Name: In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Leer een wigvormige hersensnijtechniek om presynaptische connectiviteit te behouden voor elektrofysiologische metingen in neuronale circuits. Deze methode bootst in vivo-activiteit na en ondersteunt patch clamp-opnames.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het NIH, NIDCD, Z01 DC000091 (CJCW).

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke / National Institute on Doofness and Other Communication Disorders Animal Care and Use Committee.
1. Experimentele preparaten
OPMERKING: Details met betrekking tot de bereiding van de slice, waaronder snijoplossing, snijtemperatuur, segment incubatietemperatuur en apparatuur (enz.) zijn specifiek voor de voorbereiding van de hersenstam die in dit experiment wordt uitgevoerd. Segment incubatiedetails kunnen per laboratoriumervaring worden gewijzigd.
<ol><li>Bereid interne oplossingen voor patch-clamping.<ol>
<li>Bereid spanningsklemoplossing voor die (in mM) 76 C-methanesulfonaat bevat, 56 CsCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES, 10 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 5 Na2-fosphocreatine, 5 QX-314 en 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Pas de pH aan op 7.2 met CsOH.</li>
		<li>Bereid de huidige klemoplossing voor die (in mM) 125 K-gluconaat, 5 KCl, 1 MgCl2, 0.1 CaCl2, 10 HEPES, 1 EGTA, 0.3 Na-GTP, 2 Mg-ATP, 1 Na2-fosfocreatine en 0.01 Alexa Fluor-488 hydrazide. Pas de pH aan op 7,2 met KOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid 100 mL van 4% agar door het toevoegen van 4 g agar tot 100 mL heet (in de buurt kokend) water. Plaats op verwarmde roerplaat om de temperatuur te behouden en roer tot volledig opgelost. Giet in 100 mm plastic petrischaaltjes tot ongeveer 1 cm diepte en laat afkoelen. Koel tot het nodig is.</li>
	<li>Bereid 1 L kunstmatige hersenvocht (ACSF) met in mM: 124 NaCl, 1.2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 5 KCl, 26 NaHCO3, 1.25 KH2PO4en 10 dextrose. Bubble met carbogen (5% CO2 / 95% O2) gedurende ten minste 10 min, dan aanpassen definitieve pH tot 7,4 met 1 M NaOH indien nodig. Behoud oxygenatie en pH van de oplossing door continu borrelen met carbogen tijdens het experiment.</li>
	<li>Bereid 200 mL snijoplossing voor door 1 mM kynurenic acid toe te voegen aan ACSF. Sonicaatoplossing in een sonicerend waterbad gedurende 10 minuten tot kynurenic zuur is opgelost. Voortdurend bellen met carbogen en plaats op ijs. LET OP: Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van kynurenic acid.</li>
	<li>Monteer een passend mes in het vibratome volgens de instructies van de fabrikant. Chill vibratome snijden kamer door het omringen met ijs.</li>
</ol>2. Hersenverwijdering met intacte gehoorzenuwwortel voor stimulatie
OPMERKING: Muizen voor deze experimenten werden verkregen door het kruisen van ChAT-IRES-Cre transgene muizen op een C57BL/6J achtergrond met tdTomato reporter muizen (Ai14). Muizen die werden gebruikt voor histologie en elektrofysiologie waren post-hearing begin (P14-P23), dat is ongeveer P12 bij muizen. Neuronen die tdTomato uitdrukken in de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) werden eerder gekenmerkt als MOC-neuronen in deze muislijn57.
<ol><li>Euthanaseren (bijvoorbeeld CO 2-verstikking) en onthoofden het dier volgens goedgekeurde institutionele procedures.</li>
	<li>Met behulp van een scheermesje, snijd de huid op de middellijn van de schedel van de neus naar de achterkant van de nek. Schil de huid terug om de schedel bloot te leggen.</li>
	<li>Met behulp van kleine schaar, maak een incisie in de schedel via de middellijn vanaf de basis (caudal einde in de buurt van het ruggenmerg) van de schedel en verder naar de neus.</li>
	<li>Bij de lambda hechting, maak snijwonden in de schedel van de middellijn, laterale naar het oor aan beide zijden. Pel de schedel terug om de hersenen bloot te leggen.</li>
	<li>Beginnend bij het rostrale uiteinde, til voorzichtig de hersenen weg van de schedel met een kleine lab spatel of stompe tangen. Snijd de oogzenuw en blijven zachtjes werken de hersenen naar achteren, het blootstellen van de ventrale oppervlak.</li>
