Transplantatie van een 3D Bioprinted Patch in een Murine Model van Myocardikoesie Infarct
26 september 2020
Dit protocol is bedoeld om een 3D-bioprint patch te transplanteren op het epicardium van infarct muizen die hartfalen modelleren. Het bevat details met betrekking tot anesthesie, de chirurgische borstopening, permanente ligatie van de linker voorste aflopende (LAD) kransslagader en toepassing van een bioprinted patch op het infarct gebied van het hart.
Elke 10 minuten krijgt iemand in Australië een hartaanval. Dit kan hen verlaten met beschadigde hartspier, en dat kan leiden tot hartfalen. We hebben ontdekt dat we stamcellen, van bloed of huid, kunnen omzetten in kloppende hartcellen.
Als we deze geherprogrammeerde cellen door onze 3D-bioprinter plaatsen, met behulp van bioink, geloven we dat we hartpatches kunnen maken met cellen die de eigen cellen van mensen matchen. Een diep verdoofde muis, met behulp van ketamine xylazine, wordt geïntubeerd met behulp van een 20-meter katheter. Na intubatie van de tracker wordt de muis zorgvuldig op een verwarmingskussen geplaatst en vervolgens aangesloten op de ventilator die automatisch het doelvolume instelt op basis van het muisgewicht.
Onder een lichte anesthesie met 2%iso fluoride is de muis gewoon schoon met jodium en ethanol. Een linkse Laterale thoracotomie wordt uitgevoerd om het hart bloot te leggen. Tussen de derde en de vierde rib wordt een oprolmechanisme geplaatst.
Het pericardium wordt zorgvuldig gesneden. De LAD geïdentificeerd onder de microscoop. Voor de LAD ligatiestap is het belangrijk om te voorkomen dat de hechting door de LAD snijdt.
Daarom wordt een versterkend stuk van 3,06 zijden hechting op het hart geplaatst zoals afgebeeld, die in dezelfde richting loopt en net bovenop de LAD. Met behulp van een 7.06 zijden hechting is de LAD geïsoleerd en permanent geligat. Dit maakt het blancheren van het hart dat een hartaanval krijgt.
Dit zal leiden tot remodellering en de linker ventrikel zal na verloop van tijd mislukken. Een 3D bioprinted hart patch wordt gegenereerd in het lab met behulp van een 3D bioprinter. Dit maakt de laag voor laag, afzetting van hartcellen, met behulp van een combinatie van cellen en hydrogels.
U zien een zweven in deze video en nu in deze afbeelding. Hier is een beeld van de patch verschijning wanneer afgebeeld door epifluorescentie licht microscopie in een put van een zes put plaat. De patch is gekleurd met Hoechst vlek voor celkernen, en deze blauwe vlek is ook de nadruk op de autofluorescente hydrogels.
Dit is een intacte algenate gelatine patch geschikt voor transplantatie, vergelijkbaar met de getoonde in de video. Met onze methode, de meeste patches begon te desintegreren tussen 14 en 28 dagen, in de cultuur, zoals hier getoond in dit beeld van een andere patch, die is uiteengevallen. We ontdekten dat de optimale tijd om patches te transplanteren was tussen dag zeven en dag 14 na bioprinting.
Dit was toen patches met hartcellen begonnen te kloppen, met een zekere mate van weefselrijping, maar voordat patches begonnen te desintegreren. De pleister wordt naar de chirurgische ruimte gebracht en langzaam en zorgvuldig op het hart in een deel van de muis geplaatst. Zorgvuldig wordt ook verplaatst naar het gebied van de inenfer.
Het oprolmechanisme wordt langzaam verwijderd. Ten slotte worden de derde en vierde ribben samen gesloten met behulp van een 6.0 prolene hechting. Samen met een spier worden de ribben gesloten, gevolgd door de sluiting van de huid.
Na sluiting van de borst wordt de muis geïnjecteerd met Antisedan en furosemide. Langzaam zal de muis weer zelfstandig ademwerk doen en reageert hij op teenknijpen. De muis wordt nauwlettend in de gaten gehouden, en zodra hij ontwaakt uit de verdoving, wordt hij in zijn eigen kooi geplaatst.
Dit beeld toont, met het goedgekeurde gebied, waar de bioprinted flard bovenop het muishart zal zitten. Tot slot hebben we aangetoond dat 3D-geprinte algenaat gelatinepleisters kunnen worden getransplanteerd met onze methode, op het epicardium, in een muismodel van een hartinfarct. In de bioprinting fase, algenate gelatine hydrogels hebben een uitstekende afdrukbaarheid als gevolg van hun rheologische eigenschappen, waardoor extrusie zonder schadelijke cellen, maar ook met de biomechanische sterkte om hun structuur te behouden na 3D bioprinting, en tijdens transplantatie.
Onze methode is waarschijnlijk op grote schaal haalbaar en ook geschikt voor het testen van meerdere groepen van 3D-bioprinted patches. Bijvoorbeeld met verschillende cellulaire inhoud.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het transplanteren van een 3D-biogeprinte patch op het epicardium van geïnfarceerde muizen, ter modellering van hartfalen. De methode bevat gedetailleerde chirurgische stappen en het gebruik van biogeprinte patches vervaardigd uit hartcellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Hartweefseltechnologie
- 3D-bioprinten
- Myocardinfarctmodellen
Achtergrond
- Hartaanvallen kunnen leiden tot beschadiging van de hartspier en hartfalen.
