Optimalisatie van kristalgroei voor neutronenmacromoleculaire kristallografie

Er zijn verschillende kristallisatiebenaderingen voor het verkrijgen van grote en hoogwaardige kristallen voor zowel röntgen- als neutronenkristallografie. Een van deze benaderingen is het gebruik van de dialysemethode. Bij deze techniek wordt de eiwitoplossing gescheiden van een neerslagoplossing door een semi-doorlatend membraan.

De precipitante moleculen verspreiden zich over het membraan in de eiwitkamer. Wanneer de juiste oververzadiging voor een spontane nucleatie is bereikt, verschijnen de eerste kernen. Hier zullen we een protocol demonstreren dat kan worden gebruikt door OptiCrys, een volledig geautomatiseerd instrument dat in ons lab is ontwikkeld en dat gebruikmaakt van temperatuurgecontroleerde dialysekristallisatie, en onze microdialyseknoppen voor het kweken van grote kristallen van hoge kwaliteit voor natuurlijke macromoleculaire kristallografie op basis van kennis van het kristallisatiefasediagram.

Voor een microdialyseknop met bepaalde microlitervolumepipet 35 microliter lysozymoplossing in de dialysekamer. Dit extra volume creëert een licht koepelvorm bovenop de dialysekamer en voorkomt luchtbelvorming. Neem een applicator en plaats het elastiek of de ring aan het uiteinde ervan.

Plaats het membraan op de kamer en bevestig het door het elastiek of de ring van de applicator over te brengen naar de groef van de dialyseknop. Breng de knop over naar de put met de kristallisatieoplossing. Bedek de put met een glazen afdekstrook of een stuk tape.

Bewaar het monster op 293 Kelvin in een trillingsvrije thermische regelaar incubator. Wetende dat de dialysekristallisatie voordelen biedt vanuit het oogpunt van kristalgroei, is de kristallisatiebank zogenaamde OptiCrys in ons laboratorium ontworpen en ontwikkeld om een volledig geautomatiseerde gecombineerde controle van temperatuur en chemische samenstelling van het biomoleculaire kristallisatie-experiment te bieden. De optimalisatie van de kristalgroei door OptiCrys is gebaseerd op de temperatuurprecipitante concentratiefasediagrammen.

Nucleatie vindt plaats in de nucleatiezone in de buurt van de uitzaaibare zone en kristalgroei vindt vervolgens plaats in de uitzaaibare zone na fasediagram, totdat de eiwitconcentratie de oplosbaarheidscurve bereikt die het thermodynamische evenwicht tussen oplossing en kristallen vertegenwoordigt. Door de temperatuur te verlagen in het geval van het eiwit met directe oplosbaarheid of door de neerslagconcentratie te verhogen in geval van uitsnauwing, blijft de kristallisatieoplossing in de uitzaaibare zone en treedt er geen nucleatie op. Kristallen groeien tot het tweede kristaloplossingsevenwicht bereikt en daarna wordt geen verdere toename van de grootte van kristallen waargenomen.

Het verlagen van de temperatuur of het verhogen van de neerslagconcentratie wordt meerdere keren herhaald totdat de kristallen de gewenste grootte bereiken. Voeg de eiwitoplossing toe aan de dialysekamer van de temperatuurgecontroleerde stroomopstelling, bedek de overkamer met het dialysemembraan en bevestig het membraan met het elastiek of de ring. Draai de overkamer om en leg deze bovenop de dialysekamer.

Druk erop zachtjes en langzaam om alle lucht te verwijderen die tussen twee stukken is opgesloten, bevestig het reservoir in zijn positie door het voorzichtig bovenop de overkamer te schroeven. Voeg de kristallisatieoplossing toe aan de reservoirkamer en bedek deze met de luchtdichte dop. Breng deze assemblage over en plaats deze in de borststeun van de kristallisatiebank OptiCrys Kristalgroei is een supervisiesoftware van de Kristallisatiebank OptiCrys.

