Name: Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Leer de choroid sprouting assay voor onderzoek naar oculaire microvasculaire angiogenese met muizenweefsel. Deze ex vivo methode evalueert anti-angiogene verbindingen en signaalroutes bij leeftijdsgebonden maculadegeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door Subsidies van de Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship en Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; bc [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Foundation Eye (LEHS).

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee in het Boston Children's Hospital (ARCH protocolnummer 19-04-3913R).
1. Voorbereiding
<ol><li>Voeg 5 mL Penicilline/Streptomycine (10000 U/mL) en 5 mL en 10 mL aan commercieel beschikbare supplementen toe aan 500 mL compleet klassiek medium met serum. Aliquot 50 mL van het medium in eerste instantie. LET OP: Breng geen medium terug naar de voorraad om besmetting te voorkomen.</li>
	<li>Zet een aliquot van complete klassieke medium op ijs.</li>
	<li>Gebruik 70% ethanol om de ontledende microscoop, tangen en scharen schoon te maken.</li>
	<li>Bereid twee celkweekgerechten (10 cm), een op de dissectiemicroscoop, één op ijs; zet 10 mL van complete klassieke medium in elk gerecht.</li>
</ol>2. Experimentele stappen (figuur 1)
<ol><li>Offer C57BL/6J muizen rond postnatale (P) 20 met behulp van 75-100 mg/kg ketamine en 7,5 -10 mg/kg xylazine intraperitoneally geïnjecteerd. Houd de ogen in volledig klassiek medium op ijs voor dissectie.</li>
	<li>Verwijder het bindweefsel (spier- en vetweefsel) en de oogzenuw.</li>
	<li>Gebruik een microschaar om 0,5 mm achterste te snijden naar het hoornvlies limbus. Verwijder het hoornvlies/iriscomplex, glasvocht en de lens.</li>
	<li>Maak een incisie van 1 mm loodrecht op de snijkant naar de oogzenuw en snijd een omtrekband van 1 mm breed. Scheid de centrale en perifere regio's van het complex. Gebruik tangen af te pellen van het netvlies van RPE / choroïde / sclera complex.</li>
	<li>Houd de perifere choroidband in volledig klassiek medium op ijs; isoleer het andere oog en herhaal het proces om een tweede band te snijden.</li>
	<li>Snijd de ronde band in 6 ~ gelijke vierkante stukken (~ 1 mm x 1 mm). LET OP: Raak nooit een rand aan.</li>
	<li>Ontdooi het basaal membraanextract (BME) per gebruiksinstructie van de fabrikant. Voeg 30 μL/put BME toe in het midden van elke put van een 24 goed weefselkweekplaat. Zorg ervoor dat de druppel BME een bolle koepel vormt aan de onderkant van de plaat zonder de randen aan te raken. LET OP: Ontdooi de BME 's nachts in een koelkast. BME moet op het ijs elk moment na het ontdooien.</li>
	<li>Plaats het weefsel in het midden van de BME. LET OP: Maak de choroïde explant niet plat; laat het weefsel over het algemeen uitzetten binnen de BME. De oriëntatie van het weefsel (sclerale kant omhoog of omlaag) heeft geen invloed op de experimentele uitkomst.</li>
	<li>Incubeer de plaat op 37 °C gedurende 10 minuten om de gel te laten stollen.</li>
	<li>Voeg 500 μL van het complete klassieke medium/well toe.</li>
	<li>Verander het klassieke medium om de andere dag (500 μL). Choroïde ontkiemen kan worden waargenomen na 3 dagen met een microscoop. OPMERKING: Voor de behandeling van de groeifactor verhongert u het weefsel gedurende 4 uur. Verdun een proefsamenstelling in groeifactor-verlaagd medium (1:200 boost in plaats van 1:50).</li>
</ol>3.SWIFT-Choroid geautomatiseerde kwantificeringsmethode17 (Figuur 2)
OPMERKING: Er werd gebruik gemaakt van een geautomatiseerde methode om het gebied waarop groeiende vaten betrekking hebben, te meten. Een macro plugin naar ImageJ software is nodig voorafgaand aan kwantificering (zie Aanvullende informatie voor meer details).
<ol><li>Open de choroïde kiemende afbeelding met ImageJ en check "Image | Type| 8-bits" met grijze schaal.</li>
	<li>Ga naar "Image | | aanpassen Helderheid/contrast (Ctrl/shift/C)" en optimaliseer het contrast.</li>
	<li>Gebruik de toverstaffunctie om het choroïde weefsel dat in het midden van de spruiten aanwezig is te schetsen en uit de afbeelding te verwijderen (met behulp van sneltoets "F1") (Figuur 2A,B). LET OP: Stel het tolerantiepercentage van de toverstok in op 20-30%.</li>
	<li>Verwijder de achtergrond van de afbeelding met de gratis selectiegereedschappen(figuur 2C). Ga naar "Image | | aanpassen Drempelwaarde (Ctrl/shift/T)". Gebruik de drempelfunctie om de microvasculaire spruiten tegen de achtergrond en de periferie te definiëren (figuur 2D).</li>
	<li>Klik opF2en er verschijnt een samenvatting. Sla een afbeelding van het geselecteerde gebied op door opOpslaante klikken. Sla op in dezelfde map als de oorspronkelijke afbeelding voor toekomstige referentie.</li>
	<li>Nadat een groep monsters is gemeten, kopieert u de opgenomen voor gegevensanalyse. LET OP: Het is ook mogelijk om het gebied (μm²) te meten door "Analyse | Schaal instellen" met afbeeldingen met schaalbalken.</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële informatie. De geautomatiseerde methode is gratis beschikbaar voor academische instellingen via de auteurs.