	<li>Snijd de trigeminuszenuwen door ze te knijpen met fijne tangen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam. LET OP: Doe dit zorgvuldig als de vestibulocochlear zenuw ligt net onder deze en moet intact zijn voor eventuele stimulatie.</li>
	<li>Plaats de bereiding in een glazen petrischaal gevuld met koude snijoplossing. Plaats de schotel onder een ontledenmicroscoop. Zachtjes bellen met carbogen.</li>
	<li>Trim de gezichtszenuw dicht bij de hersenstam en bloot de vestibulocochlear zenuw.</li>
	<li>Met behulp van fijne tangen, duw de tips in de foramina waar de vestibulocochlear zenuw verlaat de schedel zo ver mogelijk en knijp de zenuw om het te verbreken, waardoor de zenuwwortel verbonden aan de hersenstam. Herhaal dit aan de andere kant.</li>
	<li>Zodra beide zenuwwortels vrij zijn, verwijder de hersenvliezen en vasculatuur van het ventrale oppervlak van de hersenstam in de buurt van het trapeziumlichaam.</li>
	<li>Bevrijd de hersenen volledig van de schedel door knijpen de resterende craniale zenuwen en bindweefsel zorgen voor het resterende ruggenmerg te behouden indien mogelijk.</li>
</ol>3. Blokkeren en monteren van hersenen op het podium (magnetische schijf)
<ol><li>Bereid het oppervlak van de hersenen vast te stellen aan het stadium door het blokkeren van de hersenen op het niveau van de optische chiasm.<ol>
<li>Met het ventrale oppervlak omhoog, stabiliseer de hersenen met behulp van een stomp gereedschap om het ruggenmerg zachtjes te immobiliseren, zodat de hersenen niet kantelen tijdens de volgende stap.</li>
		<li>Op het niveau van de optische chiasm, gebruik open tangen om het vliegtuig te maken voor het blokkeren van de hersenen door het invoegen door de hersenen naar de onderkant van de schotel. Plaats de tangen onder een hoek van ongeveer 20° van verticaal, zodat de uiteinden het dorsale oppervlak van de hersenen caudal naar de optische chiasm verlaten.</li>
		<li>Snijd langs de tang met behulp van het scheermesje.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lijm de hersenen aan het oppervlak van het podium.<ol>
<li>Bereid een klein blok (~ 1 cm3) van 4% agar voor de ondersteuning van de hersenen.</li>
		<li>Plaats een kleine druppel lijm op het podium en verspreid het in een rechthoek, zodat zowel de hersenen en agar blok kan worden gelijmd.</li>
		<li>Met behulp van tangen, voorzichtig til de hersenen en zachtjes deppen van de overtollige vloeistof met behulp van de rand van een papieren handdoek. Plaats het geblokkeerde oppervlak op de lijm, ventrale oppervlak zal worden naar het blad tijdens het snijden.</li>
		<li>Duw de agar blok zachtjes tegen het dorsale oppervlak van de hersenen om het te ondersteunen tijdens het snijden en om een goede positionering van de hersenen (dat wil zeggen, hoek) te garanderen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Slice hersenen om wig slice te maken
OPMERKING: Bereid een hersenschijfje voor met behulp van vibratome met de cochleaire zenuwwortel aan de dikke kant en mediale olivocochleaire (MOC) neuronen en de mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB) aan de dunne kant.
<ol><li>Plaats de magnetische schijf met bijgevoegde hersenen op de podiumbasis en plaats deze in de snijkamer met het ventrale oppervlak van de hersenen gericht op het blad.</li>
	<li>Vul de kamer met ijskoude snijoplossing en bel met carbogen.</li>
	<li>Laat het mes in de oplossing zakken en snijd plakjes caudal naar het gebied van belang om ervoor te zorgen dat de plakjes symmetrisch zijn. Als de segmenten asymmetrisch lijken, kantelt u het podium iets om symmetrie te verkrijgen. OPMERKING: Bladsnelheden tussen 0,05-0,10 mm/s waren effectief voor het snijden van gezonde plakjes en kunnen variëren afhankelijk van de leeftijd van de dieren en het hersengebied.</li>
	<li>Zodra de plakjes symmetrisch zijn, verschuift het stadium ~15° (overeenkomend met ongeveer 3 concentrische ringen op de podiumbasis) naar één kant. OPMERKING: Verleg het stadium weg van de gehoorzenuwwortel die u in het segment wilt behouden.</li>
