Eencellige elektroporatie over verschillende organotypische slicecultuur van hippocampale excitatory en klassespecifieke remmende neuronen
6 oktober 2020
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor eencellige elektroporatie dat genen kan leveren in zowel excitatory als remmende neuronen in een reeks in vitro hippocampale slice-cultuurleeftijden. Onze aanpak zorgt voor een nauwkeurige en efficiënte expressie van genen in individuele cellen, die kunnen worden gebruikt om cel-autonome en intercellulaire functies te onderzoeken.
Gentransfectie is een essentiële aanpak voor neurobiologische studies. Onze elektroporatietechniek stelt ons in staat om het gen van belang interneuronen te transfecteren in organotypische hippocampusslicecultuur zonder detecteerbare bijwerkingen. Dit protocol heeft een veel hogere transfectie-efficiëntie vergeleken met andere single-celprotocollen, maar het is nog steeds relatief goedkoop en eenvoudig uit te voeren.
Deze techniek zal nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van specifieke moleculaire en fysiologische functies van neuronen, inclusief celautonome mechanismen en transsynaptische eiwitinteracties. Om sliceculturen voor elektroporatie voor te bereiden, breng de cultuurinserts van belang over naar individuele drie centimeter petrischalen geladen met 900 microliters kweekmedium, en plaats de culturen in een tafelblad koolstofdioxide-incubator. Vervolgens pre-incubeer verse cultuurinserts met één milliliter slicekweekmedium per insert in een 3,5 centimeter petrischaal gedurende minimaal 30 minuten, en steriliseer de lijnen van het elektroporatieapparaat met 10%bleekmiddel gedurende vijf minuten.
Aan het einde van de perfusie, spoel de lijnen met geïoniseerd geautoclaveerd water gedurende minimaal 30 minuten voordat u perfuseert met filtergesteriliseerde ACSF bevattende 0,001 millimolair tetrodotoxine. Stel de electroporatorpuls in op een amplitude van min vijf volt, een vierkante puls, een trein van 500 milliseconden, een frequentie van 50 hertz, en een pulsbreedte van 500 microseconden. Vul een glazen pipet met vijf microliters plasmidebevattende interne oplossing, en tik en klop voorzichtig meerdere keren op de punt om eventuele vastzittende luchtbelletjes te verwijderen.
Gebruik een dissectiemicroscoop om te bevestigen dat de punt niet beschadigd is, en bevestig de pipetpunt stevig aan de elektrode. Wanneer de punt contact maakt met de ACSF, registreer de pijpweerstandsaflezing van de electroporator. Om een slicecultuur te isoleren, snijdt de cultuurinsertmembraan met een scherp mes, en gebruik scherpe hoekige pincetten om de slicecultuur voorzichtig over te brengen naar de elektroporatiekamer.
Bevestig vervolgens de cultuurpositie met een sliceanker. Voor elektroporatie van de cellen van belang, oefen positieve druk uit op de pipet via de mond, en gebruik de driedimensionale knopbediening om de pipetpunt in de buurt van het oppervlak van de slicecultuur te manoeuvreren. Bekijk de cultuur met de microscoop, benadert de doelcel met de punt, houd de positieve druk toegepast totdat een kuiltje zich vormt op het celoppervlak.
Na visualisatie van het kuiltje, oefen snel milde negatieve druk uit via de mond zodat een losse afdichting zich vormt tussen de pipetpunt en de plasmamembraan. Het membraan zal lichtjes de pipet ingaan. Er moet een ongeveer 2,5x toename in de initiële weerstand van de pipet worden waargenomen, zoals aangegeven door een toename in toon van de luidsprekers.
Herhaal snel positieve druk zodat het kuiltje zich weer vormt. Volg dan onmiddellijk minstens twee meer drukcycli zoals zojuist gedemonstreerd zonder te pauzeren. Na de laatste drukpulsatie, houd de negatieve druk gedurende één seconde vast.
