Tweedimensionale visualisatie en kwantificering van labiele, anorganische plantennutriënten en verontreinigingen in de bodem
September 1st, 2020
Dit protocol presenteert een workflow voor sub-mm 2D visualisatie van meerdere labiele anorganische nutriënten- en verontreinigingsolute soorten met behulp van diffusieve gradiënten in dunne films (DGT) in combinatie met massaspectrometrie beeldvorming. Solutebemonstering en chemische analyse in hoge resolutie worden in detail beschreven voor het kwantitatief in kaart brengen van soluten in de rhizosfeer van terrestrische planten.
De bio tot chemische cyclus van elementen in de bodem speelt een cruciale rol in omgevingssystemen. Met dit protocol kan de verdeling van plantbeschikbare elementfracties in 2D worden gevisualiseerd met behulp van DGT-massaspectrometriebeeldvorming. Deze methode is uniek in zijn vermogen om ultrasporenniveaus van meerdere anorganische opgeloste soorten te visualiseren en te kwantificeren op het oplosmiddelinterface, wat de ruimtelijke resolutie van alternatieve methoden aanzienlijk overtreft.
Naast het onderzoek naar arbeids- en oplosmiddelstromen in bodems en sedimenten, kan deze methode worden toegepast om te onderzoeken hoe plantwortels voedingselementen en verontreinigende elementen opnemen. Voor DGT-gelfabricage, bekleed eerst een dunne film van polyurethaan gebaseerd gemengd anion en kation bindend gel suspensie op een glazen plaat en plaats de plaat in een oven om gelvorming te initiëren door oplosmiddelverdamping. Na het herhalen van het aanbrengen en verdampen driemaal, hydrateer de resulterende drievoudig gecoate glazen plaat in een waterbad om een 0,1 millimeter dunne, scheurvaste gemengde anion en kation bindende gel te verkrijgen.
Om de rhizotron te assembleren, gebruik twee klemmen om een kleine acrylen plaat aan de onderkant van de opkomst van de rhizotron te bevestigen met de druk van de klemmen gericht op het rhizotronframe, zodat de plaat niet naar binnen buigt. Kantel de rhizotron lichtjes naar de kleine plastic plaat en vul de rhizotron met vooraf bevochtigde grond tot een geschatte hoogte van vier centimeter. Roer de rhizotron lichtjes om de grond gelijkmatig te verdelen en gebruik een compactiegereedschap om de grond voorzichtig een paar millimeter te comprimeren.
Herhaal het vullen en comprimeren tot de rhizotron gevuld is met grond, waarbij een drie centimeter opening aan de bovenkant wordt achtergelaten. Gebruik tape om voorzichtig een 13 bij 22 centimeter stuk PTFE-folie op het rhizotronframe te bevestigen, één hoek tegelijk, waarbij spanning wordt toegepast om een platte folieoppervlakte te garanderen. Wanneer de PTFE-folie plat en grensoverschrijdend is met het grondoppervlak, bevestig een tweede stuk folie aan het onderste uiteinde van de rhizotron, overlappend met het bovenste PTFE-foliestuk met één centimeter op dezelfde manier.
Wanneer het tweede stuk is bevestigd, breng een beschermende plastic folieafdekking aan. Plaats een voorplaat op de met grond gevulde en met folie bedekte rhizotron en plaats een rail aan elke kant van de rhizotron. Draai vervolgens de schroeven met de hand vast om de rails in de voorplaat op de rhizotron te bevestigen met de schroevenpositie naar de gesloten kant van de rhizotron.
Om de grond water te geven, duwt u pipettentips in de bewateringsgaten en laat u het water door middel van zwaartekracht in de grond stromen. Om planten te laten groeien, plant u maximaal twee zaailingen in de rhizotron en voegt u vijf milliliter water rechtstreeks toe aan de zaailingen om hun groei te ondersteunen. Bedek de bovenste opening van de rhizotron gedurende de eerste twee dagen na het planten met een transparante vochtbehoudfolie en wikkel de rhizotron in aluminiumfolie om microfytische groei te voorkomen.