	<li>Blijf zorgvuldig snijden totdat de gehoorzenuwwortel aan de ene kant dicht bij het oppervlak ligt en de gezichtszenuw aan het oppervlak van de andere kant kan worden gezien.</li>
	<li>Verplaats het podium 15° naar de oorspronkelijke positie.</li>
	<li>Beweeg het mes uit de buurt van het weefsel en draai de trapbasis 90° zodat de zijdelingse rand van de dunne zijde naar het blad wordt gericht. Laat het mes enkele honderden micron zakken en breng het mes dan langzaam dicht bij de rand van het weefsel. Herhaal dit totdat het mes de zijdelingse rand raakt. Laat het blad zakken tot de gewenste dikte van de dunne rand van het plakje, hier nog eens tweehonderd micron. OPMERKING: De resulterende slice is idealiter ~ 300 mm dik op het niveau van de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) aan de kant waar patchklemmen zal plaatsvinden.</li>
	<li>Beweeg het mes terug uit de buurt van het weefsel en draai de trapbasis terug, zodat het ventrale oppervlak naar het hoofd gericht is.</li>
	<li>Maak de snede die het rostrale oppervlak van de wigschijf aanwijst. Breng het segment naar beneden op een stuk interfacepapier(1 cm 2). Verplaats het segment naar de incubatiekamer of een ander geschikt incubatieapparaat voor terugwinning (30 min bij 35 °C). OPMERKING: De gezichtszenuw moet zichtbaar zijn op beide hemisferen van het segment op het rostrale oppervlak (zie figuur 1B).</li>
</ol>5. Opzetten en opnemen van elektrofysiologie
<ol><li>Plaats het wigsegment in de opnamekamer en bevestig het segment met een harp of stabilisatiesysteem. Doorsnee het weefsel continu met een snelheid van 7-10 mL/min met warme (35 °C) ACSF borrelde met carbogen.</li>
	<li>Identificeer genetisch gelabelde MOC-neuronen in de VNTB met behulp van epifluorescentie met 561 nm emissiefilters voor patch-clamp opnames. Flip slice als er geen potentieel patchbare cellen.</li>
	<li>Met behulp van DIC optica, richten op de gehoorzenuwwortel op de dikke kant van de plak en gebruik een micromanipulator om de bipolaire wolfraam stimulerende elektrode naar beneden te verplaatsen naar de gehoorzenuwwortel en zachtjes in het oppervlak van het weefsel. OPMERKING: Zuigelektroden zijn gebruikt in auditieve zenuwstimulatie experimenten in andere laboratoria. Theta glas elektroden, of optische stimulatie methoden kunnen worden gebruikt indien van toepassing op andere specifieke preparaten.</li>
	<li>Verplaats het gezichtsveld terug naar de VNTB om een MOC-neuron te kiezen om te targeten voor patchklem elektrofysiologie.</li>
	<li>Vul een opnamepipet met de juiste interne oplossing voor het voorgestelde experiment.</li>
	<li>Patch en record van de MOC neuron in de hele cel configuratie. Compenseer membraancapaciteit en serieweerstand indien nodig.</li>
	<li>Pas de elektrische stimulatieamplitude van de gehoorzenuwwortel aan om consistente postsynaptische gebeurtenissen in het MOC-neuron te verkrijgen. LET OP: Het kan nodig zijn om de stimulatieelektrode te verplaatsen.</li>
	<li>Voer geschikte stimulatieprotocollen uit om opgeroepen synaptische stromen in MOC (spanningsklem) of actiepotentieelpatronen (huidige klem) te observeren. OPMERKING: De wig slice voorbereiding kan worden gebruikt met een typische patch-clamp tools zoals losse patch opnames, farmacologie, optogenetica, calcium imaging, neurotransmitter uncaging, enz.</li>
</ol>6. Histologische bevestiging van hersenstamkernen
LET OP: Dit wordt gedaan met cresyl violet kleuring, in vaste, opnieuw doorsneden wig schijf. Deze methode maakt visualisatie van kernen die zijn opgenomen in het segment.
<ol><li>Na het voorbereiden van een wig slice, dompel slice in fixative (4% PFA in PBS) 's nachts. Spoel het plakje 3x gedurende 10 minuten in PBS (kamertemperatuur op een shaker) en plaats vervolgens vervolgens 30% sacharose in PBS 's nachts bij 4 °C om cryoprotect te krijgen.</li>
	<li>Re-sectie van de plak op een bevriezing microtome (40-70 mm) en het verzamelen van seriële secties in een 24 put plaat in PBS.</li>