De choroidale kiemen test helpt onderzoek in neovasculaire AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kunnen worden geïsoleerd van muizen, evenals ratten en mensen17,21. De choroid explant omvat ECs, macrofagen, en pericytes17. In deze test de interactie tussen choroïdale ECs en aangren...

Choroidale angiogenese dysregulatie wordt geassocieerd met neovasculaire leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)1. De choroïde is een microvasculair bed aanwezig onder het retinale pigment epitheel (RPE). Het is aangetoond dat verminderde bloedstroom in de choroid wordt geassocieerd met progressie van AMD2. De ingewikkelde relatie tussen vasculair endotheel, RPE, macrofagen, pericyten en andere cellen is verantwoordelijk voor de homeostase van het weefsel3,4,5. Daarom is een reproduceerbare test modellering choroidale micro-omgeving is van cruciaal belang voor de studie van neovasculaire AMD.
Ex vivo angiogenese testen en in vitro endotheelcelculturen kunnen studies naar microvasculair gedrag in vivo aanvullen, voor het testen van nieuwe geneesmiddelen en voor studies van pathogenese. Endotheelcellen zoals menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs), Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), geïsoleerde primaire dierlijke hersenen of retinale VC's worden vaak gebruikt in vitro studies voor oculair angiogenese onderzoek6,7,8. Met name HRMECs zijn op grote schaal gebruikt als een model van in vitro choroidale neovascularisatie (CNV)9 door de beoordeling van endotheelproliferatie, migratie, buisvormige vorming en vasculaire lekkage om interventies6,10te evalueren . ECs in de cultuur zijn echter beperkt als model van CNV vanwege het gebrek aan interacties met andere celtypen in de chooïde en omdat de meeste EG-maatregelen die in deze tests worden gebruikt, niet afkomstig zijn van chooïde. Muis choroidale ECs zijn moeilijk te isoleren en te onderhouden in de cultuur.
De aorta ring test wordt veel gebruikt als een model van macro vasculaire proliferatie. Vasculaire spruiten van aorta-explants zijn onder andere ECs, pericyten en macrofagen11. De aortaringtest modelleert grote scheeps angiogenese goed12,13,14. Echter, het heeft beperkingen als een model van choroïdale neovascularisatie als aorta ringen zijn een macrovasculair weefsel ontbreekt de karakteristieke choroidale microvasculaire omgeving, en spruiten uit grote vaten kunnen verschillen van spruiten van capillaire netwerken die betrokken zijn bij microvasculaire pathologie. Onlangs publiceerde een groep een ex-vivo retinale test15,16. Hoewel het geschikt is voor retinale neovasculaire ziekte, is het niet zo geschikt voor choroidale neovascularisatie zoals gezien in AMD.
De choroidale kiemende test met muis RPE, choroïde en scleral explanted tissue werd ontwikkeld om CNV beter te modelleren. Het weefsel kan gemakkelijk worden geïsoleerd van de muis (of andere soorten) ogen17. Deze test maakt reproduceerbare evaluatie van pro- en anti-angiogeen potentieel van farmacologische verbindingen en evaluatie van de rol van specifieke trajecten in choroidale neovascularisatie met behulp van weefsel van genetisch gemodificeerde muizen en controles18. In veel latere publicaties 9 , 10,18,19,20. Hier wordt de methode die betrokken is bij het gebruik van deze test aangetoond.

