Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye
14 januari 2021
Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.
Deze nieuwe efficiënte methode voor het isoleren van subpopulaties van spermatocyten en spermatids van volwassen muizen kan worden gebruikt om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan meiose en spermatogenese te onderzoeken. Deze methode maakt gebruik van een lage cytotoxiciteit DNA bindende kleurstof met een breed excitatiespectrum dat kan worden toegepast op de meeste momenteel gebruikte FACS orders. Deze methode is zeer eenvoudig.
Het meest uitdagende aspect is de stroom cytometrie gating, maar de gedetailleerde gating strategie moet helpen bij het aanpassen van het protocol aan andere cellen sorteerders. Het aantonen van de procedure zal Yu-Han Yeh, een onderzoeksassistent van Satoshi Namekawa's Laboratory. Na het oogsten van beide teelballen van een acht weken oude mannelijke muis, plaats de weefsels in een 60 millimeter petrischaal met twee milliliter ijskoude PBS en verwijder de tunica albuginea.
Scheid de teelballen voorzichtig met tangen om de halfniferous tubuli lichtjes te verspreiden. En breng de tubuli in een druppel verse ijskoude PBS in een 100 millimeter petrischaal. Gebruik de tangen om de tubuli voorzichtig te ontwarren en de tubuli te wassen in drie extra druppels PBS zoals net is aangetoond.
Na de laatste wasbeurt, plaats de ontwarrende halfniferous tubuli in een 15 milliliter buis, met twee milliliter dissociatie buffer voor een 20-minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Gebruik aan het einde van de incubatie een pipet van 1000 microliter om de tubuli 20 keer voorzichtig te pipetten, voordat u de buis nog eens zes minuten terugzet naar de couveuse. Aan het einde van de incubatie, pipet de weefsels een extra 20 keer, alvorens de buis terug te keren naar de incubator.
Na drie minuten, voorzichtig pipette de tubuli 10 keer of totdat er geen zichtbare weefsel stukken blijven, alvorens het stoppen van de dissociatie met 10 milliliter FACS buffer. Vervolgens, centrifuge naar het weefsel suspensie twee keer met behulp van een extra 10 milliliter voor verse FACS buffer voor de tweede wasbeurt om de spermatozoa en zo veel mogelijk puin te verwijderen. Om de cellen te bevlekken voor stromingscytometrische analyse, schort u de pellet opnieuw op in drie milliliter FACS-buffer.
En filter de celopening door een 70 micron nylon celzeef, in een buis van 50 milliliter. Na het tellen, breng 10% van de cellen in een nieuwe buis op ijs als de onbevlekte negatieve controle. En meng grondig zes microliters van DCV vlek in de resterende celsuspensie.
Na een 30 minuten durende incubatie bij 37 graden Celsius in het donker met zachte schudden om de 10 minuten, voeg vijf microliters van DNase I aan de cellen. En filter de cellen door een 35 micron nylon mesh zeef in een vijf milliliter FACS buis op ijs. Voor de cytometrische analyse van de cellen voor stroomcytometrische analyses maakt u een nieuw experiment in de stroomanalysesoftware en klikt u onder het menu werkbladgereedschappen op nieuwe dichtheid om een forward scatter area versus backscatter area density plot op een lineaire schaal te maken.
Klik op nieuw histogram om een DCV-blauw histogramplot op een logaritmische schaal te maken. En klik op start en record om te beginnen met het verwerken van het niet-opgenomen monster. Terwijl het monster wordt uitgevoerd, klikt u op detector- en drempelinstellingen om zowel de PMT-spanningen voor heen als aan de zijkant aan te passen om de niet-gekleurde cellen op de schaal van het voor- en achterstuiverplot te plaatsen.
Pas de PMT-spanning voor het jappy-kanaal aan om de positie van de DCV-negatieve populatie in het eerste decennium van de DCV-blauwe histogramlogaritmische plot te lokaliseren. Klik vervolgens op stop om het niet-bevlekte monster te lossen. Nadat u het bevlekte monster kort hebt gevorkt en geladen, klikt u op de volgende buis om een nieuw werkblad voor het monster te maken.
Stel de cytometer in om ten minste één keer 10 te verwerven op de zes gebeurtenissen en klik op start en record. Klik vervolgens op nieuwe dichtheid om voorwaartse spreidingshoogte versus voorwaartse spreidingsbreedte te maken. En DCV blauw versus DCV rode dichtheid percelen op een lineaire schaal.