	<li>Monteer secties op gelatine gecoate glijbanen en laat volledig drogen. Plaats dia's in diawagen.</li>
	<li>Cresyl violet oplossingen voorbereiden<ol>
<li>Bereid 1% cresyl violet acetaat door het mengen van 5 g cresyl violet acetaat in 500 mL dH2O</li>
		<li>Bereid acetaatbuffer voor door eerst 90 mL-oplossing A (540 mL glaciale azijnzuur + 89,46 mL dH2O) en 10 mL-oplossing B (136 mg natriumacetaat in 10 mL dH2O) voor te bereiden. Combineer oplossing A en oplossing B die de acetaatbuffer oplevert.</li>
		<li>Combineer 1% cresyl violet acetaat met de acetaatbuffer 1:1 voor 0,5% cresylviolet in acetaatbuffer. Filter voor gebruik.</li>
		<li>Bereid 95% en 70% ethanol door 100% ethanol te verdunnen met de juiste hoeveelheden dH2O</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer cresyl violet kleuring protocol. Verplaats de schuifwagen door oplossingsbakken, blotting overtollige oplossing op een papieren handdoek tussen trays: xyleen – 5 min; 95% ethanol – 3 min; 70% ethanol – 3 min; dH2O – 3 min; 0,5% cresyl violette oplossing – 8-14 min monitoring vaak totdat nucleaire kleuring donker paars wordt; dH2O – 3 min; 70% ethanol – 3 min; 95% ethanol – 1-2 min; 100% ethanol – dip dia's tweemaal; xyleen – 5 min; xyleen: 25 min tot de montage wordt uitgevoerd. LET OP: Gebruik xylenes alleen onder een rookkap.</li>
	<li>Verwijder dia's één voor één uit xyleen en plaats onmiddellijk afdekslips op dia's met behulp van montagemedium. Laat montagemedium te drogen ('s nachts).</li>
	<li>Afbeeldingssecties.</li>
</ol>7. Biocytine-etikettering voor anterograde tracering van axonen in levend, niet-vast weefsel
<ol><li>Maak een wig slice zoals hierboven (Stappen 2-4).</li>
	<li>Breng het segment over op interfacepapier (~1 cm2). Zoek onder een ontledenmicroscoop de CN aan de dikke kant van het plakje.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig overtollige ACSF uit het gebied rond de plak door een hoek van een tissuepapier te draaien om de ACSF uit de buurt van het weefsel te trekken. Dit voorkomt dat de biocytine zich verspreidt naar omliggende gebieden van de slice die kunnen leiden tot opname in cellen buiten de CN.</li>
	<li>Selecteer met fijne tangen een klein kristal biocytine en plaats het op het oppervlak van de CN. Druk het kristal voorzichtig in het weefsel om contact met neuronen en de daaropvolgende opname in somata te bevorderen. Herhaal deze stap om de gewenste regio van belang te dekken, in dit geval CN-regio's met T-stellate en GBC neuronen.</li>
	<li>Plaats het segment in een incubatiekamer. Laat het segment 2-4 uur bij 35 °C uitbroeden om de opname en het transport van de biocytine mogelijk te maken. Na incubatie spoel je het plakje in ACSF af om biocytinedeeltjes te verwijderen.</li>
	<li>Plaats slice in fixative (4% PFA in PBS) 's nachts. Spoel 3x gedurende 10 minuten in PBS.</li>
	<li>Cryoprotect slice in 30% sacharose in PBS 's nachts bij 4 °C of totdat de slice zinkt.</li>
	<li>Resect het weefsel om dwarse delen te produceren op een ijskoude microtome op 70-100 mm.</li>
	<li>Procesweefsel met behulp van standaard immunohistochemische methoden met een fluorescerend geconjugeerd streptavidin. OPMERKING: Aanvullende immunohistochemie kan worden uitgevoerd op de secties als nuttig voor het labelen van presynaptische cellichamen, axonen, receptoren of andere synaptische moleculen die belangrijk zijn voor circuitvisualisatie (d.w.z. primaire antilichaamstappen mogen geen negatieve invloed hebben op de secundaire visualisatie van biocytine).</li>
	<li>Beeld het weefsel in.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De snijden procedure hier beschreven genoemd een wig slice is krachtig voor het behoud van intacte presynaptische neuronale circuits, maar met de toegankelijkheid van de hersenen slice experimenten voor analyse van neuronale functie. Grote zorg moet worden genomen in een aantal eerste stappen om het nut van de voorbereiding voor circuit analyse te maximaliseren. De afmetingen van de wig moeten worden bevestigd aan de hand van histologisch onderzoek, dat integraal is voor de bevestiging dat zowel presynaptische kernen als...

