Isolatie van proximale vloeistoffen om de tumormicro-omgeving van pancreasadenocarcinoom te onderzoeken
5 november 2020
Pancreassap is een kostbare bron van biomarkers voor menselijke alvleesklierkanker. We beschrijven hier een methode voor intraoperatieve incassoprocedure. Om de uitdaging van het aannemen van deze procedure in muizenmodellen te overwinnen, stellen we een alternatief monster voor, tumor interstitiële vloeistof, en beschrijven we hier twee protocollen voor de isolatie ervan.
De hier beschreven methode om proximale vloeistof te isoleren, zowel bij mensen als bij muizen, kan worden toegepast om de micro-omgeving van pancreaskanker te bestuderen om nieuwe biomarkers van de ziekte te identificeren. Met behulp van dit eenvoudige protocol is het mogelijk om klinische bevindingen van pancreassap te vertalen naar muismodellen van PDAC om mechanistische studies uit te voeren. Pancreassap is een grotendeels onontgonnen lichaamsvloeistof die belofte heeft getoond als een bron van waardevolle biomarkers om te helpen bij pre-operatieve diagnose en patiëntenprofilering.
Ik zal het eerste deel van het protocol demonstreren, en Marialuisa Barbagallo, een postdoc uit ons laboratorium, zal het tweede deel van het protocol demonstreren. Schat de locatie van het pancreaskanaal in met behulp van metingen verkregen tijdens beeldvorming. Palpeer vervolgens het vooroppervlak van de pancreas om de precieze locatie ervan te identificeren.
Houd de pancreaskop in het duodenum van onderuit vast en til hem op met de linkerhand, marker de locatie van het pancreaskanaal met de eerste vinger. Gebruik de rechterhand om een drie milliliter spuit met een 25-gauge naald in de pancreas in te brengen, net distaal van de linkerduim. Bepaal de diepte van penetratie en de mate van helling van de naald op basis van preoperatieve metingen en op de perceptie dat de kanaalwand is gepenetreerd.
Trek het sap terug met de spuit. Als het niet mogelijk is om het sap terug te halen, plaats de naald opnieuw in een poging het pancreaskanaal te canuleren. Zodra het pancreassap is verkregen, verplaats het buiten het steriele veld en breng het over in een drie milliliter EDTA vacuümtestbuisje.
Bewaar de buis op vier graden Celsius totdat het monster naar het laboratorium wordt overgebracht. Om het pancreassap te verwerken, centrifugeer het gedurende 10 minuten bij 400 G en vier graden Celsius om eventuele cellen of deeltjes te verwijderen. Verzamel het supernatant, verdeel het in aliquoten en bewaar het bij 80 graden Celsius tot verdere analyses.
Om tumorinterstitiële vloeistof of TIF te isoleren, snijdt u de tumor in het midden, spoelt de twee delen in PBS en demp ze voorzichtig op filterpapier, beweeg zo snel mogelijk om verdamping van de tumor te voorkomen. Breng de tumor onmiddellijk over in een 20 micrometer nylon celzeef, bevestigd aan een 50 milliliter conische buis. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 400 G en vier graden Celsius.
Verzamel de TIF vanaf de bodem van de buis, verdeel het vervolgens in aliquoten en bevriest het onmiddellijk op droog ijs. Bewaar het bij 80 graden Celsius tot verdere analyse. Om de TIF te isoleren met behulp van elutie, snijdt u de tumor in kleine stukjes met een schaar of een scalpel en spoelt u ze voorzichtig met koud PBS.
Breng de tumor stukken over in een 1,5 milliliter buis en voeg 500 microliter PBS toe met een Protease Inhibitor Cocktail om degradatie van analyten te voorkomen. Incubeer het weefsel gedurende een uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Breng het supernatant over in een nieuwe 1,5 milliliter buis en voer een reeks centrifugatiestapjes uit bij vier graden Celsius om eventuele cellen uit het monster te verwijderen.
Verzamel het supernatant na elke centrifugatie en breng het over in een nieuwe buis. Na de laatste centrifugatie, verdeel het onmiddellijk in aliquoten en bevries het TIF-monster op droog ijs. Bewaar het bij 80 graden Celsius tot verdere analyse.
Dit protocol werd gebruikt om het pancreassap te verkrijgen van patiënten met PDAC en andere goedaardige pancreasaandoeningen. Na het filteren van de brede NMR-signalen van macromoleculen, waren de signalen van metabolieten met een laag moleculair gewicht duidelijk zichtbaar. Gesuperviseerde OPLS-DA-analyse toonde aan dat het metabolische profiel in pancreassap in staat was om PDAC- en niet-PDAC-patiënten te onderscheiden met een nauwkeurigheid van 82,4%. Interessant is dat metabolomische analyse die op plasmamonsters van dezelfde patiënten werd uitgevoerd, niet hetzelfde onderscheidende vermogen opleverde.
Om aan te tonen dat tumorinterstitiële vloeistof inhoud betrouwbaar veranderingen in de tumormicro-omgeving weerspiegelt, werden twee pancreaskankercellijnen met tegengestelde glycolytische snelheden subcutaan in muizen geïnjecteerd. Na het verwijderen van de tumoren, werden de concentraties glucose en lactaat gekwantificeerd. Tumorinterstitiële vloeistof van sterk glycolytische tumoren bevatte minder glucose en meer lactaat in vergelijking met laag glycolytische tumoren.