Gebruik op het voorste verspreidingsgebied versus backscatter gebiedsdichtheidsperceel het gereedschap veelhoek om een poort te tekenen die cellen wordt genoemd om de meeste cellen op te nemen en om kleine brokstukken uit te sluiten. Pas deze poort toe op de voorwaartse spreidingshoogte versus voorwaartse spreidingsbreedte en gebruik het rechthoeksgereedschap om de poort van een enkele cel te tekenen om niet-enkele cellen uit te sluiten. Pas de poort van de enkele cel toe op het dcv-blauwe versus DCV-rode dichtheidsplot en pas de schaal aan om een uitgebreid profiel vast te leggen.
Gebruik het gereedschap veelhoek om een DCV-poort te tekenen om de niet-gekleurde cellen en zijpopulatie uit te sluiten en de poort toe te passen op een DCV-blauw histogramplot op lineaire schaal. De drie grote pieken verwijzen naar de verschillende 1C, 2C en 4C DNA-inhoud. Maak een tweede DCV-blauw versus DCV-plot met rode dichtheid op een lineaire schaal.
En achter poort de DCV poort op het perceel om de 1C en 4C populaties te lokaliseren. Maak een ander DCV-blauw versus DCV-plot met rode dichtheid op een lineaire schaal. En gebruik de ellips tool om een poort te trekken op de 1C bevolking.
Gebruik het veelhoekgereedschap om de 4C-populatie te bek toegangspoortigen met een continue curve. En maak een ander DCV blauw versus DCV rode dichtheid plot op een lineaire schaal. Gebruik het veelhoekgereedschap om een 4C one gate te maken.
In een nieuwe voorwaartse strooi plot, gebruik maken van de ellips tool om pachytene, diplotene en leptoteen, zygotene spermatocyte poorten te creëren. Wanneer alle poorten zijn getekend, maak een nieuwe DCV blauw versus DCV rode kleur stip plot op een lineaire schaal om de voor 4C poort toe te passen om ervoor te zorgen dat de drie populaties zijn in een continue volgorde binnen de poort. Maak vervolgens een nieuw voorwaarts spreidingsgebied versus backscattergebied dichtheid plot op een lineaire schaal, en selecteer de uniforme grootte van cellen als een zuivere ronde spermatid populatie.
Na het sorteren liggen de representatieve zuiverheid van het gescheiden leptoteen, zygotene, pachytene en diplotene spermatocytenfracties meestal tussen de 80%tot 90%, zoals bevestigd door SYCP3 en Gamma H2AX immunostaining. De zuiverheid van de ronde spermatid factie kan worden bevestigd door nucleus kleuring met DCV in combinatie met Sp56 en H1t kleuring, en is ook meestal rond 90%De levensvatbaarheid van de geïsoleerde cel populaties is meestal meer dan 95%En de gemiddelde totale opbrengsten van elke fractie van een enkele volwassen muis is meestal voldoende voor verschillende downstream analyse. De gesorteerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende next generation sequencing analyse om genexpressie en regulatie tijdens spermatogenese beter te verkennen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudige methode voor het isoleren van levende meiotische en post-meiotische kiemcellen uit de testikels van volwassen muizen. Door gebruik te maken van een DNA-bindende kleurstof met een lage cytotoxiciteit en fluorescence-activated cell sorting (FACS), kunnen onderzoekers sterk verrijkte spermatogene celpopulaties verkrijgen voor diverse toepassingen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Reproductieve biologie
Achtergrond
- De isolatie van spermatogene cellen is cruciaal voor het bestuderen van meiose en spermatogenese.
- Huidige methoden kunnen een hoge cytotoxiciteit vertonen, wat de cellevensvatbaarheid beperkt.
- Deze methode is erop gericht de cellevensvatbaarheid tijdens de isolatie te verbeteren.
- Gating via flowcytometrie is een kritische stap in het proces.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een efficiënt protocol voor het isoleren van spermatocyten en spermatiden.
- Het faciliteren van het onderzoek naar moleculaire mechanismen in de meiose.
- Het bieden van een gedetailleerde gating-strategie om het protocol aan te passen voor andere cell sorters.
Gebruikte methoden
- Het oogsten van de testikels van volwassen mannelijke muizen.