Observatie van de activiteit van neurale circuits wordt idealiter uitgevoerd met native zintuiglijke ingangen en feedback, en intacte connectiviteit tussen hersengebieden, in vivo. Echter, het uitvoeren van experimenten die eencellige resolutie van neurale circuit functie te geven is nog steeds beperkt door technische uitdagingen in de intacte hersenen. Terwijl in vivo extracellulaire elektrofysiologie of multifoton beeldvormingsmethoden kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van activiteit in intacte zenuwstelsels, blijft het moeilijk om te interpreteren hoe verschillende ingangen integreren of subthreshold synaptische ingangen meten. In vivo hele cel opnames overwinnen deze beperkingen, maar zijn uitdagend uit te voeren, zelfs in hersengebieden die gemakkelijk toegankelijk zijn. Technische uitdagingen van eencellige resolutie experimenten worden verder versterkt in bepaalde neuron populaties die zich diep in de hersenen, of in ruimtelijk diffuse populaties die ofwel genetische instrumenten nodig om cellen te lokaliseren in vivo (bijvoorbeeld genetische expressie van channelrhodopsine in combinatie met optrode opname) of post-hoc histochemische identificatie na opname site etikettering (bijvoorbeeld met neurotransmissie-specifieke markers). Wordt diffuus gelegen in de buurt van het ventrale oppervlak van de hersenstam, mediale olivocochlear (MOC) neuronen lijden aan de bovenstaande beperkingen1, waardoor ze zeer moeilijk te bereiken voor in vivo experimenten.
Hersensegmenten (~100-500 μm dikte) zijn al lang gebruikt om hersencircuits te bestuderen, inclusief auditieve hersenstamcircuits, vanwege de fysieke segregatie van verbonden neuronen die zich in hetzelfde segment2,3,4,5,6,7,8,9bevinden. Experimenten met veel dikkere plakjes (>1 mm) zijn in andere laboratoria gebruikt om te begrijpen hoe bilaterale ingangen integreren in gebieden van het superieure olivarycomplex (SOC), waaronder de mediale superieure olijf10,11. Deze plakjes werden zodanig bereid dat axonen van de gehoorzenuw (AN) intact bleven in de slice en werden elektrisch gestimuleerd om synaptische neurotransmitter release in de CN te starten, het nabootsen van activiteit van de eerste orde auditieve neuronen als ze zouden reageren op geluid. Een groot nadeel van deze dikke plakjes is de zichtbaarheid van neuronen voor patch-clamp elektrofysiologische opnames ("patching"). Patchen wordt steeds moeilijker als de vele axonen in dit gebied worden myelinated met de leeftijdvan 12,13,14,15, waardoor het weefsel optisch dicht en verduisterend neuronen, zelfs in een typische, dunne hersenen slice. Ons doel is om in vitro preparaten te creëren die meer lijken op de circuitconnectiviteit van in vivo opnames, maar met de hoge doorvoer en hoge-resolutie opnamemogelijkheden van visueel geleide patch-clamp elektrofysiologie in hersensegmenten.
Ons lab onderzoekt de fysiologie van neuronen van het auditieve efferentsysteem, waaronder MOC-neuronen. Deze cholinerge neuronen geven efferent feedback aan het slakkenplaat door de activiteit van buitenste haarcellen (OHC's)16,17,18,19,20te moduleren . Eerdere studies hebben aangetoond dat deze modulatie een rol speelt bij het verkrijgen van controle in het slakkenmiddel21,22,23,24,25,26 en bescherming tegen akoestisch trauma27,28,29,30,31,32,33. Bij muizen bevinden MOC-neuronen zich diffuus in de ventrale kern van het trapeziumlichaam (VNTB) in de auditieve hersenstam1. Onze groep heeft gebruik gemaakt van de ChAT-IRES-Cre muislijn gekruist met de tdTomato reporter muislijn te richten MOC neuronen in hersenstam plakjes onder epifluorescente verlichting. We toonden aan dat MOC-neuronen afferente-remmende input ontvangen van de ipsilaterale mediale kern van het trapeziumlichaam (MNTB), dat op zijn beurt wordt opgewekt door axonen van bolvormige bossige cellen (GBC) in de contralaterale cochleaire kern (CN)34,35,36,37,38. Bovendien ontvangen MOC-neuronen waarschijnlijk hun excitatory input van T-stellate cellen in de contralaterale GN39,40,41. Samen tonen deze studies aan dat MOC-neuronen zowel excitatory als remmende ingangen ontvangen die zijn afgeleid van hetzelfde (contralaterale) oor. Echter, de presynaptische neuronen, en hun axonen convergerende op MOC neuronen, zijn niet helemaal dicht genoeg bij elkaar om volledig intact in een typische coronale slice voorbereiding. Om te onderzoeken hoe de integratie van synaptische ingangen naar MOC-neuronen hun actiepotentieel beïnvloedt, met een focus op nieuw beschreven remming, ontwikkelden we een preparaat waarin we de diverse afferents naar MOC-neuronen vanuit één oor konden stimuleren op de meest fysiologisch realistische manier mogelijk, maar met de technische voordelen van in vitro brain slice-experimenten.
De wig slice is een gemodificeerde dikke slice voorbereiding ontworpen voor onderzoek van circuit integratie in MOC neuronen (schematized in figuur 1A). Aan de dikke kant van de plak, de wig bevat de afgehakte axonen van de gehoorzenuw (hierna "auditieve zenuwwortel" genoemd) als ze de hersenstam van de periferie en synaps in de CN binnendijzen. De gehoorzenuwwortel kan elektrisch worden gestimuleerd om neurotransmitter-release en synaptische activering van cellen van de volledig intacte GN42,43,44,45,46op te roepen . Dit stimulatieformaat heeft verschillende voordelen voor circuitanalyse. Ten eerste, in plaats van het direct stimuleren van de T-stellate en GBC axonen die afferent input te leveren aan de MOC neuronen, stimuleren we de AN om activering van intrinsieke circuits overvloedig in de CN mogelijk te maken. Deze circuits moduleren de output van CN-neuronen naar hun doelen in de hersenen, waaronder MOC-neuronen46,47,48,49,50,51. Ten tweede, de polysynaptische activering van afferent circuits van de AN via de CN stroomopwaarts van MOC neuronen zorgt voor meer natuurlijke activering timing en voor plasticiteit optreden bij deze synapsen als ze in vivo zou tijdens auditieve stimulatie. Ten derde kunnen we onze stimulatiepatronen variëren om EEN activiteit na te bootsen. Ten slotte zijn zowel excitatory als remmende monaurale projecties voor MOC-neuronen intact in de wigschijf, en hun integratie kan worden gemeten in een MOC-neuron met de precisie van patch-clamp elektrofysiologie. Als geheel, dit activeringsschema biedt een meer intact circuit aan de MOC neuronen in vergelijking met een typische hersenen slice voorbereiding. Deze hersenstam wig slice kan ook worden gebruikt om andere auditieve gebieden die remmende input ontvangen van ipsilaterale MNTB met inbegrip van de laterale superieure olijf, superieure olivary kern en mediale superieure olijf10,11,52,53,54,55,56te onderzoeken . Naast onze specifieke voorbereiding kan deze snijmethode worden gebruikt of aangepast om andere systemen te evalueren met de voordelen van het behoud van connectiviteit van lange-afstandsingangen en het verbeteren van de visualisatie van neuronen voor een verscheidenheid aan eencellige resolutie elektrofysiologie of beeldvormingstechnieken.
Dit protocol vereist het gebruik van een vibratome stage of platform dat ongeveer 15° kan worden gekanteld. Hier gebruiken we een commercieel beschikbare 2-delige magnetische fase waar de "fase" is een metalen schijf met een gebogen bodem geplaatst in een holle magnetische "stage base." Het stadium kan vervolgens worden verschoven om de segmenthoek aan te passen. Concentrische cirkels op de podiumbasis worden gebruikt om de hoek reproduceerbaar te schatten. Het podium en de trapbasis worden in de snijkamer geplaatst, waar ook de magnetische trapbasis kan worden gedraaid.

