Visualisatie van replisoomontmoetingen met een antigeen gelabelde blokkerende laesie

Deze techniek vergemakkelijkt de visualisatie van replisoomantigeen-gelabelde DNA-adduct-ontmoetingen en kan worden uitgebreid tot de interacties van elk eiwit met een DNA-structuur of laesie die vatbaar is voor immunodetectie. Deze methode kan worden gebruikt om interactiefrequenties binnen individuele cellen te beoordelen, in plaats van in een populatie, en maakt de visualisatie van celcyclusafhankelijke interacties in situ mogelijk zonder cellen te beschadigen. De procedure wordt gedemonstreerd door Ishani Majumdar, een postdoc van het Seidman Laboratory.

Op de dag voor het experiment, zaad 1,5 maal 10 tot de vijfde cellen in twee milliliter medium op 35-millimeter glazen bodem kweekschalen voorbehandeld met cel kleefoplossing. Vervang de volgende dag het supernatant in elke schaal door 37 graden Celsius Vijf micromolaire Dig TMP-aangevulde medium naar de 50 tot 70% confluente celculturen en breng de platen gedurende 30 minuten terug naar de celkweekincubator om de Dig TMP in evenwicht te brengen. Terwijl de cellen broeden, verwarm je een UV-box tot 37 graden Celsius.

Aan het einde van de evenwicht, breng de platen over naar de voorverwarmde doos om de cellen bloot te stellen aan een vijf minuten durende UVA-lichtdosis van drie joule per vierkante centimeter en vervang de supernatanten door twee milliliter vers voorverwarmd kweekmedium voordat de platen gedurende een uur worden teruggebracht naar de celkweekincubator. Was aan het einde van de incubatie de culturen voorzichtig met PBS en fixeer de cellen met één milliliter 0,1% formaldehyde in PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de cellen één keer met PBS voordat u de cellen twee keer behandelt met 80 microliter cytoskeletextractiebuffer aangevuld met RNase gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur per behandeling om het cytoplasma te verwijderen.

Na de tweede incubatie, was de cellen met twee milliliter PBS drie keer voordat u de cellen fixeert met één milliliter 4% formaldehyde in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na de tweede fixatie was u de cellen drie keer met PBS zoals aangetoond, gevolgd door behandeling met één milliliter koude 100% methanol gedurende 20 minuten bij min 20 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer in twee milliliter PBS, gevolgd door een incubatie van 10 minuten in 80 microliter van vijf millimolaire Triton X-100 bij vier graden Celsius.

Behandel de cellen aan het einde van de incubatie met 100 microliter van vijf millimolaire EDTA in PBS, aangevuld met één microliter van 100 milligram per milliliter RNase A gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Was de cellen aan het einde van de incubatie drie keer in PBS voordat u ze bewaart in 5% runderserumalbumine en 10% ezelsserum in PBS in een vochtige kamer 's nachts bij vier graden Celsius. Om een nabijheidsligatietest uit te voeren, voegt u 40 microliter van de primaire antilichaamoplossing van belang toe aan het midden van elke plaat en incubeert u de platen gedurende één uur in de vochtige kamer bij 37 graden Celsius.

Was aan het einde van de incubatie de cellen drie keer met twee milliliter PBST voordat u 40 microliter vers bereide PLA-sondeoplossing aan elk gerecht toevoegt voor een incubatie van één uur in de celkweekincubator. Was aan het einde van de incubatie de cellen met drie wasbeurten van 10 minuten in twee milliliter buffer A op een kantelbaar platform bij kamertemperatuur. Voeg na de laatste wasbeurt 40 microliter vers bereid ligatiemengsel toe aan elk bord voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius, gevolgd door drie wasbeurten van twee minuten in buffer A op het kantelplatform.

Voeg na de laatste wasbeurt 40 microliter vers bereide versterkingsoplossing toe aan elke plaat voor een incubatie van 100 minuten bij 37 graden Celsius in een vochtige kamer. Was aan het einde van de incubatie de cellen zes keer met verse buffer B gedurende 10 minuten per wasbeurt op het kantelplatform. Na de laatste buffer B-wasbeurt, was de cellen één keer met 0,01x buffer B gedurende één minuut op kamertemperatuur voordat u de juiste secundaire antilichamen in de vochtige kamer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius labelt.

Was de monsters aan het einde van de incubatie met drie wasbeurten van 10 minuten op een kantelplatform in PBST bij kamertemperatuur voordat u ze monteert in een montagemedium aangevuld met DAPI. binnen vier dagen na montage ten minste 100 waarnemingen per monster in beeld brengen of cellen conditioneren op een epifluorescentie- of confocale microscoop, met dezelfde belichtingsinstellingen voor zowel experimentele als controlemonsters. De Dig-tag kan worden gevisualiseerd door immunofluorescentie om de aanwezigheid van interstrand-crosslinks in de kern te onthullen.

Om de interactie van replisomen met interstrand crosslinks te visualiseren, kan PLA worden toegepast om de frequentie van associatie van MCM5 en de Dig-tag te visualiseren, een uur na de introductie van interstrand crosslink. Omdat replicatiestress ATR-kinase activeert, is de PLA tussen pMCM twee serine 108 en de Dig-tag ook positief. De PLA-resultaten van individuele kernen kunnen worden gepresenteerd in een driedimensionale reconstructie die de visualisatie van replisome interstrand crosslink-ontmoetingen in de kern mogelijk maakt.

Replicatievorkanalyse geeft aan dat interstrand crosslink-ontmoetingen een onverwacht replicatieherstartfenomeen vertonen, omdat de eiwitten van het GINS-complex geen PLA-signaal vertonen met de interstrand-crosslinks. Daarentegen is de test met CD 45 positief, wat aangeeft dat het andere vergrendelingseiwit behouden blijft. Wanneer cellen worden geïncubeerd met een ATR-remmer, wordt de herstart volledig onderdrukt en zijn de GINS Dig PLAs sterk positief.

CSK+R-behandeling is essentieel voor het verminderen van het achtergrondsignaal. Zorg ervoor dat u de platen bedekt met een cellijm en voorvoegsel met 0,1% FA of de cellen zullen van de plaat afbladderen.