren en verwijder voorzichtig het PVDF-membraan met pincet uit de buis.
Plaats het membraan in een bak met 50 milliliter PBST en spoel het, spoel het vervolgens in een bak met gedestilleerd water tot er geen bubbels meer verschijnen, waardoor het grootste deel van het antilichaam wordt verwijderd. Breng het membraan over in een slaspinner die 250 milliliter PBST bevat. Plaats de zeefmandje in de spinner en zorg ervoor dat het deksel goed op zijn plaats zit, activeer vervolgens de spinner en laat hem 20 tot 30 seconden draaien.
Gooi de oplossing weg en spoel het binnenste van de spinner kort met gedestilleerd water. Voeg 250 milliliter PBST toe aan de spinner en herhaal het spinnen, bekijk vervolgens het membraan met de secundaire antilichamen en was het opnieuw zoals beschreven in het tekstmanuscript. Leg een stuk semi-transparant flexibele film op een platte ondergrond.
Meng twee componenten van het chemiluminescente substraat in een vijf milliliterbuis en breng onmiddellijk 1,5 milliliter van de gemengde substraat over op de semi-transparante film. Leg het PVDF-membraan op de oplossing en breng de rest van de substraatoplossing aan op het membraan. Incubeer het PVDF-membraan met de gemengde substraat gedurende een minuut.
Pak het PVDF-membraan met pincet en laat de substraatoplossing kort afvloeien. Plaats het membraan tussen een paar transparante films en beeld het af in chemiluminescente modus. De hoeveelheden antigeen en antilichaam die respectievelijk nodig zijn voor chemiluminescente detectie van Western blot worden hier getoond.
Bij zowel statische als CDR-incubaties verhoogde het gebruik van IRE-oplossingen de gevoeligheid. Evenzo werd de minimale concentratie van anti-6s His-tag antilichaam verlaagd van 100 tot 50 nanogram per milliliter onder statische omstandigheden en van 100 tot 12,5 nanogram per milliliter onder CDR-omstandigheden. CDR-incubatie gedurende 5 of 10 minuten verlaagde de detectielimiet aanzienlijk in vergelijking met statische incubatie.
Bovendien toonde de combinatie van CDR met IRE superieure gevoeligheid op de Western blot, zelfs binnen de extreem korte incubatieperiode. De succesvolle toepassing van deze methode op een Western blot met fluorescerende detectie wordt hier gedemonstreerd. Fluorescerende detectie heeft in tegenstelling tot chemiluminescente detectie de unieke mogelijkheid om meerdere doelen op dezelfde blot tegelijkertijd te detecteren zonder het strippen en herproberen van antilichamen.
His-gelabelde alkalische fosfatase en beta-actine in de celextracten werden gelijktijdig gedetecteerd met behulp van een tweekleurenfluorescerend kleurmiddel. CDR-incubatie met IRE versnelde niet alleen de detectie, maar verhoogde ook de gevoeligheid. Tijdens de incubatie moet het membraan aan de wand van de buis blijven plakken.
De buis moet horizontaal worden geroteerd zodat de oplossing continu over het membraanoppervlak spoelt. Dit protocol heeft onze onderzoeksproductiviteit aanzienlijk versneld, die sterk afhankelijk is van Western blotting-procedures.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een ultra-snelle western blotting-techniek die de benodigde tijd voor de procedure aanzienlijk verkort. Door gebruik te maken van cyclic draining and replenishing (CDR)-technologie in combinatie met een middel dat de immunoreactie versterkt, kan het volledige proces in slechts 20 minuten worden voltooid zonder dat dit ten koste gaat van de gevoeligheid.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biomedisch onderzoek
- Western blotting-technieken
- Immuno-verbeterende technologie
Achtergrond
- Western blotting is een veelgebruikte methode voor het detecteren van antigenen.
- Traditionele western blotting-procedures kunnen uren of zelfs dagen in beslag nemen.
- Het verbeteren van de snelheid van deze techniek kan de efficiëntie van het onderzoek verhogen.
- De studie richt zich op het optimaliseren van de antilichaamverdunning en de incubatietijden.
Doel van de studie
- Om een sneller western blotting-protocol te ontwikkelen.
- Om de gevoeligheid te behouden terwijl de proceduretijd wordt verkort.
- Om de brede toepasbaarheid van de techniek over verschillende onderzoeksgebieden aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van cyclic draining and replenishing (CDR)-technologie.
- Toevoeging van een middel dat de immunoreactie versterkt (IRE1).