Plaats vervolgens de beplante rhizotron in een groeikamer met de omgevingsomstandigheden ingesteld op de specifieke plantvereisten en kantel de rhizotron 25 tot 35 graden om wortelontwikkeling langs de voorplaat via gravitropisme te bevorderen. Om het vervaardigde DGT-gel toe te passen, snijdt u een 10 micron dikke polycarbonaatmembraan met een 0,2 micron poriegrootte op een breedte van minimaal meer dan een centimeter aan elke kant van het gel en plaatst u het membraan op het gel. Breng water aan om luchtbellen uit de stapel te verwijderen en gebruik vinyl elektrotape om het membraan aan de plaat langs alle vier de randen van het gel te bevestigen.
Na het verwijderen van de voorplaat en beschermende folies, lijnt u de zoeker van een digitale single lens reflexcamera uitgerust met een macrolens uit op het centrum van het gebied van belang in het gel en inclusief een schaalbalk in de afbeelding, neem een orthogonale foto van het gebied van belang. Lijn vervolgens een rand van de plaat uitgerust met de gelmembraanstapel uit met een rand van de open rhizotron. Buig de plaat voorzichtig naar de grond en gebruik de rails en schroeven om de plaat aan de rhizotron te bevestigen.
Na de isolatiemonsterperiode, brengt u de voorplaat van de rhizotron over naar een laminaire stromingskast met de gelmembraanstapelzijde naar boven en verwijdert u voorzichtig het plakband en het polycarbonaatmembraan dat het gel bedekt. Breng water aan om het gel te helpen vrij te zweven op een dunne film van water op de plaat met de zijde die contact maakt met de grond naar boven gericht en breng het gel over op een polyethersulfonemembraan met een 0,45 micron poriegrootte en ondersteuning van blottingpapier. Na het bedekken van de gelstapel met beschermfolie, plaatst u de stapel in een vacuümgeldroger.
Wanneer het gel volledig is gedroogd, gebruikt u dubbelzijdig plakband om het droge gel samen met andere gelmonsters op een glazen plaat te bevestigen. Om een laserablatie inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie lijnscananalyse van de droge DGT-gels uit te voeren, bevestigt u eerst de monsterblanks en standaarden op de laserablatiemonsterfase en vergrendelt u de laserfase in de ablatiecel van het laserablatiesysteem. In de laserablatiesoftware verplaatst u het gebied van belang op het geloppervlak en tekent u een enkele, ongeveer een milliliter lange lijn over het oppervlak van de gelstandaard.
Klik rechts op de lijn in het scanpatronenvenster om te verifiëren dat de laserablatieparameters zijn ingesteld en overgenomen en gebruik de duplicaatscanstool om deze lijn vier keer te dupliceren met een interlijnafstand groter dan de spotdiameter. Na het herhalen van deze lijn voor elke gelstandaard calibratieblank en methodeblank, tekent u een enkele lijn langs de bovenrand van het rechthoekige gebied van het gelmonster dat moet worden geanalyseerd en dupliceert u de lijn om parallelle lijnen voor het hele monstergebied te creëren, zoals aangetoond, met een interlijnafstand van 300 tot 400 micrometer. Controleer of elk start- en eindpunt van elke lijn goed gefocus
Overzicht
Dit protocol presenteert een werkstroom voor sub-mm 2D visualisatie van meerdere labiele anorganische nutriënt- en contaminantensoorten in oplossing met behulp van diffusieve gradiënten in dunne films (DGT) gecombineerd met massaspectrometrie beeldvorming. Deze methode maakt kwantitatieve kartering van opgeloste stoffen in de rizosfeer van terrestrische planten mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Milieuwetenschappen
- Bodemchemie
- Plantenfysiologie
Achtergrond
- De bio tot chemische cyclus van elementen in de bodem is cruciaal voor milieusystemen.
- Het begrijpen van de verdeling van plantaardige beschikbare elementfracties is belangrijk voor nutriëntenbeheer.
- Traditionele methoden bieden mogelijk niet de ruimtelijke resolutie die nodig is voor gedetailleerde analyse.
- Dit protocol maakt gebruik van DGT massaspectrometrie beeldvorming voor verbeterde visualisatie.