<table><tbody><tr><td>AnaSed (Xylazine)</td><td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Basal membrane extract (BME) Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10cm</td></tr><tr><td>Complete classic medium with serum and CultureBoost</td><td>Cell systems</td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol 200 Proof</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>gebruik voor 70%</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>Tissue culture plate (24-well)</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII (Ketamine)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

een ex vivo choroid sprouting assay van oculaire microvasculaire angiogenese

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

Pathologische choroidale angiogenese, een treffend kenmerk van leeftijdsgebonden maculadegeneratie, leidt tot gezichtsstoornissen en blindheid. Endotheelcel (EC) proliferatietesten met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) of geïsoleerde primaire retinale EC's worden veel gebruikt in vitro modellen om retinale angiogenese te bestuderen. Echter, isoleren van zuivere murine retinale endotheelcellen is technisch uitdagend en retinale ECs kunnen verschillende proliferatie reacties dan choroidale endotheelcellen en verschillende cel / cel interacties. Een zeer reproduceerbare ex vivo choroidale kiemen test als een model van choroidale microvasculaire proliferatie werd ontwikkeld. Dit model omvat de interactie tussen choroïde vasculatuur (EC, macrofagen, pericyten) en retinale pigment epitheel (RPE). Muis RPE/choroïde/scleral explants worden geïsoleerd en geïncubeerd in groeifactor-verminderde basale membraan extract (BME) (dag 0). Medium wordt om de andere dag veranderd en choroid ontkiemen wordt gekwantificeerd op dag 6. De beelden van individuele choroid explant worden genomen met een omgekeerde fase microscoop en het ontkiemen gebied wordt gekwantificeerd met behulp van een semi-geautomatiseerde macro plug-in om de ImageJ software ontwikkeld in dit lab. Deze reproduceerbare ex vivo choroidale spruittest kan worden gebruikt om verbindingen voor potentiële behandeling te beoordelen en voor microvasculair ziekteonderzoek om trajecten te beoordelen die betrokken zijn bij de proliferatie van choroidale microvaten met behulp van wild type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.

Vergelijking van choroid ontkiemen groei per dag
We ontleed de choroid met sclera, ingebed in BME en gekweekt ze voor 6 dagen (Figuur 1). De chooïde die van dag 3 tot dag 6 in C57BL/6J muizen ontkiemde, werd met een microscoop onderzocht en gekwantificeerd met SWIFT-Choroid een semi-geautomatiseerde kwantificeringsmethode in ImageJ. In een representatief geval bedroeg het kiekkiemende gebied (de vaten die zich uitstrekken van de explant, met uitzo...

Dit protocol presenteert choroïde kiemen test, een ex vivo model van microvasculaire proliferatie. Deze test kan worden gebruikt om trajecten die betrokken zijn bij het verspreiden van choroidale microvaten te beoordelen en te beoordelen drug behandelingen met behulp van wilde type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.

Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

Deze Choroid-test is zeer reproduceerbaar en relevant voor onderzoek naar choroïdale angiogenese en leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, AMD. Het kan complementair zijn aan in vivo-studies van microvasculair gedrag. Deze test kan worden gebruikt om verbindingen te screenen als mogelijke behandelingen voor neovasculaire AMD of om paden te beoordelen die betrokken zijn bij choroïdale neovascularisatie met behulp van wildtype en genetisch gemodificeerde muisweefsels. Om te beginnen, voegt u vijf milliliter penicilline, streptomycine en 10 en vijf milliliter commercieel verkrijgbare supplementen toe aan 500 milliliter compleet klassiek medium met serum en verdeel vervolgens 50 milliliter van het medium. Bewaar de basaalmembraanextract of BME 's nachts in de koelkast op twee tot acht graden Celsius.Plaats een aliquot van compleet klassiek medium op ijs. Reinig de dissectiemicroscoop, pincetten en schaar met 70% ethanol. Bereid de celcultuurschalen voor en plaats er een op de dissectiemicroscoop en de andere op ijs.Voeg vervolgens 10 milliliter compleet klassiek medium toe aan elk schaaltje. Bewaar de ogen in compleet klassiek medium op ijs voor de dissectie. Verwijder het bindweefsel en de oogzenuw en gebruik vervolgens een microschaar om omtrent 0,5 millimeter achter de limbus corneae te snijden.Verwijder het hoornvlies-iriscomplex, de vitreus en het lens. Maak een insnijding van één millimeter loodrecht op de snijrand richting de oogzenuw en snijd vervolgens een omtrent één millimeter brede cirkelband. Scheid vervolgens de centrale en perifere regio's van het complex. Gebruik pincetten om de retina van het RPE-choroid-scleracomplex te pellen.Bewaar de perifere choroïdeband in compleet klassiek medium op ijs. Isoleer het andere oog en herhaal het proces om een tweede band te snijden. Snijd de cirkelvormige band in vijf tot zes ongeveer gelijke vierkante stukken.Voeg 30 microliter van de ontdooide BME toe in het midden van elke put van een 24-welfselschaal. Zorg ervoor dat de druppel BME een convexe koepel vormt op de bodem van de schaal zonder de randen aan te raken. Plaats het weefsel in het midden van de BME.Laat de choroïde X-plant niet plat worden. Laat het weefsel uitzetten binnen de BME. Incubeer de schaal gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius om het gel te laten stollen en voeg vervolgens 500 microliter compleet klassiek medium toe aan elke put.Ververs het klassieke medium om de dag. Choroïdekiemen kunnen na drie dagen met een microscoop worden waargenomen. Open de choroïdekiem-afbeelding met Image J en controleer afbeelding, type en acht bits met grijstinten.Optimaliseer vervolgens het contrast door afbeelding te selecteren, aanpassen, helderheid/contrast en aanpassen. Gebruik de toverstaffunctie om het choroïdeweefsel dat in het midden van de kiemen aanwezig is te omlijnen en te verwijderen. Verwijder de achtergrond van de afbeelding met de vrije selectietools.Ga vervolgens naar afbeelding, drempel aanpassen en gebruik de drempelfunctie om de microvasculaire kiemen tegen de achtergrond in de periferie te definiëren. Klik op F2 en er verschijnt een samenvatting. Klik op opslaan om een afbeelding van het geselecteerde gebied op te slaan in dezelfde map als de originele afbeelding voor toekomstig gebruik.Nadat een groep monsters is gemeten, kopieert u de geregistreerde gegevens voor analyse. Dit protocol werd gebruikt om choroïdekiemen te onderzoeken en te kwantificeren bij C 57, Black six J-muizen van dag drie tot dag zes. In een representatieve casus was het gebied van de choroïdekiemen respectievelijk 0,38, 1,47, 5,62 en 10,09 vierkante millimeter op dagen drie, vier, vijf en zes.De effecten van verlies van FFAR4 op choroïdaal vasculair ontluiksel werden geëvalueerd met behulp van de choroïdekiem-test bij FFAR4-knockout-muizen en FFAR4-wildtypemuizen. Het ontluikselgebied bij FFAR4-knockout-muizen vertoonde een toename van choroïdaal vasculair groei in vergelijking met FFAR4-wildtype op dag zes. Bovendien verminderde behandeling met één micromolair FFAR4-agonist het gebied van choroïdekiemen in vergelijking met onbehandelde muizen op dag zes.Deze test maakt reproduceerbare evaluatie mogelijk van het anti-angiogene potentieel van farmacologische verbindingen en de variatie van de rol van specifieke paden in choroïdale neovascularisatie met behulp van genetisch gemodificeerde muisweefsels.