<table><tbody><tr><td>Experimentele voorbereidingen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar, poeder</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td>4% agarblok gebruikt om hersenweefsel tijdens vibratome-snijden te stabiliseren</td></tr><tr><td>AlexaFluor Hydrazide 488</td><td>Invitrogen</td><td>A10436</td><td>Fluorofoor gebruikt in interne oplossing om succesvolle MOC-neuron patch te bevestigen</td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>Geneses Scientific (Intramalls)</td><td>AV114</td><td>Chemische stoffen wegen</td></tr><tr><td>Dubbelzijdig scheermes</td><td>Ted Pella</td><td>121-6</td><td>Vibratome snijblad</td></tr><tr><td>Kynureninezuur (5g)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375-5G</td><td>ACSF-additief voor het snijden dat wordt gebruikt om neuronactiviteit tijdens dissectie en snijden te verminderen om de weefselgezondheid voor patch clamping te verbeteren</td></tr><tr><td>pH Meter</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>13-620-451</td><td>Oplossing pH tester</td></tr><tr><td>Kunststof petrischalen 100mm dia X 20mm</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-556-002</td><td>4% Agar Prep</td></tr><tr><td>Rolplaat met verwarming</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>11-500-150</td><td>Verwarming voor 4% Agar-voorbereiding</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectie en snijden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261-250MG</td><td>Chemisch gebruikt voor axonale tracering (geconjugeerd met Streptavidin 488)</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Amscope</td><td>SM-1BN</td><td>Voor precisiedissectie tijdens hersenverwijdering</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Fijne forceps dissectietool</td></tr><tr><td>Economy pincet #3</td><td>WPI</td><td>501976</td><td>Forceps dissectietool</td></tr><tr><td>Glazen petrischaal 150mm dia x 15mm H</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>08-747E</td><td>Dissectie schaal</td></tr><tr><td>Interfacepapier (203 X 254mm PCTE Membraan 10um)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1220823</td><td>Snijden incubatie/biocytine toediening</td></tr><tr><td>Leica VT1200S Vibratome</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td>Vibratome voor het snijden van wedge-sneden</td></tr><tr><td>Mayo schaar</td><td>Roboz</td><td>RS-6872</td><td>Dissectietool</td></tr><tr><td>Eenzijdig koolstofstaal messen</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-640</td><td>Scheermes voor dissectie</td></tr><tr><td>Specimen schijf, gericht</td><td>Leica</td><td>14048142068</td><td>Gespecialiseerde vibratome-fase voor reproduceerbaar kantelen</td></tr><tr><td>Lepeltje</td><td>FisherSci</td><td>14-375-10</td><td>Dissectietool</td></tr><tr><td>Superlijm</td><td>Newegg</td><td>15187</td><td>Gebruikt voor het lijmen van weefsel op vibratome-fase</td></tr><tr><td>Vannas Spring schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Dissectietool</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrofysiologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A1R Rechtopstaande Confocale Microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Elektrofysiologie en beeldvorming microscoop, kan elke microscoop zijn die compatibel is met elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Elektrode Borosilicaatglas met Filament OD 1,5mm, ID 1,1mm, 10 cm lang</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10</td><td>Patch clamp pipet glas</td></tr><tr><td>Elektrode Vulling MicroFil</td><td>WPI</td><td>CMF20G</td><td>Patch elektrode pipetvulling</td></tr><tr><td>Inline oplossingsverwarmer</td><td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td><td>SH-27B</td><td>Snijden perfusie systeem verwarmer</td></tr><tr><td>Multi-Micromanipulator Systemen</td><td>Sutter Intruments</td><td>MPC-200 met MP285</td><td>Micromanipulators voor patch clamp en stimulatie elektrode plaatsing</td></tr><tr><td>P-1000 horizontale pipet puller voor glazen micropipetten</td><td>Sutter instruments</td><td>FG-P1000</td><td>Patch clamp pipet puller</td></tr><tr><td>Patch-clamp versterker en Software</td><td>HEKA</td><td>EPC-10 / Patchmaster Next</td><td>Kan elke versterker/software zijn</td></tr><tr><td>Opname Kamer</td><td>Warner Instruments</td><td>RC26G</td><td>Slice "bad" tijdens opname</td></tr><tr><td>Opname Kamer Harp</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Stabiliseert slice tijdens elektrofysiologie opname</td></tr><tr><td>Snijden Incubatie Kamer</td><td>Custom Build</td><td></td><td>Verwarmde, zuurstof verrijkte houder voor snijden tijdens herstel na snijden</td></tr><tr><td>Stimulus isolatie-eenheid</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>Stimulus isolatie-eenheid voor elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Spuit 60CC</td><td>Fischer Scientific (Intramalls)</td><td>14-820-11</td><td>Elektrofysiologie perfusie vloeistof behandeling</td></tr><tr><td>Temperatuurcontroller</td><td>Warner Instruments (GSAdvantage)</td><td>TC-324C</td><td>Slice perfusie systeem temperatuurcontroller</td></tr><tr><td>Buis 1/8 OD 1/16 ID</td><td>Fischer Scientific (Intramalls)</td><td>14-171-129</td><td>Elektrofysiologie perfusie vloeistof behandeling</td></tr><tr><td>Tugsten concentrische bipolaire micro-elektrode</td><td>WPI</td><td>TM33CCINS</td><td>Stimuleer elektrode voor elektrofysiologie</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 wel Plaat</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>12-556006</td><td>Histologie snijden verzamelen en immunokleuring</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Streptavidin</td><td>Jackson Immuno labs</td><td>016-540-084</td><td>Secundaire antilichaam voor biocytine visualisatie</td></tr><tr><td>Corning Orbital Shaker</td><td>Sigma</td><td>CLS6780FP</td><td>Shaker voor immunohistochemie agitatie</td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetaat</td><td>Sigma Aldrich (Intramalls)</td><td>C5042-10G</td><td>Cellulaire kleuring voor histologie</td></tr><tr><td>Wegneembare Microtome Bladen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-210-052</td><td>Schuifmicrotoom blad</td></tr><tr><td>Filter-spuit Nalgene 4mm Cellulose Acetaat 0,2um</td><td>Fisher Scientific (Intramalls)</td><td>09-740-34A</td><td>Spuitfilter voor het vullen van opname pipetten met interne oplossing</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Dia Montage Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>Immunohistochemische fluorescentie montage

