Conjunctivale commensale isolatie en identificatie bij muizen
1 mei 2021
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie en versterking van aerobe en facultatieve anaerobe muisconjunctivale commensale bacteriën met behulp van een uniek oogswab en op cultuur gebaseerde verrijkingsstap met daaropvolgende identificatie door microbiologische methoden en MALDI-TOF massaspectrometrie.
Deze methode identificeert levensvatbare oculaire conjunctivale micro-organismen, wat een uitdaging is vanwege de vijandige omgeving van de ogen. Het kan helpen beantwoorden of een oculaire microbioom bestaat en hoe bacteriële aanwezigheid verandert in oogaandoeningen. In tegenstelling tot DNA-sequencing, die zowel levensvatbare als niet-levensvatbare micro-organismen identificeert, identificeert deze methode alleen levensvatbare micro-organismen, wat resulteert in een duidelijker begrip van de oculaire commensale gemeenschap.
Studies suggereren dat moeilijk te diagnosticeren oogziekten zoals niet-auto-immuun en auto-immuun droge ogen unieke oculaire bacteriële aanwezigheid hebben. Deze methode kan worden gebruikt om oogziekten te diagnosticeren met onderscheidende microbiële handtekeningen. Begin met het autoclaaf van de juiste hoeveelheid katoenen batting en tandenstokers voor het aantal muizen dat moet worden uitgewist, knijp vervolgens 1/2 een centimeter lang stuk katoenen batting af en plaag het door aan de randen te trekken om een vlakke enkele poreuze laag te vormen die stopt net voordat het slaan uit elkaar valt.
Wervel het slaan rond een van de scherpe uiteinden van de tandenstoker door het uitgerekte stuk lichtjes op de tandenstokerpunt te houden terwijl het gedraaid is. Het afgewerkte oogdoekje heeft een zeer dunne laag katoen die over de punt is uitgerekt en zich ongeveer 1/2 tot een centimeter van de punt uitstrekt. Steek de wattenstaafjes in een klein bekerglas, veeg ze met de andere kant naar beneden en dek ze af en autoclaveer ze.
Reinig het werkgebied met een ontsmettingsmiddel om besmetting te minimaliseren en voer 0,5 milliliter steriele hersenhartinfusie of BHI-media in gelabelde steriele microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter. Sluit de buizen af in een rek en zet het rek op ijs. Stel de workflow in van links naar rechts, te beginnen met het anesthesiestation van de muis, dat de kooi bevat met de experimentele muizen, lege steriele kooi, anesthesie op kamertemperatuur, een naald van 25 gauge en een spuit van één milliliter.
Bereid vervolgens een oogdoekstation voor dat de aliquoted BHI op ijs, gesteriliseerde oogswabs, smerende oogdruppels, biogevaarlijke container, schone papieren handdoeken en 70% isopropanolspray bevat. Zet ten slotte het beplatingsstation op met bloedagarplaten op kamertemperatuur, een pipet van 10 microliter, steriele wegwerptips van 10 microliter en een biogevaarlijke afvalcontainer. Zorg ervoor dat de muis goed wordt verdoofd door in een achtervoetkussen te knijpen.
Ga alleen verder als er geen beweging is. Wijs één hand toe om verdoofde muizen te behandelen en de andere handen om het oogswab en de cultuur te hanteren. Haal de muis uit de kooi en plaats deze bovenop het werkoppervlak dat op zijn kant is geplaatst terwijl het linkeroog wordt blootgesteld.
Spuit gehandschoende handen met isopropanol en droog ze met een papieren handdoek. Ontscap de gelabelde BHI microcentrifugebuis met de speciale mediahandgreep en plaats de twee terug in het rek. Dompel de met katoen beklede punt van het oogdoekje in de BHI en trek het wattenstaafje uit de buis terwijl u de punt twee keer tegen de binnenband wervelt om overtollige vloeistof te verwijderen en te verwijderen.
Houd de muis met de hand voorzichtig bij het nekvel. Plaats met de andere hand de punt van het oogdoekje tegen het mediale conjunctivale gebied van het linkeroog. Druk de oogbol licht in en beweeg het wattenstaafje in een raamwasbeweging tussen het onderste ooglid en het oog 10 keer, met constante druk.
Zonder de vacht aan te raken, verwijdert u voorzichtig de punt van het wattenstaafje loodrecht op waar het is ingebracht. Plaats het wattenstaafje met de wattenstaafjezijde naar beneden, direct in een gelabelde microcentrifugebuis met BHI-media. Breng een oogdruppel aan op het uitgewten oog.