an-ex-vivo-choroid-sprouting-assay-ocular-microvascular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het hoornvlies is uniek omdat het ontbreekt vaatweefsel. Echter, robuuste groei van bloedvaten en overleving worden geïnduceerd in het hoornvlies door de krachtige angiogene factoren. Daarom kan het hoornvlies te voorzien van ons een waardevol hulpmiddel voor angiogene studies. Dit protocol laat zien hoe u de muis-model van het hoornvlies pocket test en hoe de angiogenese veroorzaakt door angiogene factoren het gebruik van dit model te beoordelen.

Een muis model van het hoornvlies Pocket Assay voor Angiogenese Study

This video demonstrates a modified microcarrier beads-based assay incorporating pericytes to study endothelial sprouting during the early stages of angiogenesis. The assay provides an in vitro experimental model to understand molecular mechanisms of angiogenesis and the effect of anti-angiogenetic therapeutics.

Bead Sprouting Assay for Early-Stage Angiogenesis Assessment: An In Vitro Bead-Based Model to Study Endothelial Sprouting in the Presence of Pericytes

This video demonstrates the development of an ex vivo model of choroidal sprouting to study ocular microvascular angiogenesis. The assay involves culturing mouse eye explants containing the choroid tissue attached to the sclera and retinal pigment epithelium under specific conditions that promote choroidal microvascular sprouting.

Choroid Sprouting Assay to Study Ocular Microvascular Proliferation Ex Vivo

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Het protocol beschrijft de corneale micropocket assay zoals ontwikkeld in muizen.

De Cornea micropocket Analyse: Een model van angiogenese in de muis Eye

Angiogenese omvat interacties tussen meerdere cellen en systemen die onderzocht moeten worden in een fysiologisch relevante omgeving. Het doel van deze studie is om de capaciteit van het kweekmodel van de rat mesenterium te demonstreren om tijdsverloopvergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken tijdens angiogenesis te maken.

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Dit artikel presenteert een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in hemangioblastomas (HBs) en haar rol in de HBs bestaat. De resultaten wijzen op de complexiteit van de HB-neovascularization en suggereren dat deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in de HB-neovascularization is.

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

Deze methode beschrijft de cultuur van door IPSC afkomstige endotheliale cellen als 40 geperfundeerd 3D Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch platform. Dit platform maakt de studie mogelijk van gradiënt-gedreven angiogene kiemen in 3D, inclusief anastomose en stabilisatie van de angiogene spruiten op een schaalbare en hoge doorvoer wijze.

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Ontkiemende angiogenese, fundamenteel voor ontwikkeling en ziekte, omvat complexe moleculaire en mechanische processen. We presenteren een veelzijdig 2.5D ex vivo model dat cellulaire ontspruiting uit de halsslagaders van varkens analyseert, waarbij stijfheidsafhankelijke angiogenese en verschillende leider-volgercelmechanica worden onthuld. Dit model helpt bij het bevorderen van strategieën voor weefselmanipulatie en benaderingen van kankertherapie.

2.5D-model voor ex vivo mechanische karakterisering van kiemende angiogenese in levend weefsel

Leer de choroid sprouting assay voor onderzoek naar oculaire microvasculaire angiogenese met muizenweefsel. Deze ex vivo methode evalueert anti-angiogene verbindingen en signaalroutes bij leeftijdsgebonden maculadegeneratie.

Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese

Meer video's verkennen