Doel van studie
- Om ultra-spoorniveaus van meerdere anorganische oplosbare soorten op het oplosbaarheidsoppervlak te visualiseren en kwantificeren.
- Om arbeid en oplosbare stoffenfluxen in bodems en sedimenten te onderzoeken.
- Om te onderzoeken hoe plantenwortels nutriënt- en contaminantelementen opnemen.
Gebruikte methoden
- Fabricage van DGT-gel met behulp van een polyurethaan-gebaseerde gemengde anion- en kationbindingsgel.
- Samenstelling van een rhizotron voor bodem- en plantengroei.
- Toepassing van DGT-gel voor oplossingsbemonstering.
- Laser ablatie inductief gekoppelde plasma massaspectrometrie voor analyse van DGT-gels.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van nutriënt- en contaminantensoorten in oplossing in 2D.
- Kwantitatieve kartering van oplosbare stoffen in de rizosfeer bereikt.
- Verbeterde ruimtelijke resolutie vergeleken met alternatieve methoden.
- Inzichten in nutriëntopnamemechanismen door plantenwortels.
Conclusies
- De DGT massaspectrometrie beeldvormingsmethode is effectief voor het bestuderen van bodem-plant interacties.
- Dit protocol kan worden toegepast op verschillende milieustudies.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode voor bredere toepassingen in de bodemchemie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables sub-millimeter 2D visualization and quantification of labile inorganic nutrients and contaminants in the rhizosphere, providing high-resolution spatial data on solute fluxes at the soil-plant interface. It supports mechanistic de-risking in early discovery by revealing localized nutrient mobilization and trace metal uptake patterns, which can inform target validation for agrochemical or phytoremediation strategies. The quantitative, multi-element imaging capability enhances predictive confidence in modeling plant-environment interactions for translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping labile nutrient and contaminant fluxes in plant-root systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of solute distribution changes associated with root morphology and soil chemistry.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying localized zones of elemental depletion or accumulation linked to plant physiological processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (rhizotrons with DGT gels) for downstream compound screening by establishing baseline solute flux profiles.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via internal normalization using 13C and external calibration with matrix-matched gel standards.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation through quantitative 2D imaging of multi-element solute fluxes at sub-millimeter resolution.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase rhizosphere imaging to preclinical validation by co-localizing solute fluxes with physiological markers such as pH.
- Mechanistic De-risking: Reveals pH-induced metal solubilization patterns, reducing ambiguity in trace metal uptake mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by linking root-mediated solute fluxes to environmental contamination or nutrient mobilization phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical work, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking in soil-plant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing spatial relationships between root morphology and solute fluxes of nutrients and contaminants.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible DGT gel deployment and LA-ICP-MS line-scan imaging for quantitative solute mapping.
- Analytics: Provides normalized, calibrated isotope intensity data enabling cross-condition comparison of labile solute species.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by correlating solute fluxes with environmental parameters like pH, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multi-element rhizosphere imaging across diverse plant species and soil conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in nutrient and contaminant uptake pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of sub-millimeter 2D solute flux measurements.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in agrochemical or phytoremediation development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative, spatially resolved solute flux data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DGT gel fabrication, rhizotron assembly, and LA-ICP-MS operation.
- Depends on access to laser ablation systems, mass spectrometers, and clean lab environments for gel preparation and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation, deployment, and imaging protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations across plant species, soil types, and contaminant profiles to maintain solute flux accuracy.
- Practical limitations include the need for close and stable DGT gel-soil contact to avoid analytical artifacts, as noted in the source.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Diffusive Gradients in Thin Films (DGT) Gel Fabrication and Rhizotron Preparation
3:06
Plant Cultivation
3:47
Solute Distribution Sampling
4:48
Gel Retrieval and Chemical Analysis Preparation
5:38
Laser Ablation Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (LA-ICP-MS) Line Scan Analysis
7:39
Data Processing and Calibration
9:03
Image Generation
9:48
Results: Representative Sub-mm 2D Solute Flux Distribution of Multiple Nutrients and Contaminants Across Different Soil-Root Interfaces
11:24
Conclusion