Neem indien gewenst huid- of pelsdoekjes voor controlemonsters en steriliseer handschoenen op de juiste manier tussen elk wattenstaafje. Als u klaar bent, keert u de muis terug naar de kooi. Laat het wattenstaafje 10 tot 15 minuten op ijs staan, steriliseer vervolgens gehandschoende handen en verwijder het wattenstaafje terwijl u de punt gedurende 10 omwentelingen in het medium mengt.
Trek het wattenstaafje terug door de punt vijf keer tegen de binnenwand van de buis te draaien en gooi het weg in een biogevaarlijke container. Herhaal het proces voor elke muis. Verrijk het monster door de buis een uur statisch te incuberen bij 37 graden Celsius.
Label tijdens de incubatie één TSA-plaat op kamertemperatuur per muisoogdoekje of controledoekje en verdeel het in tweeën. Haal de verrijkte monsters uit de incubator en leg ze op ijs. Draai de monsters kort om te mengen, aliquot vervolgens 10 microliter van het monster op de TSA-plaat en kantel de plaat om een strip te vormen.
Herhaal dit twee keer. Maak aan de andere kant van de scheidingslijn 10 stippen met elk 10 microliter monster. Incubeer de platen gedurende 18 uur, twee dagen en vier dagen op 37 graden Celsius in een schone kamer die voorkomt dat agarplaten drogen.
Tel de kolonies in de stroken. Noteer morfologie en bereken kolonievormende eenheden per wattenstaafje voor morfologisch vergelijkbare isolaten. Kijk naar de stippen waar unieke organismen niet worden gevangen in de stroken.
Om de visualisatie te vergemakkelijken, hebben we bacteriën dicht in de middelste en rechterplaten geplateerd. Meestal zagen we veel minder bacteriën in oogswabplaten. Merk op dat de oogdoekjes soms geen herwinbare bacteriën opleveren.
Een representatieve oogswabplaat met morfologisch diverse isolaten van een C57 zwarte zesmuis wordt hier getoond. Voor elk afzonderlijk isolaat werden de kolonies in de strook geteld en werd de relatieve overvloed berekend en uitgezet. Voor microbiologische karakterisering werden bacteriën uit individuele muisoogswabplaten geplukt om een master TSA-plaat te produceren.
Toen de groei verscheen, werden aanvullende tests uitgevoerd om de microben te karakteriseren of te identificeren. De hoofdplaat werd gebruikt om voldoende entmateriaal te leveren om de respectieve isolaten uit te breiden. Om isolaten te identificeren, werd een TSA-plaat 's nachts gestreept en geïncubeerd en werd MALDI-TOF MS uitgevoerd.
Voorbeelden van hier getoonde isolaten werden geïdentificeerd als Streptococcus acidominimus en Aerococcus viridans. Significant verschillende niveaus van commensale organismen werden teruggevonden van mannelijke en vrouwelijke C57 zwarte zes muizen. Streptococcus acidominimus, Aerococcus viridans coagulates negatieve Stafylokokken en E.coli werden geïsoleerd uit C57 zwarte zes N muizen.
Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het beste resultaat wordt bereikt door het wattenstaafje dun te coaten en tijd te nemen tijdens de ooguitstrijkstap. Als de toegang tot MALDI-TOF MS beperkt is, kunnen de isolaten worden geïdentificeerd door microbiologische en biochemische tests.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren en amplificeren van aerobe en facultatief anaerobe commensale bacteriën uit het conjunctiva van muizen. Er wordt gebruikgemaakt van een unieke oogswab en een cultuurgebaseerde verrijkingsstap, gevolgd door identificatie met microbiologische methoden en MALDI-TOF-massaspectrometrie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbiologie
- Oftalmologie
- Commensale bacteriën
Achtergrond
- Het identificeren van levensvatbare micro-organismen in het conjunctiva van het oog is uitdagend vanwege de vijandige omgeving van het oog.
- Deze methode richt zich op levensvatbare micro-organismen, wat een duidelijker inzicht geeft in de commensale gemeenschap van het oog.
- Unieke bacteriële signaturen kunnen geassocieerd zijn met oogziekten die moeilijk te diagnosticeren zijn.
- De methode verschilt van DNA-sequencing, waarbij zowel levensvatbare als niet-levensvatbare micro-organismen worden gedetecteerd.
Doel van de studie
- Om het bestaan van een oculair microbioom vast te stellen.
- Om te onderzoeken hoe de bacteriële aanwezigheid verandert bij oogziekten.