In deze studie hebben we metabolomicsanalyse uitgevoerd. Deze proximale vloeistoffen zijn echter geschikt voor veel andere downstream-toepassingen, zoals massaspectrometrie en microRNA-profilering.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor de intraoperatieve collectie van pancreassap, een waardevolle bron van biomarkers voor pancreaskanker. Daarnaast wordt een alternatief monster geïntroduceerd, tumorinterstitiële vloeistof, samen met protocollen voor de isolatie hiervan in muismodellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Biomarker-ontdekking
Achtergrond
- Alvleeskliersap is onderbelicht als bron voor biomarkers.
- Het heeft potentie om te helpen bij de preoperatieve diagnose.
- Inzicht in de micro-omgeving van pancreaskanker is cruciaal.
- Het vertalen van bevindingen uit humane studies naar muismodellen kan het onderzoek verbeteren.
Doel van de studie
- Om pancreassap en tumorinterstitieel vocht te isoleren voor de identificatie van biomarkers.
- Om protocollen te bieden die toepasbaar zijn in zowel humane als muismodellen.
- Om mechanistische studies naar pancreaskanker te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Intraoperatieve afname van pancreassap.
- Isolatie van tumorinterstitieel vocht.
- Beeldvormingstechnieken om de pancreasgang te lokaliseren.
- Palpatie van de pancreas voor precieze identificatie.
Belangrijkste resultaten
- Gedemonstreerde protocollen voor vloeistofisolatie.
- De potentie van pancreassap als bron voor biomarkers benadrukt.
- De haalbaarheid aangetoond van het vertalen van klinische bevindingen naar murine modellen.
- Een basis gelegd voor toekomstige mechanistische studies.
Conclusies
- Alvessap en interstitiële tumorvloeistof zijn veelbelovend voor biomarkeronderzoek.
- De protocollen kunnen het begrip van pancreaskanker verbeteren.
- Verder onderzoek is nodig om het volledige potentieel van deze vloeistoffen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Isolatie van proximale vloeistoffen maakt directe analyse van de micro-omgeving van het pancreaskarsinoom mogelijk, wat een weg opent naar de ontdekking van biomarkers die klinische observaties en preklinische mechanistische studies met elkaar verbinden. Door technisch toegankelijke methoden te bieden voor het verzamelen van pancreassap en interstitiële tumorvloeistof in zowel humane als murine systemen, ondersteunt het protocol inspanningen voor targetvalidatie en assayontwikkeling die gericht zijn op micro-omgevingsveranderingen. Deze benadering vergroot het voorspellende vertrouwen in vroege discovery door ziekterelevante vloeistoffen op te leveren die de interacties tussen stromale cellen en tumorcellen weerspiegelen, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in programma's voor geneesmiddelenonderzoek naar pancreaskanker.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door vloeistoffen te isoleren waarin biomarkers van de tumormicro-omgeving zijn geconcentreerd.
- Operationele waarde: Biedt een ziekterelevant systeem voor functionele targetvalidatie met behulp van proximale vloeistofbiomarkers.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie via comparatieve analyse van glycolytische tumorfenotypen door kwantificatie van glucose en lactaat in TIF.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische vloeistoffen voor voor downstream-toepassingen zoals massaspectrometrie en microRNA-profilering.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare isolatieprotocollen (centrifugatie en elutie) die geschikt zijn voor de schaalbaarheid van assays.
- Wetenschappelijke waarde: Levert kwantitatieve metabolietgegevens die screening-klare biomarkerdetectie met onderscheidend vermogen mogelijk maken (82,4% nauwkeurigheid in OPLS-DA).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Vestigt ziekterelevante systeemcontinuïteit door bevindingen uit menselijk pancreassap te vertalen naar murine TIF-modellen.
- Operationele waarde: Faciliteert preklinische validatie door isolatie van TIF uit subcutane tumormodellen die micro-omgevingsveranderingen weerspiegelen.
- Strategische waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling door vloeistof-biomarkerprofielen te koppelen aan het tumorfenotype.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor micro-omgevingsprofilering mogelijk wordt die mechanistische studies en biomarker-gestuurde screeningscampagnes onderbouwt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en het verduidelijken van signaalpaden door het isoleren van vloeistoffen die stroma-tumorinteracties bij PDAC weerspiegelen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde isolatie van TIF en pancreassap, wat resulteert in kwantitatieve output van metabolieten en nucleïnezuren.
- Analytics: Levert meetbare biomarkers (glucose, lactaat, metabolieten) voor vergelijkende analyse van condities en fenotypische screening.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt fundamentele ontdekkingen met preklinische continuïteit door aan te tonen dat TIF de glycolytische status van de tumor in muismodellen weerspiegelt.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor de isolatie van proximale vloeistoffen in menselijke en muissystemen, waardoor barrières bij modeltranslatie worden verminderd.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende zekerheid door detectie van micro-omgevingsbiomarkers en doelwitvalidatie bij PDAC.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via eenvoudige centrifugatie- en elutietechnieken voor TIF-isolatie.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door vloeistofbiomarkers te koppelen aan het tumorfenotype, waardoor het biologische risico in een laat stadium wordt verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering op basis van biomarker-discriminerende vloeistofprofielen (82,4% nauwkeurigheid bij PDAC vs. non-PDAC).
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het omgaan met chirurgische vloeistoffen en tumorsectie voor de isolatie van proximale vloeistoffen.
- Centrifugeringsapparatuur (400 G, 4°C) en steriele vloeistofafhandeling voor de verwerking van pancreassap en TIF zijn noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen chirurgische, pathologische en analytische teams om de integriteit van de monsters te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing van murine TIF-isolatie via centrifugatie of elutie, afhankelijk van de weefselgrootte en de downstream-applicatie.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de technische uitdaging bij het verzamelen van murine pancreassap, waardoor TIF als surrogaat moet worden gebruikt.