- Blokkeren van PVDF-membranen in geschikte buffers.
- Optimalisatie van de antilichaamverdunning en incubatietijden.
Belangrijkste resultaten
- De volledige western blotting-procedure kan in 20 minuten worden voltooid.
- Gedurende het hele proces blijft een hoge gevoeligheid behouden.
- Een succesvolle optimalisatie leidt tot een effectieve antigeendetectie.
- De methode vertoont potentieel voor wijdverbreid gebruik in diverse onderzoeksvelden.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek versnelt western blotting aanzienlijk.
- De combinatie van CDR-technologie met immuunversterkende middelen is effectief.
- Deze vooruitgang kan leiden tot snellere onderzoeksresultaten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Western blotting blijft een fundamentele techniek voor doelwitvalidatie en biomarkeranalyse, maar de lange incubatieperiodes vormen knelpunten in workflows voor high-throughput discovery. Deze ultra-snelle methode reduceert de analysetijd van uren naar 20 minuten terwijl de sensitiviteit behouden blijft, waardoor snelle analyse van eiwitexpressie in meerdere monsters mogelijk wordt. De aanpak ondersteunt snellere hypothese-testen en lead-identificatie door de doorvoer van de analyse te verhogen zonder de datakwaliteit in gevaar te brengen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt snelle toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door versnelde eiwitdetectie.
- Operationele waarde: Vermindert de tijd per blot, waardoor meer targets parallel gescreend kunnen worden tijdens de vroege targetvalidatie.
- Voorspellende waarde: Handhaaft de sensitiviteit van de assay, wat betrouwbare beoordelingen van target-engagement en pathway-modulatie ondersteunt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten van eiwitexpressie die geschikt zijn voor assay-standaardisatie.
- Operationele waarde: Compatibel met zowel chemiluminescente als fluorescente detectie, wat multiplexing en een flexibele keuze van de uitlezing mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Het formaat met cyclisch afvoeren en aanvullen ondersteunt aanpassing aan geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Faciliteert consistente proteïneanalyse van ontdekking tot preklinische modellen door gebruik te maken van dezelfde snelle detectiemethode.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de evaluatie van post-translationele modificaties en proteïne-isovormen die relevant zijn voor ziekteprocessen.
- Risicoreductie: Versnelt de validatie van doel-biomarkers, waardoor onzekerheid bij beslissingen over preklinische voortgang wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van screening op target-interactie tot lead-optimalisatie, waarbij snelle proteïnekwantificering iteratieve ontwerpcycli ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door snelle, herhaalde meting van proteineniveaus onder variërende experimentele omstandigheden mogelijk te maken.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde, kwantitatieve output waarmee de antilichaambinding tussen verschillende condities en monsters vergeleken kan worden.
- Analytics: Biedt gevoelige detectielimieten (bijv. lagere vereisten voor antilichaamconcentraties) die de signaal-ruisverhouding verbeteren bij de analyse van targets met een lage abundantie.
- Translationeel onderzoek: Maakt consistente eiwitmonitoring over verschillende monstertypes mogelijk, wat de validatie van biomarkers in ziekterelateerde systemen ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een platform-geschikte techniek die vanwege de brede compatibiliteit toepasbaar is op meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door snelle, reproduceerbare proteïnedetectie.
- Operationele waarde: Verbetert de laboratoriumdoorvoer en de efficiëntie van reagentia door incubatietijden en het antilichaamsverbruik te verminderen.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen bij targetselectie mogelijk door cycli van datageneratie te versnellen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door tijdige targetvalidatiegegevens te leveren voor investeringsbeslissingen.
Overwegingen bij de implementatie
- Kennis van technieken voor cyclisch afvoeren en aanvullen en het hanteren van immunoreactie-versterkende middelen is vereist.
- Standaardapparatuur voor western blotting is nodig, waaronder een hybridisatieoven, een centrifugeersaladebol en detectiesystemen voor chemiluminescente of fluorescerende read-outs.
- Optimalisatie van de antilichaamverdunning en incubatietijden is noodzakelijk bij de integratie van het immunoreactie-versterkende middel.
- Training is vereist om een correcte behandeling van het membraan tijdens de afvoer- en centrifugeerstappen te waarborgen, zodat de signaalintegriteit behouden blijft.
- Het meest geschikt voor laboratoria die frequent western blots uitvoeren, waarbij de tijdsbesparing cumulatief is over meerdere targets en condities.