- Om een diagnostische methode voor oogziekten te ontwikkelen op basis van microbiële signaturen.
Gebruikte methoden
- Autoclaveren van wattenpluis en tandenstokers voor het afnemen van swabs bij muizen.
- Afnemen van swabs van het conjunctivale gebied van muizen met het geprepareerde wattenpluis.
- Kweekgebaseerde verrijking van geïsoleerde bacteriën.
- Identificatie van bacteriën met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie.
Belangrijkste resultaten
- Levende micro-organismen werden succesvol geïdentificeerd in conjunctivale monsters van muizen.
- De methode bood inzicht in de commensale gemeenschap van het oog.
- Er werden potentiële verbanden gesuggereerd tussen de bacteriële aanwezigheid en oogziekten.
- Deze benadering kan de diagnose van oogziekten met kenmerkende microbiële signatures verbeteren.
Conclusies
- Het protocol isoleert en identificeert effectief levensvatbare oculaire micro-organismen.
- Het biedt een duidelijker inzicht in het oculaire microbioom in vergelijking met traditionele methoden.
- Deze methode zou cruciaal kunnen zijn bij het diagnosticeren van oogziekten op basis van microbiële profielen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het isoleren van levensvatige commensale bacteriën uit het oog maakt doelwitvalidatie mogelijk in preklinische modellen van oogziekten door een ziekterelevant systeem te bieden om microbiële verschuivingen te monitoren. Deze methode ondersteunt mechanische risicoreductie door levende van dode micro-organismen te onderscheiden, wat het voorspellend vertrouwen bij de ontdekking van biomarkers verbetert. Hiermee wordt microbiologische profilering gepositioneerd als een translationele tool voor het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen in ophthalmologische pijplijnen.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door levensvatige conjunctivale micro-organismen te isoleren onder verschillende ziektecondities.
- Operationele waarde: Biedt een kweekgebaseerde methode om de commensale diversiteit bij muizen te definiëren, wat bijdraagt aan biologische risicoreductie van oculaire targets.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door microbiële signaturen te koppelen aan ziektestadia, waardoor het vertrouwen in targets wordt vergroot.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door aerobe en facultatief anaerobe genera uit oogmonsters te verrijken.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan via een swab-gebaseerde techniek met gecontroleerde verrijkings- en uitplaatstappen.
- Schaalbaarheid: Benadrukt het potentieel voor hergebruik van het platform voor het monitoren van microbiële verschuivingen in experimentele groepen en ziektegegevens.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door de aanwezigheid van unieke bacteriën te koppelen aan moeilijk te diagnosticeren oogziekten, zoals auto-immuun en niet-auto-immuun droge ogen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale monitoring van het occulaire microbiota mogelijk te maken.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt beslissingen op basis van microbiële signaturen, in overeenstemming met translationele strategieën voor biomarker-afstemming.
Integratie van Pijplijn en Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het discovery-continuüm, van hypothesetesten in de vroege ontdekkingsfase tot preklinische validatie, en ondersteunt de identificatie van lead-verbindingen via microbiële profilering.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetoetsing ondersteunt door levensvatige micro-organismen te isoleren om de betrokkenheid van pathways bij de immuniteit van het oogoppervlak te verduidelijken.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay via cultuurgebaseerde verrijking en kwantitatieve output zoals colony forming units per swab.
- Analytics: Benadrukt metingen zoals morfologie, relatieve overvloed en MALDI-TOF MS-identificatie die teams helpen om condities tussen groepen te vergelijken.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door monitoring van microbiële veranderingen in ziektemodellen mogelijk te maken, wat de afstemming van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit voor microbiologische profilering in diverse oogziektemodellen, in plaats van een eenmalige techniek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit in studies naar het occulaire microbioom.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de isolatie van levensvatbare bacteriën uit occulaire monsters met een lage abundantie.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium binnen oogheelkundige programma's.
- Impact op de portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van microbiële signaturen gekoppeld aan ziektefenotypen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in microbiologische technieken, het hanteren van anaerobe culturen en het bedienen van MALDI-TOF MS.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten een autoclaaf, incubator, uitplaatapparatuur en massaspectrometrie voor identificatie.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor de bereiding van swabs, de timing van verrijking en de consistentie van het uitplaten tussen gebruikers.
- Overwegingen voor aanpassing tussen modelsystemen, inclusief mogelijke aanpassingen voor verschillende soorten of de toegankelijkheid van het oogoppervlak.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal: lage hoeveelheid terugwinbare bacteriën, incidenteel uitblijven van isolaten en afhankelijkheid van de juiste swabtechniek.