Wanneer de toon van de luidsprekers een stabiele top in toonhoogte bereikt, gebruik de voetpedaal om snel de electroporator te pulseren. Na de electroporatie, trekt u de pipet voorzichtig ongeveer 100 micrometer van de cel zonder druk uit te oefenen, en herhaal positieve druk, waarbij u verifieert dat de weerstand vergelijkbaar is met de baseline aflezing voordat u de volgende cel benadert. Wanneer alle cellen van belang zijn geëlectroporeerd, brengt u de slicecultuur over in een van de voorbereide verse cultuurinserts, en plaatst u het insert gedurende maximaal drie dagen op 35 graden Celsius.
In dit representatieve experiment werd EGFP getransfecteerd in vijf tot twintig piramidale neuronen in het hippocampale CA1-gebied over zeven, veertien en eenentwintig dagen in vitro slicecultuurleeftijd. Parvalbumine en vesiculaire glutamaat type 3 interneuronen kunnen ook succesvol worden geëlectroporeerd binnen het hippocampale CA1-gebied. Interessant is dat transfectie niet significant wordt beïnvloed door de in vitro slicecultuurleeftijd, en verschilt niet met de transfectie-efficiëntie die wordt waargenomen in CA1 piramidale neuronen.
Neuronen zijn erg kwetsbaar. U moet uiterst voorzichtig en zacht zijn bij het benaderen en drukcyklus van de cellen en het terugtrekken van de pipetpunt om ernstige schade te voorkomen. Na electroporatie kunnen de cellen worden onderworpen aan verschillende experimentele analyses, inclusief elektrofysiologie en beeldvorming.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor single-cell electroporatie dat genoverdracht mogelijk maakt in zowel excitatoire als inhibitoire neuronen in organotypische hippocampus-snedeculturen. Deze techniek maakt nauwkeurige controle over genexpressie mogelijk, wat het onderzoek naar zowel celautonome mechanismen als intercellulaire interacties over verschillende ontwikkelingsstadia faciliteert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gentransfectie
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Genetransfectie is cruciaal voor neurobiologisch onderzoek.
- Elektroporatie biedt een hoge transfectie-efficiëntie met minimale bijwerkingen.
- De methode is relatief eenvoudig en goedkoop in vergelijking met andere technieken.
- Het begrijpen van moleculaire en fysiologische functies in neuronen is essentieel voor de neurobiologie.
Doel van de studie
- Om een effectieve methode vast te stellen voor het transfecteren van genen in neuronale populaties.
- Om specifieke moleculaire functies en mechanismen te bestuderen in zowel excitatoire als inhibitoire neuronen.
- Om de transfectie-efficiëntie te evalueren bij verschillende leeftijden van slice-culturen.
Gebruikte methoden
- Elektroporatie werd uitgevoerd op organotypische hippocampusslice-culturen.
- Pyramidale neuronen en interneuronen waren de belangrijkste gebruikte biologische modellen.
- De transfectie werd beoordeeld in slices van verschillende leeftijden (7, 14 en 21 dagen in vitro).
- Gedetailleerde stappen omvatten de preparatie, pipettechnieken en het monitoren van weerstandsveranderingen.
- Celschade tijdens het proces werd geminimaliseerd door zorgvuldige manipulatie.
Belangrijkste resultaten
- Een hoge efficiëntie van gentransfectie werd bereikt in doelneuronen, zonder significante verschillen tussen de leeftijden van de plakculturen.
- Elektroporatie had geen nadelige invloed op de levensvatbaarheid en behield de cellulaire integriteit na transfectie.
- De methode maakte gedetailleerde studies mogelijk naar fysiologische responsen en potentiële interactiemechanismen tussen neuronen.
- Succesvolle transfectie van parvalbumine-positieve en vesiculaire glutamaat type 3 interneuronen werd eveneens aangetoond.
Conclusies
- Deze studie presenteert een robuust protocol voor gentransfectie in neuronale culturen, waardoor de onderzoeksmogelijkheden in de neurobiologie worden uitgebreid.