Het bevat vier verschillende grafische interfaces of weergaven. De thuisweergave bevat knoppen om naar de andere weergaven te navigeren. Het doel van de installatie-interface is om een experiment scenario te definiëren dat automatisch kan worden uitgevoerd in de testweergave.

De laatste weergave is de onderhoudsweergave. Als u een experiment opnieuw wilt starten, moet de onderhoudsweergave open zijn waar alle essentiële parameters voor het vloeiend uitvoeren van de kristallisatie-experimenten worden gevonden. Verhoog de helderheid van het lichtgedeelte, het licht kan toenemen van nul, geen licht tot 100 maximale helderheid.

Voor het regelen en bewaken van de temperatuur wordt de sectie temperatuurregelaar gebruikt. Klik op de knop om deze in te schakelen. Stel de temperatuur in op het ingestelde puntgedeelte en druk op enter.

Onder deze knop staan twee grafieken. De rode toont de finale, de ordertemperatuur en de gele grafiek toont de huidige temperatuur. Door het mengen van een voorraadoplossing wordt een injectie van de kristallisatieoplossing in de reservoirkamer geregeld door de palmsectie.

Voeg de concentratie van de voorraadoplossing toe in de eerste fase. Zoek vervolgens de uiteindelijke concentratie van elke nieuwe groeperoplossing en voeg deze toe aan het uiteindelijke concentratiegedeelte. Nadat u op de knop Berekenen hebt gedrukt, wordt het volume van de voorraadoplossing berekend en wordt het volumepaneel voor elk concentratiepaneel toegevoegd.

Druk op de startvoorbereidingsknop en wacht tot de nieuwe premier-oplossing klaar is. Voor het uitwisselen van de kristallisatieoplossing klikt u op de knop Oplossingsinvoer. Druk op de knop Distributie stoppen om het proces te stoppen.

Aan de rechterkant van de microscoopsectie zijn er verschillende panelen voor het vastleggen van belangrijke informatie van elk kristalgroeiexperiment. Voeg in deze sectie de bijbehorende eiwitnaam, het molecuulgewicht en de kristallisatievoorwaarde toe. Definieer een naam voor uw experimenten door deze eenvoudigweg op de mapnaam te typen.

Selecteer in de sectie NB-afbeeldingen het aantal afbeeldingen dat tijdens het experiment moet worden gemaakt. Voeg het nummer van de afbeeldingen toe en kies in het paneel aan de rechterkant de timerschaal. Klik op de mapknop om de map te openen.

In deze map bevindt zich een tekstbestand met alle informatie die u eerder voor uw experiment hebt gedefinieerd. Afbeeldingen die klaar zijn voor verdere behandeling worden ook in deze map opgeslagen. Afzoomen op de microscoop kan ook automatisch worden gevarieerd.

Hiermee wijzigt u uw zoom met behulp van de plus- en minknop boven op het microscoopgedeelte om respectievelijk de vergroting te vergroten of te verlagen. Er zijn drie verschillende manieren om de kristalgrootte te meten. Gebruik voor het meten van de lengte of breedte de breedtevector.

Afhankelijk van de kristalvorm kunnen de specifieke gereedschappen uit het linkerdeel van het microscoopgedeelte worden gekozen. Zoals een rechthoekige of veelhoek. De waarden worden weergegeven in de metingssectie.

In de eerste reeks experimenten werden microdialyseknoppen ondergedompeld in de kristallisatieoplossingen met verschillende zoutconcentraties. In dit eenvoudige kristallisatierasterexperiment is de enige variabele de neerslagconcentratie. terwijl de temperatuur constant wordt gehouden.

Kleine variaties in de zoutconcentratie maken het mogelijk om het kristallisatiefasediagram te onderzoeken door de zoutconcentratie te verhogen van 0,7 naar 1,2 molaire oververzadigingsverhogingen en de oplossing in de nucleatiezone beweegt zich weg van de uitzaaibare zone. Bijgevolg wordt een variatie in grootte en aantal kristallen waargenomen waarbij het aantal kristallen toeneemt en hun grootte afneemt. In het eerste experiment met OptiCrys onder de gegeven experimentele toestand, zodra het evenwicht in de dialysekamer is bereikt, bevindt de kristallisatieoplossing zich in de nucleatiezone in de buurt van de uitzaaibare zone van het kristallisatiefasediagram.