in vitro wedge slice voorbereiding voor het nabootsen van in vivo neuronal circuit connectiviteit

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice elektrofysiologie technieken meten eencellige activiteit met nauwkeurige elektrische en temporele resolutie. Hersenen plakjes moeten relatief dun zijn om goed te visualiseren en toegang neuronen voor patch-clamping of imaging, en in vitro onderzoek van de hersenen circuits is beperkt tot alleen wat fysiek aanwezig is in de acute slice. Om de voordelen van in vitro slice experimenten te behouden met behoud van een groter deel van de presynaptische kernen, ontwikkelden we een nieuwe slice voorbereiding. Deze "wedge slice" is ontworpen voor patch-clamp elektrofysiologie opnames om de diverse monaurale, geluid-gedreven ingangen te middenn olivocochleaire (MOC) neuronen in de hersenstam te karakteriseren. Deze neuronen ontvangen hun primaire afferent excitatory en remmende ingangen van neuronen geactiveerd door stimuli in het contralaterale oor en overeenkomstige cochleaire kern (CN). Een asymmetrische hersenen slice werd ontworpen die het dikst is in de rostro-caudal domein aan de zijdelingse rand van een halfrond en vervolgens dunt naar de laterale rand van het andere halfrond. Dit segment bevat, aan de dikke kant, de auditieve zenuwwortel die informatie over auditieve stimuli naar de hersenen brengt, de intrinsieke CN-circuits, en zowel de disynaptische excitatory als trisynaptische remmende afferentepaden die samenkomen op contralaterale MOC-neuronen. Opname wordt uitgevoerd van MOC neuronen aan de dunne kant van het segment, waar ze worden gevisualiseerd met behulp van DIC optica voor typische patch-clamp experimenten. Directe stimulatie van de gehoorzenuw wordt uitgevoerd als het in de auditieve hersenstam, waardoor voor intrinsieke CN circuit activiteit en synaptische plasticiteit optreden bij synapsen stroomopwaarts van MOC neuronen. Met deze techniek kan men in vivo circuitactivering zo dicht mogelijk binnen het segment nabootsen. Deze wig slice voorbereiding is van toepassing op andere hersencircuits waar circuit analyses zouden profiteren van het behoud van upstream connectiviteit en lange afstand ingangen, in combinatie met de technische voordelen van in vitro slice fysiologie.

