Subretinale transplantatie van menselijk embryonaal stamcel-afgeleid retinaal weefsel in een katachtig groot diermodel

Het huidige protocol toont in detail subretinale toediening van de gehele retinale organoïden in een groot diermodel, gericht op het ontwikkelen van celtherapiebenaderingen voor retinale degeneratie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het organoïden rechtstreeks aan het doelweefsel, het netvlies, kan afleveren. De techniek is gericht op de behandeling van geavanceerde blinderende retinale degeneratieve aandoeningen, zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, retinitis pigmentosa of leber congenitale amaurosis.

De procedure wordt gedemonstreerd door Dr.Peterson Jones. Voor subretinale implantatie van de organoïden, gebruik Stevens Tenotomy Scissors om een 0,5 tot 1 centimeter laterale canthotomie uit te voeren bij een vier maanden oude 's nachts nuchtere verdoofde kat, en plaats een barraquer ooglid speculum van de juiste grootte in de incisie om de oogleden open te houden met een chirurgische assistent die regelmatig het hoornvlies irrigeert met BSS tijdens de procedure. Gebruik 0,5 Castroviejo corneale bindtang en een kleine mug hemostat om het bulbaire bindvlies naast de limbus voorzichtig vast te pakken.

Plaats twee 6-0 zijden hechtingen in het bindvlies direct naast de limbus op de posities 4 en 8 uur om het oog in de primaire blik te houden en het derde ooglid in te trekken. Klem de uiteinden van de hechtingen vast met kleine muggenhemostaten om hun manipulatie te helpen en plaats een andere hechting op de positie van 12 uur op de limbus gedeeltelijk door de dikte van de limbus, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het oog niet binnendringt. Knoop de hechtdraad losjes vast, knip het uiteinde kort en plaats een hechting in het bindvlies direct naast de limbus op de positie van 4 uur om het oog en de primaire blik vast te houden.

Reflecteer het bulbaire bindvlies tussen 10 en 2 uur en gebruik een tenotomieschar om het bindvlies twee tot drie millimeter van de limbus in te snijden. Ondermijn het bindvlies en maak de capsule van de Tenon vrij om de sclera bloot te leggen op de twee en 10 uur vitrectomiepoortplaatsen op drie tot vijf millimeter van de limbus. Gebruik remklauwen om de plaatsen voor sclerotomie te identificeren en vermijd de belangrijkste sclerale vaten die prominent in de kat kunnen zijn.

Planning voor een gebied van drie millimeter op de instrumentpoort van 10 uur voor een rechtshandige chirurg, plaats 6-0 of 7-0 polyglactine kruispatroonnaden zonder te binden op de plaatsen van de voorgestelde sclerotomieën. Zodra de hechtingen op hun plaats zijn, laat de assistent de 12 uur durende hechtingen vastpakken om de bol in positie te houden en gebruik je een Castroviejo-tang van 0,12 millimeter om het weefsel naast de sclerotomieplaats te houden. Gebruikt een trocar om een 23 gauge vitrectomiepoort door de sclera te introduceren op zowel de 2 als 10 uur posities schuin naar de oogzenuw om contact met de lens te voorkomen, en gebruik bindtangen om de irrigatiepoort voorzichtig te duwen om te bepalen of de tips in het glasvocht kunnen worden gevisualiseerd.

Laat de assistent een Machemer vergrotende irrigerende vitrectomielens op het hoornvlies plaatsen om visualisatie van het achterste segment van het oog mogelijk te maken, en een 23 gauge vitrectomiesondesapper door de instrumentpoort om een gedeeltelijke kernvitrectomie uit te voeren. Breng vervolgens de naald van een spuit van één milliliter met één milliliter triamcinolonoplossing in de instrumentpoort en injecteer 250 tot 500 microliter van de kristalsuspensie. Wanneer de oplossing is afgeleverd, verplaatst u de vitrectomiesonde door de instrumentpoort om dicht bij de oogzenuwkop te komen met de poort weg van het netvliesoppervlak.