Als gevolg hiervan worden slechts enkele kernen gegenereerd tijdens de eerste fase van het experiment. Om de groei van kristallen in de uitzaaibare zone te houden en het kristalgroeiproces te beheersen, werd de temperatuur met verschillende tijdsintervallen gewijzigd. Elke keer dat het kristaloplossingsevenwicht was voltooid, was de temperatuur gevarieerd.

Daarom daalde de temperatuur tot 291 Kelvin, 288 Kelvin en uiteindelijk 275 Kelvin om de groei van geselecteerd kristal in de uitzaaibare zone te behouden. Het resultaat van dit experiment is een enkel groot kristal, met het volume dat nodig is voor natuurlijke macromoleculaire kristallografie. De volgende twee experimenten tonen de omkeerbaarheid aan van de temperatuurgecontroleerde dialyse-experimenten voor nucleatie, kristalgroei, ontbinding en hergroei.

In het tweede experiment met OptiCrys werd de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing constant gehouden door het experiment en varieerde de temperatuur. De begintemperatuur werd ingesteld op 291 Kelvin. Vanwege de hoge oververzadiging verscheen een groot aantal kleine kristallen in de kristallisatiekamer.

In overeenstemming met het concept van directe eiwit oplosbaarheid, door geleidelijk de temperatuur te verhogen tot 313 Kelvin moesten alle kristallen worden opgelost. Ten slotte, door de temperatuur te verlagen tot 295 Kelvin, begon de tweede nucleatie in de buurt van de uitzaaibare zone en liet het nucleatieproces controleren, wat resulteerde in het vormen van een lager aantal kernen. Verdere kristalgroei maakte het mogelijk om de uniforme populatie van grotere kristallen te genereren.

In dit experiment leidt het veranderen van de chemische samenstelling van de kristallisatieoplossing bij constante temperatuur tot het verkrijgen van een uniforme populatie grotere kristallen. De kristallisatietoestand was vergelijkbaar met het vorige experiment. Het oplossen van de kristallen werd bereikt door de NaCl-concentratie geleidelijk te verlagen van 0,9 molaar naar nul.

Het verlagen van de zoutconcentratie houdt de oplossing in de onderverzadigde zone van het fasediagram, wat leidt tot de ontbinding van de kristallen. Vervolgens werd de nieuwe kristallisatieoplossing met een lagere ionische sterkte dan voorheen in de reservoirkamer geïnjecteerd. Bij deze neerslagconcentratie verschijnt het lagere aantal kristallen en bereiken de kristallen een groter volume dan voorheen.

Hier hebben we een gedetailleerd protocol verstrekt dat de monstervoorbereiding beschrijft en de besturingssoftware aanpast voor het kweken van grote en hoogwaardige kristallen voor natuurlijke macromoleculaire kristallografie met behulp van een volledig geautomatiseerd instrument dat in ons lab is ontwikkeld. Deze stapsgewijze procedure is ontworpen en profiteert van de kennis van het kristallisatiefasediagram om nucleatie en kristalgroei te scheiden. Bovendien wordt een protocol voor het kweken van kristallen met microcytosepatronen ook gepresenteerd met behulp van macrocytoseknoppen als alternatief wanneer OptiCrys niet beschikbaar is.

Naast de strategieën die ik noemde voor OptiCrys het veranderen van de chemische samenstelling van de kristallisatie-oplossing en temperatuur en het nemen van foto's moet handmatig worden gedaan. Het gebruik van de thermische gereguleerde trilling voor de incubator om de temperatuur constant te houden is vereist, wat een kritieke stap is in de aangetoonde methodologie.