Histologisch onderzoek van wigschijf Voor ons onderzoek van auditieve hersenstam neuron functie, de wig slice voorbereiding is ontworpen om de auditieve zenuwwortel en CN contralaterale bevatten met de MOC neuronen gericht op opnames (voorbeeld slice weergegeven in figuur 1B). Eerste histologische onderzoek van het preparaat is belangrijk om te bevestigen dat de slice bevat de kernen die nodig zijn voor circuit activering en dat axonale projecties intact zijn. Twee celtyp...

Integratie van diverse synaptische ingangen naar neuronen wordt het best gemeten in een preparaat dat alle pre-synaptische kernen voor natuurlijke timing en circuit plasticiteit behoudt, maar hersenen plakjes meestal verbreken veel verbindingen. We ontwikkelden een gemodificeerde hersenen slice na te bootsen in vivo circuit activiteit met behoud van in vitro experimentatie vermogen.

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Brain slice experimenten maken ondervraging van neuronale functie met een hoge elektrische en temporele resolutie, maar deze plakjes meestal verbreken veel presynaptische verbindingen. Een wigvormige plak behoudt een meer intacte presynaptische circuits. Deze gemodificeerde hersenen slice onderhoudt een meer complete in vivo-achtige neuronale circuit, terwijl het verstrekken van de voordelen van in vitro experimenten, zoals visueel geleide patch klem opnames, farmacologie, en activiteit imaging.Nauwkeurige in plakjes gesneden geometrie kan worden geschat op basis van de atlaslocaties van de neuronen in het circuit, maar de integriteit van de presynaptische schemata en axonen moet worden bepaald met behulp van histologie. Begin met het gebruik van een scheermesje om de huid te snijden op de middellijn van de schedel van de neus naar de achterkant van de nek. Pel de huid terug om de schedel bloot te stellen en te beginnen aan de basis van de schedel en verder naar de neus te gaan, gebruik kleine schaar om een incisie in de schedel door de middellijn te maken.Bij de lambda hechting, maak snijwonden in de schedel van de middellijn lateraal naar het oor aan beide zijden om de schedel te

in-vitro-wedge-slice-preparation-for-mimicking-vivo-neuronal-circuit

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen...

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse's brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

The video describes the electrophysiological recording of retinogeniculate and corticogeniculate synapses in mouse brain slices. The slices containing the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) are placed in a recording chamber. A stimulating pipette is positioned on either the optic tract to stimulate retinal ganglion cells (RGCs) and investigate retinogeniculate synapses or the nucleus reticularis thalami to stimulate cortical neurons and investigate corticogeniculate synapses. Upon...

An Electrophysiological Study of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapses in Mouse Brain Slices

This video demonstrates a protocol for stimulating the auditory nerve root and recording postsynaptic currents in medial olivocochlear neurons in mouse brain wedge slices.

Auditory Nerve Root Stimulation and Postsynaptic Current Recordings in a Mouse Brain Wedge Slice

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Patch-clamp opnames en gelijktijdige intracellulaire biocytinevulling van synaptisch gekoppelde neuronen in acute herfsneden maken een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen mogelijk. Het doel van dit protocol is om de essentiële technische stappen van elektrofysiologisch opnemen van neuronale microcircuits en hun daaropvolgende morfologische analyse te beschrijven.

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van horizontale hippocampal-entorhinal cortex (HEC) plakjes van muizen die spontane scherpe golf rimpelactiviteit vertonen. Plakjes worden geïncubeerd in een vereenvoudigde interface-holdingkamer en opnames worden uitgevoerd onder ondergedompelde omstandigheden met snelstromende kunstmatige cerebrospinale vloeistof om weefsel oxygenatie en de spontane opkomst van activiteit op netwerkniveau te bevorderen.

Acute muis hersenen snijden om spontane Hippocampal Netwerk activiteit te onderzoeken

We presenteren een protocol om acute plakjes te bereiden van de dorsaal-intermediaire hippocampus van muizen. We vergelijken dit transversale preparaat met coronale snijden in termen van kwaliteit van opnames en behoud van morfologische kenmerken van opgenomen neuronen.

Voorbereiding van acute plakjes van Dorsale Hippocampus voor hele celopname en neuronale reconstructie in de dentaat gyrus van volwassen muizen

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Leer een wigvormige hersensnijtechniek om presynaptische connectiviteit te behouden voor elektrofysiologische metingen in neuronale circuits. Deze methode bootst in vivo-activiteit na en ondersteunt patch clamp-opnames.

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

Meer video's verkennen