Gebruik een hoog vacuüm om het vitreale gezicht van het netvlies los te maken, steek de injector door de instrumentpoort naar het netvliesoppervlak en extrudeer de canulepunt. Druk zachtjes op de punt van het netvliesoppervlak en laat de assistent een lichte snelle druk geven op de zuiger van de spuit om de netvliesloslating te starten, waarbij de injectiedruk wordt verlaagd om een langzame toename van de netvliesloslating mogelijk te maken totdat de gewenste grootte is bereikt. Gebruik een canule van 41 gauge van de injector om de loslating iets te vergroten totdat een netvliesschaar kan worden ingebracht en verwijder de sclerale poort van 10 uur.

Gebruik vervolgens een recht 2.850 millimeter spleetmes gericht op de oogzenuw om te voorkomen dat u de lens aanraakt om de sclerotomie op deze plaats te vergroten. Maak de retiotomie op de bleb weg van de oogzenuw om te voorkomen dat de netvlieszenuwvezels afkomstig uit het getransplanteerde gebied worden beschadigd en vermijd het snijden van grote retinale vaten om het risico op bloeding te verminderen. Om de organoïden te implanteren, plaatst u een glazen capillair geladen met organoïden door de vergrote sclerotomie naar de retinotomieplaats en gebruikt u de punt van het capillair om de retinomie enigszins te openen om toegang te krijgen tot de subretinale blebopening.

Laat de assistent de zuiger van de injector opnieuw langzaam indrukken om de organoïden in de subretinale bleb te injecteren. BSS moet doorgaan met organoïden, de organen, en spoel de retiotomie open. Wanneer alle organoïden zijn afgeleverd, laat u het glazen capillair een paar seconden op zijn plaats voordat u het capillair langzaam uit het oog verwijdert, waarbij u ervoor zorgt dat er geen plotselinge afgifte van vloeistof plaatsvindt.

Wanneer het capillair is verwijderd, sluit u de sclerotomie met behulp van de vooraf geplaatste hechting in een kruispatroon. Laat de assistent de infuuspoort verwijderen en snel de sclerotomiehechting binden en de peritomie sluiten met de polyglictine-hechtingen in een eenvoudig continu patroon. Sluit de laterale canthotomie met een 6-0 polyglactine-hechting en figuur-acht huidnaden om de laterale canthus uit te voeren en gebruik eenvoudige onderbroken huidnaden om de rest van de wond te sluiten.

Dien vervolgens de juiste postoperatieve steroïde en antibiotische cocktail toe. Menselijke pluripotente stamcel-afgeleide retinale organoïde belasting kan worden bevestigd in de glazen canule van het injectieapparaat en tijdens de operatie door directe visualisatie. De aanwezigheid van de organoïden in de subretinale ruimte kan postoperatief worden bevestigd door oogheelkundig onderzoek en fundusbeeldvorming.

Voorafgaand aan euthanasie kunnen confocale scanning laser oftalmoscopie en spectrale domein optische coherentie tomografie beeldvorming ook worden uitgevoerd om de positie van de organoïden te beoordelen. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de persistentie van retinale organoïden in de subretinale ruimte tussen het neurale netvlies en het retinale pigmentepitheel van het ontvangende oog aan te tonen. Histologische en immunohistochemische analyses kunnen worden gebruikt om de overleving van de xenogene grafieken in de subretinale ruimte van een groot oog in een immunosuppressief dier te illustreren.

Alleen degenen die bekwaam zijn in vitreoretinale chirurgie, zoals opgeleide veterinaire oogartsen of vitreoretinale chirurgen die bekend zijn met de soortverschillen in het kattenoog in vergelijking met het menselijk oog, moeten deze procedure uitvoeren. De techniek die in deze video wordt gepresenteerd, moet van toepassing zijn op andere grote diermodellen die worden gebruikt voor het vertalen van vitreoretinale chirurgische technieken naar de klinieken.