- De methode vormt de basis voor verdere onderzoeken naar neuronale mechanismen en intercellulaire functies.
- Het begrijpen van deze processen is essentieel voor inzichten in neuronale plasticiteit en potentiële therapeutische toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Single-cell elektroporatie in organotypische hippocampus-plakculturen maakt nauwkeurige genoverdracht in excitatoire en inhibitoire neuronen mogelijk, wat bijdraagt aan targetvalidatie en mechanistische risicoanalyse in neurowetenschappelijk onderzoek. De methode biedt een hoge transfectie-efficiëntie (~80%) over verschillende ontwikkelingsstadia, waardoor consistente fenotypische screening en assayontwikkeling voor de analyse van signaalpaden mogelijk zijn. Deze benadering vermindert biologische onzekerheid bij het vroege testen van target-hypothesen door reproduceerbare, kwantitatieve genexpressiestudies in ziekterelevante neuronale systemen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken in excitatoire en klas-specifieke inhibitoire neuronen van de hippocampus.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door genexpressie te koppelen aan fysiologische read-outs in intacte microcircuits.
- Operationele waarde: Behaalt een hoge transfectie-efficiëntie zonder detecteerbare bijwerkingen, waardoor de experimentele variabiliteit wordt verminderd.
- Operationele waarde: Werkt bij verschillende leeftijden van slice-culturen (7–21 dagen in vitro), wat tijdreeksstudies naar target-engagement mogelijk maakt.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde neuronale systemen voor op downstream elektrofysiologie- en imaging-assays.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve data met resolutie op single-celniveau over genfunctie en eiwitinteracties.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van standaard elektrofysiologische apparatuur, waardoor schaalbare integratie in bestaande workflows mogelijk is.
- Operationele waarde: Handhaaft de transfectie-efficiëntie over langere kweekperioden, wat longitudinale screeningcampagnes ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt ziekterellevante hippocampale circuits om doelmechanismen in pathofysiologische contexten te bestuderen.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt beoordeling van transsynaptische eiwitinteracties en celautonome mechanismen mogelijk.
- Operationele waarde: Faciliteert continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door de neuronale gezondheid na transfectie te behouden.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door betrouwbare, reproduceerbare genlevering in primaire neuronale culturen.
Integratie van pijplijn & workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, waardoor mechanische risicoreductie mogelijk is vóór de compound-screening.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking in hippocampale neuronale populaties.
- Screening: Levert assay-ready systemen met reproduceerbare transfectie en kwantitatieve output voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt resistentiegebaseerde monitoring en elektrofysiologische read-outs mogelijk om genexpressie te correleren met functionele fenotypes.
- Translationaal Onderzoek: Verbindt studies naar genfuncties met preklinische continuïteit via stabiele transfectie in organotypische coupes.
- Enterprise Hergebruik: Maakt gebruik van bestaande elektrofysiologische infrastructuur, waardoor de methode wordt gepositioneerd als een herbruikbaar platform voor de validatie van neuronale targets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door middel van hoogefficiënte, laag-toxische genoverdracht in primaire neuronen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via consistente pulsparameters en een drukcyclusprotocol.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het verminderen van mechanistische ambiguïteit bij de interactie met neuronale doelwitten.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door betrouwbare beoordeling van genfunctie over verschillende neuronale klassen en ontwikkelingsstadia.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie en micropipetmanipulatie voor targeting van enkele cellen.
- Afhankelijk van glaselektroden, een electroporator en steriele ACSF met tetrodotoxine voor het behoud van de neuronale gezondheid.
- Necessiteert standaardisatie van drukpulssequenties en weerstandsmonitoring tussen verschillende gebruikers.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijstellen van de plasmidconcentratie en de pulsbreedte voor verschillende neurontypen of genlengtes.
- Praktische beperking: De kwetsbaarheid van neuronen vereist een zorgvuldige techniek om membraanruptuur tijdens het drukcyclen te voorkomen.
