Bovine Ovarian Cortex Weefselkweek

Dit protocol maakt een in vitro diepgaand onderzoek van de ovariële micro-omgeving mogelijk. Gebruikers in staat stellen om follikelgroei en -ontwikkeling te bepalen, evenals steroidogenese en overvloed aan immuunmoleculen. Een voordeel van deze techniek is het vermogen om veranderingen in de ovariële micro-omgeving en opkomende follikels direct te evalueren en het unieke samenspel te beoordelen dat wordt veroorzaakt door de toevoeging van specifieke hormonen.

Deze techniek kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan reproductieve stoornissen te bestuderen die folliculaire arrestaties veroorzaken. Bijvoorbeeld polycysteus ovariumsyndroom. Omdat we de ovariële micro-omgeving in vitro direct kunnen evalueren, zal brooke Bell, een niet-gegradueerde onderzoeker uit mijn laboratorium, de procedure demonstreren.

Gebruik een cerated kaaktang, zet de eierstok vast, snijd in tweeën en begin met het verwijderen van buitenplakken. Ervoor zorgen dat niet meer dan een oppervlak van één tot twee millimeter van de eierstok wordt weggesneden, zodat er geen medulla wordt verzameld. Snijd drie tot vier dunne reepjes van de ovariële cortex met een scalpel en plaats de stroken in de derde met PBS gevulde petrischaal.

Snijd de reepjes in kleine vierkante stukjes van 0,5 tot één kubieke millimeter met een scalpelmesje. Gebruik een liniaal onder de petrischalen om ervoor te zorgen dat de stukken van vergelijkbare grootte en dikte zijn om consistente stukken van de ovariële cortex te maken. Was ovariële corticale stukjes in alle drie de PBS- en antibioticaveld petrischalen, met behulp van gebogen tiptangen om de stukken tussen wasbeurten te verplaatsen.

Beweeg cortexstukken door de reeks LB-15-wasbeurten en plaats ze in een laatste met LB-15 gevulde petrischaal. Label het deksel met de dierlijke ID en de ovariële zijde. Verzamel vier stukjes ovariumcortex per eierstok en fixeer ze voor dag nul histologie en vries extra stukken in voor RNA-zuivering.

Gebruik de resterende weefselstukken voor kweek. Bereid een biologische veiligheidskast voor op een laatste weefselwas- en kweekvoorbereiding. Ontsmet benodigdheden met 70% ethanol voordat u ze in de biologische veiligheidskast plaatst.

Verplaats alle stukken van de ovariële cortex die bedoeld zijn voor kweek naar de biologische veiligheidskast en was ze nogmaals in een met LB-15 gevuld petrischaaltje. Pipetteer 350 microliter Waymouth medium per put in een 24 well tissue kweekplaat. Plaats ongecoate kweekputten in elke put met behulp van een tang en zorg ervoor dat er geen bubbels worden gevormd onder de basis van het inzetstuk.

Plaats zorgvuldig en voorzichtig vier stukken van de ovariële cortex op het gaas van elke insert zonder het gaas te doorboren. Incubeer het weefsel bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verander het medium van de ovariële cortexcultuur dagelijks gedurende zeven dagen en zorg ervoor dat u voorverwarmd Waymouth-medium gebruikt.

Gebruik tijdens de mediumwisselingen een tang om het inzetstuk voorzichtig uit de put te tillen en het gekweekte Waymouth-medium in buizen van 0,5 milliliter te verzamelen. Plaats het inzetstuk terug in de put en voeg 350 microliter vers kweekmedium toe door het tussen de zijkant van het inzetstuk en het putje te doseren. Bewaar het verzamelde medium uit de weefselkweek bij min 20 graden Celsius.

Na zeven dagen cultuur, beeld de ovariële cortex stukken met behulp van een dissectiemicroscoop met een aangesloten camera en een computer imaging software programma. Fixeer twee stukken ovariumschors per put in Bouin's oplossing voor histologie en flash freeze naar ovarium cortex stukken in vloeibare stikstof om RNA voor cDNA te verkrijgen. Herhaal deze stap voor alle putjes met weefsel en verzamel het medium vanaf dag zeven en bewaar het min 20 graden.

Laat de stukjes ovariumschors ongeveer 1,5 uur ondergedompeld blijven in bouin's oplossing, was ze vervolgens drie keer met 70% ethanol, houd het weefsel in 70% ethanol en ruim het dagelijks totdat de oplossing niet langer geel is. Hematoxyline- en eosinekleuring werd uitgevoerd voor primordiale follikels, vroege primaire follikels, primaire follikel, secundaire follikel en antrale follikel. Follikelstadiëring werd uitgevoerd op een ovariële cortex die vóór en na de kweek was gefixeerd om folliculogenese te beoordelen.

Het verschil in morfologie zoals bepaald door collageenafzetting kan wijzen op fibrose in de ovariële cortex van traptrede of controle vaarzen. Een vergelijking van het gemiddelde gebied van picrosirius rode positieve kleuring per ovariële cortex gevuld tussen controle- en traptrede vaarzen wordt hier getoond. Dagelijkse verzameling van kweekmedium werd gedurende drie dagen samengevoegd om de gevarieerde steroïde hormoonproductie te beoordelen, met behulp van een radioimmunoassay.

Steroïde metabolieten en cytokineproductie werden ook gemeten in het kweekmedium van de ovariumschors uit één put voor elk dier, gepoold gedurende vier dagen cultuur. Hoe langer het weefsel zit, hoe moeilijker het kan zijn om mee te werken. Mogelijk moet u precieze sneden oefenen.

Deze techniek wordt gebruikt om de effecten op signaaltransductieroutes te begrijpen om overmatige steroidogenese te redden om de effecten van overtollige steroïden op cytokine- en chemokineproductie te bepalen en om de effecten op follikelprogressie of arrestatie in het eierstokweefsel te bepalen.