- Stamcellen kunnen worden hergeprogrammeerd tot kloppende hartcellen.
- 3D-bioprinten maakt de creatie van hartpleisters met behulp van bio-inkt mogelijk.
- De optimale timing voor de transplantatie van de pleister is cruciaal voor het succes.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het transplanteren van biogeprinte hartpatches.
- Om de haalbaarheid van het gebruik van patiëntspecifieke cellen voor de creatie van patches te beoordelen.
- Om de effectiviteit van de patches te evalueren in een muismodel van myocardinfarct.
Gebruikte methoden
- Gebruik van ketamine-xylazine voor anesthesie bij muizen.
- Linker laterale thoracotomie om het hart bloot te leggen.
- Permanente ligatie van de linker anterior descending coronaire arterie.
- Transplantatie van 3D-bioprinted patches op het hart.
Belangrijkste resultaten
- 3D-biogeprinte patches vertoonden een goede printbaarheid en biomechanische sterkte.
- Patches begonnen te desintegreren tussen dag 14 en 28 in kweek.
- Optimale transplantatie vond plaats tussen dag 7 en 14 na het bioprinten.
- De methode is geschikt voor het testen van diverse composities van biogeprinte patches.
Conclusies
- 3D-gebioprinte alginaat-gelatine-patches kunnen met succes worden getransplanteerd.
- De techniek is waarschijnlijk breed toepasbaar binnen het cardiaal onderzoek.
- Toekomstige studies kunnen verschillende cellulaire samenstellingen onderzoeken voor verbeterde resultaten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit protocol pakt een kritieke bottleneck in onderzoek naar cardiale regeneratie aan: het betrouwbare in vivo testen van 3D-biogeprinte therapeutische patches in muismodellen voor myocardinfarcten. Door de procedurele variabiliteit en mortaliteit geassocieerd met chirurgische transplantatie te verminderen, maakt dit een statistisch robuustere preklinische evaluatie van engineered weefsels mogelijk. Deze vooruitgang ondersteunt het minimaliseren van risico's bij biologische middelen en biomaterialen in een vroeg stadium door de reproduceerbaarheid in functionele validatiestudies te verbeteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele beoordeling van biogeprinte patches mogelijk in een ziekterelante ischemische micro-omgeving om mechanistische hypothesen over weefselintegratie en paracriene signalering te valideren.
- Operationele waarde: Standaardiseert de chirurgische toediening van complexe biologische middelen, waardoor de inter-individuele variabiliteit in integratie-efficiëntie tussen dieren wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een reproduceerbaar platform voor het vergelijken van patch-formuleringen (bijv. celtypen, hydrogel-verhoudingen) op basis van metrieken voor structurele retentie en integratie.
- Operationele waarde: Ondersteunt medium-throughput screening van biomateriaal-kandidaten door een consistente chirurgische toediening over studiecohorten mogelijk te maken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de longitudinale evaluatie van door patches gemedieerde ventriculaire remodellering en functioneel herstel in een klinisch relevant model van ischemische schade.
- Operationele waarde: Maakt studies met voldoende statistische kracht mogelijk met een verminderde uitval, waardoor de haalbaarheid van experimenten voor dosis-respons en timingoptimalisatie wordt verbeterd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door gestandaardiseerde levering van gemanipuleerde weefsels mogelijk te maken na doelwitvalidatie en voorafgaand aan de screening van de werkzaamheid in ziektemodellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten met betrekking tot celoverleving, ingroei en secretie van bioactieve factoren in het geïnfarceerde myocardium.
- Screening: Maakt kwantitatieve vergelijking van patch-ontwerpen mogelijk via gestandaardiseerde chirurgische implantatie en monitoring na transplantatie.
- Analytics: Genereert histopathologische en functionele resultaten (bijv. infarctgrootte, wanddikte) om de prestaties van de patches te rangschikken.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro maturatiemetrieken en in vivo functionele uitkomsten om go/no-go-beslissingen te onderbouwen.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbaar chirurgisch platform voor het evalueren van diverse kandidaten voor cardiale regeneratie over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in preklinische modellen door chirurgische storende variabelen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van complexe weefseltransplantatieprocedures.
- Strategische waarde: Vermindert biologische ruis bij effectiviteitsbeoordelingen, wat leidt tot duidelijkere go/no-go-beslissingen in de vroege ontwikkeling.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten voor cardiale regeneratie mogelijk op basis van betrouwbaardere preklinische gegevens.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muizencardiale chirurgie, anesthesie en postoperatieve zorg.
- Afhankelijk van toegang tot microsutuurinstrumenten, ventilatoren en stereomicroscopen voor nauwkeurige LAD-ligatie.
- Vereist standaardisatie van protocollen voor de behandeling en positionering van de patch tussen verschillende operators.
- Er moet rekening worden gehouden met variabiliteit in de rijpingstijd van de patch, afhankelijk van de celbron en de samenstelling van de hydrogel.
- Beperkt tot acute en subacute letselmodellen; niet geschikt voor chronische ischemie-studies zonder aanpassing van het model.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
