Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

SM FISH kwantificeerd nauwkeurig de niveaus en lokalisatie van specifiek RNase. Deze methode is bijzonder nuttig voor het analyseren van cel-tot-cel en allel-tot-allel variatie in RNA. Gentranscriptie is een essentieel proces in de celbiologie, SM FISH maakt de onderzoeking van RNA-inhoud mogelijk in reactie op externe stimuli op enkelcelniveau en levert ruimtelijke informatie.

Na behandeling met een oestrogeenreceptoragonist, was de cellen met koud steriel PBS met calcium en magnesium en fixeer de cellen met 500 microliter fixatiebuffer gedurende 30 minuten op ijs. Aan het eind van de incubatie, was de cellen twee keer met koud steriel PBS met calcium en magnesium gedurende drie minuten voordat 500 microliter 70% ethanol aan elke put werd toegevoegd. Vervolgens verzegel de 24-welplate met een paraffine plastic folie en plaats de plaat op een roterende apparatuur bij vier graden Celsius gedurende ten minste vier en maximaal 16 uur.

Voor RNA FISH hybridisatie, was de cellen aan het eind van de incubatie één keer met 500 microliter 2X SSC buffer aangevuld met 10% formamide gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op een roterende apparatuur. Tijdens de incubatie, plaats een stuk parffin plastic folie onbelichte kant omhoog in een glazen petrischaal gereinigd met een RNA oppervlakte ontsmetter en plaats dit op steriele waterverzadigde papieren handdoeken langs de randen van de schaal. Aan het eind van de incubatie, plaats gelijkmatig verdeelde druppels van 30 microliter vers bereide GREB1 intron en GREB1 exon probe buffer op de schone kant van de paraffine plastic folie en gebruik steriele pincetten om voorzichtig een dekglas van cellen cellaangezien naar beneden op elke druppel te plaatsen zonder luchtbellen.

Na het afdichten van de schaal met paraffine plastic folie, bedek de plaat met folie en incubeer de plaat een nacht op 37 graden Celsius op een vlak niet-roterend oppervlak. De volgende ochtend, gebruik pincetten om de dekglazen terug te brengen naar de 24-welplate cellaangezien omhoog voor twee 15 minuten wasbeurten in 500 microliter vers 2X SSC buffer aangevuld met 10% formamide per wasbeurt bij 37 graden Celsius op een verwarmde roterende apparatuur. Na de tweede wasbeurt, tegenkleuren het DNA met één microgram per milliliter DAPI in 2X SSC buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een roterende apparatuur gevolgd door een vijf minuten wasbeurt in 2X SSC buffer bij kamertemperatuur.

Gebruik een papieren handdoek om het overtollige 2X SSC buffer te verwijderen en spoel de monsters in nuclease-vrij water om overtollige zouten te elimineren. Gebruik vervolgens niet-hardend montagemedium om de dekglazen op glazen slides te monteren en verzegel de dekglazen met doorzichtige nagellak. Voor monsterbeeldvorming, laad de slide met de hoogst verwachte intensiteit op een widefield epifluorescentiemicroscoop tafel uitgerust met een 60 of 100 maal olie objectief in een sCOMS camera en plaats een druppel immersie-olie op het objectief.

Voor Zstack acquisitie, focus op het monster in het DAPI kanaal en selecteer de boven- en onderkant van de Zstack op de afstanden waarop de DAPI-gekleurde kernen uit focus raken. Gebruik de slide om de hoeveelheid verlichting van de lichtbron en belichtingstijden voor elk kanaal te optimaliseren en verwerf beelden van alle slides onder omstandigheden die fotobleken en/of camera pixel verzadiging vermijden. Na de acquisitie, gebruik 10 cycli van een agressief restauratief algoritme om de beelden te deconvolveren en sla alle projectiebeelden op volgens de bitdiepte van de gebruikte camera.

Voor beeldanalyse, download eerst de Jupiter Notebook van GitHub en installeer Python Anaconda Distribution versie 3.6 of hoger. Open de Anaconda prompt en voer de installatieopdracht in om SimpleITK voor Anaconda te installeren. Open de Anaconda Navigator en start Jupiter Notebook.

Er zal een webbrowser openen die mappen en bestanden toont. Blader door de directorystructuren om de map te bereiken die de gedownloade Jupiter Notebook van GitHub bevat. Open vervolgens het notebook en druk op Shift en Enter om elke cel uit te voeren.

In dit representatieve experiment werden adherante borstkankercellen behandeld met een oestrogeenreceptoragonist, of drager, gedurende 24 uur. Spectraal gescheiden sonde sets tegen GREB1 intron en exon sequenties maakten de gelijktijdige visualisatie en kwantificering van beginnende en volwassen mRNA mogelijk. Belangrijk is dat het aantal transcriptioneel actieve allelen in elke cel dat is aangetoond deel uit te maken van de oestrogeenresponstijdsverloop kan worden gemarkeerd.

Door de overlappende intron en exon spots te tellen, werd vastgesteld dat de E2-behandelde cellen een viervoudige verhoogde fractie cellen hebben die twee of meer actieve GREB1 allelen vertonen in vergelijking met drager-behandelde cellen. Aangezien introns worden uitgesneden uit beginnend mRNA om volwassen mRNA te produceren dat bestaat uit alleen exonsequenties, kan het aantal volwassen mRNA per cel worden geteld door het aantal groene spots te kwantificeren. Het plotten van deze gegevens maakt vervolgens de verschuiving in de verdeling van volwassen GREB1 mRNA per cel en de geaggregeerde voudverschil in de celpopulatie na E2-behandeling mogelijk.

C-FISH maakt het mogelijk om meerdere RNA-soorten sequentieel te onderzoeken, MERFISH is een barcodetechniek om multiplexing massief te verhogen, en iFISH wordt gebruikt om RNA en eiwitten tegelijkertijd te bestuderen.