- Het gebruik van een DNA-bindende kleurstof met lage cytotoxiciteit en violette excitatie.
- Het toepassen van fluorescence-activated cell sorting (FACS).
- Het implementeren van een gedetailleerde gating-strategie voor flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levende meiotische en post-meiotische kiemcellen.
- Hoge verrijking van spermatogene celpopulaties.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van de methode op verschillende FACS-systemen.
- Provision van een straightforward protocol voor onderzoekers.
Conclusies
- De methode verbetert de levensvatbaarheid van geïsoleerde kiemcellen.
- Het biedt een waardevol instrument voor het bestuderen van spermatogenese.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoeken van genetische en epigenetische factoren bij meiose omvatten.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
De isolatie van levende spermatogene subpopulaties maakt mechanistische risicoanalyse van targets in de reproductieve biologie en therapeutische ontdekkingen gericht op de kiemlijn mogelijk. De methode ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij target-validatie door levende cellen met een hoge zuiverheid te leveren voor downstream omics en functionele assays. De compatibiliteit met standaard violet-laser FACS-platforms verbetert de toegankelijkheid en schaalbaarheid binnen discovery-workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen in meiotische en spermatogenetische pathways te onderzoeken met gebruik van gezuiverde leptoteen/zygotoon, pachyteen en diplotene spermatocytenfracties.
- Operationele waarde: Biedt een kleuringsmethode met een lage cytotoxiciteit die compatibel is met veelgebruikte cel sorters met violette laser, waardoor drempels voor apparatuur worden verlaagd.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de isolatie van levende cellen met een viabiliteit van >95% voor functionele follow-up.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve DNA-gehalte-uitlezingen (1C, 2C, 4C) via DCV-kleuring, wat gestandaardiseerde ploiditeitsgebaseerde gating mogelijk maakt voor de reproduceerbaarheid van de assay.
- Operationele waarde: Faciliteert de bereiding van enkelcel-suspensies uit muizentestikels, een kritische upstreamstap voor FACS-gebaseerde screeningspipelines.
- Wetenschappelijke waarde: Levert hooggezuiverde spermatiden- en spermatocytenfracties (80–90% zuiverheid) die geschikt zijn voor consistente downstream-toepassingen zoals RNA-seq.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterelatoir systeem voor het bestuderen van genetische en epigenetische regulatoren van meiose, wat de afstemming van target naar hypothese ondersteunt.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische validatie door levensvatbare kiemcellen te leveren voor mechanistische studies.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistische ambiguïteit bij de validatie van kiemlijn-targets te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypothesen tot de identificatie van lead-verbindingen, in het bijzonder voor therapeutica die de kiemlijn moduleren en waarbij de cellulaire context cruciaal is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door het isoleren van gedefinieerde meiotische stadia voor moleculaire profilering.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde dissociatie- en kleuringsprotocollen die een consistente kwaliteit van de cellsuspensie opleveren.
- Analytics: Levert ploiditeits-opgeloste, kwantitatieve readouts via DCV-fluorescentie, waardoor vergelijking van cellulaire toestanden over verschillende experimentele condities mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door een muizenmodel te bieden met translationele relevantie voor de menselijke spermatogenese.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare FACS-compatibele workflow voor het isoleren van levende kiemcellen over meerdere projecten en doelwitklassen heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische helderheid in de meiotische progressie.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via een gedetailleerde gating-strategie en het gebruik van kleurstoffen met een lage cytotoxiciteit.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go beslissingen door het verminderen van biologische risico's in een laat stadium binnen programma's voor reproductieve targets.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kiemlijn-targets mogelijk op basis van functionele validatie in gezuiverde celpopulaties.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie gating en fluorescentiecompensatie voor multi-parameter DCV-analyse.
- Afhankelijk van toegang tot FACS-instrumentatie met violette laser-excitatiecapaciteit (405 nm).
- Maakt standaardisatie van weefseldissociatie en kleuringstijden tussen operators en laboratoria noodzakelijk.
- Aanpassing naar andere modelsystemen kan optimalisatie van de dissociatiebuffer en incubatiecondities vereisen.
- Praktische beperking: De methode is momenteel gevalideerd in testikels van volwassen muizen; toepasbaarheid op onrijp of menselijk weefsel vereist verder onderzoek.
