Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus
10 juni 2021
Hier presenteren we een protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het pAdEasy-systeem. De technologie omvat de recombinatie van de pAdTrack en pAdEasy-1 plasmiden, de verpakking en versterking van het adenovirus, de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium, de virale titratie en het functioneel testen van het adenovirus.
Welkom bij het Instituut voor Cellulaire Biologie en Pathologie, Nicolae Simionescu uit Boekarest, Roemenië. Hier in het Viral Transduction Laboratory tonen we een deel van de adenovirale deeltjesproductie met behulp van een geoptimaliseerde methodologie op basis van het AdEasy-systeem ontwikkeld door professor Vogelstein. De belangrijkste stappen van de technologie voor de productie van deze adenovirussen zijn, ten eerste, een recombinatie van pAdTrack met GFP met de pAdEasy-1 plasmide in BJ5183 bacteriën.
Twee, het verpakken van de adenovirale deeltjes. Drie, versterking van het adenovirus in AD293 cellen. Vier, zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium.
Vijf, virale titratie en functionele testen van het adenovirus. Hier zullen we een belangrijke stap van de methodologie presenteren. De zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium.
De zuivering van het adenovirus begint met het oogsten van de virusproducerende cellen en het medium. AD293-cellen werden getransfecteerd met het recombinante plasmide en als het adenovirus werd verpakt. Toen werd het adenovirus versterkt door opeenvolgende grotere culturen.
Hier kregen we 25 T175-platen en begonnen we met de zuivering van het adenovirus uit het cellysaat en het kweekmedium. Eerst controleerden we de groene fluorescentie van het GFP uitgedrukt door de transduceerde cellen. Als de cellen nog steeds zijn bevestigd, zullen we ze loskoppelen door op de kweekschaal te tikken of door een lange schraper te gebruiken.
De cellen en het medium worden verzameld. De kolven worden gewassen met PBS, dat ook wordt opgevangen in Falcon-buizen. De cellen worden geplet door centrifugeren.
Bewaar de celkorrel en het medium voor verdere zuivering van het adenovirus. Bij deze stap wordt de hulp van een collega zeer gewaardeerd om het oogstproces te versnellen. De celpellet is groen vanwege de GFP-expressie.
De pellet wordt geresuspendeerd in hypertonische Tris buffer, wat de verstoring van de cellen zou vergemakkelijken. Voor cellysis gebruiken we vloeibare stikstof en het droge gas opgewarmd tot 37 graden. Voer niet meer dan drie cycli uit, omdat het virus zou worden beschadigd.
Om de efficiëntie van celverstoring te verhogen, passeert u de cel voorzichtig homogeniseren door een 23 gauge spuitnaald. Centrifugeer de cellysaat gedurende 12 minuten op 9, 600 x g. Geef het supernatant door in nieuwe buizen en gooi de pellets weg.
Houd het supernatant op ijs voor verdere verwerking door ultracentrifuge. Nu verwerken we het kweekmedium om het adenovirus te isoleren dat vrijkomt uit de cellen. Hiervoor wegen we eerst de benodigde hoeveelheid ammoniumsulfaat en voegen deze toe aan de fles waarin het kweekmedium is verzameld.
De fles wordt krachtig geschud totdat de kristallen volledig zijn opgelost. Het mengsel wordt twee uur en de helft op kamertemperatuur geïncubeerd. Vervolgens wordt de suspensie van het neerslag verdeeld in Falcon-buizen.
Centrifugeer gedurende 15 minuten op 1, 600 x g. Na de centrifugeren wordt het supernatant weggegooid en wordt de pellet geresuspendeerd in 10 millimolar Tris buffer. Als men de zuivering van het adenovirus niet kan voortzetten met de ultracentrifugatiestap, mag het neerslag een paar dagen op vier graden worden bewaard, maar alleen na dialyse om het ammoniumsulfaat te verwijderen.
Hier presenteerden we de dialysestap. We gebruiken een spuit om de suspensie in een eerder bevochtigde cassette te brengen. De monsters worden 's nachts bij vier graden gedialyseerd tegen 10 millimolar Tris buffer.
De laatste stap van de zuivering wordt vertegenwoordigd door de ultracentrifugatiestap op een discontinue gradiënt cesiumchloride. Om de gradiënt te vormen, pipetten we eerst drie milliliter van de oplossing met hoge dichtheid cesiumchloride. Giet bovenop deze laag voorzichtig drie milliliter cesiumchloride met lage dichtheid.
De adenovirale deeltjessuspensie van het cellysaat of het kweekmedium wordt vervolgens bovenop de gradiënt gelegd. De buizen zijn gevuld met minerale olie en geïntroduceerd in de SW41 emmers. Na equilibratie worden de buizen symmetrisch in de rotor geladen, die in de ultracentrifuge wordt geïntroduceerd.
De centrifuge draait 35.000 rpm en vier graden gedurende 18 uur zonder pauze. Na ultracentrifugatie worden de buizen op een standaard geplaatst met een zwart papier erachter om de banden te oogsten. De heldere bovenste fase en het celafval worden weggegooid in een afvalcontainer met een bleekoplossing.
De laagste band met het volledige adenovirus wordt geoogst met een pipetpunt en verzameld in een steriele Eppendorf-buis. Na dialyse wordt sucrose toegevoegd aan de virale suspensie tot een eindconcentratie van 4% en worden virale aliquot bevroren gehouden op min 80 graden. In de resultatensectie toonden we de GFP-expressie in cellen die werden getransduceerd met het verkrijgen van adenovirus.
48 uur na transductie wordt GFP uitgedrukt door de getransduceerde cellen, zoals blijkt uit fluorescentiemicroscopie. Het percentage van de GFP-uitdrukkende cellen wordt bepaald door flowcytometrie. Ongeveer 50% van de menselijke en runder endotheelcellen die met 25 transductie-eenheden per cel worden getransduceerd, zijn GFP-positief.
Dezelfde transductieopbrengst werd verkregen voor muriene hepatocyten toen slechts vijf transductie-eenheden per cel werden gebruikt, maar dit wordt geassocieerd met een hogere mortaliteit als gevolg van de celgevoeligheid. Gereduceerd tot GFP-expressie werd verkregen door transductie van mesenchymale stromale cellen als gevolg van de lage expressie van de specifieke receptoren. Slotopmerkingen.
We optimaliseren deze moeizame technologie om de tijd, de kosten en de inspanning die nodig is om de adenovirale deeltjes te verkrijgen, te verminderen. Het voorbereide adenovirus is in staat om verschillende celtypen te infecteren en de expressie van het interessegen te geïnduceerd.
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de productie van adenovirale deeltjes met behulp van het pAdEasy-systeem. Het proces omvat belangrijke stappen zoals recombinatie, verpakking, amplificatie, zuivering en functionele testen van adenovirussen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Virale biologie
- Gentherapie
- Celbiologie
Achtergrond
- Adenoviressen worden veel gebruikt in gentherapie vanwege hun vermogen om verschillende celtypen te infecteren.
- Het pAdEasy-systeem is een geoptimaliseerde methode voor adenovirusproductie.
- Begrip van het zuiveringsproces is cruciaal voor het verkrijgen van hoogwaardige virale deeltjes.
- Fluorescente markeringen zoals GFP helpen bij het volgen van de transductie-efficiëntie.
Doel van de studie
- Om het adenovirusproductieprotocol te optimaliseren om de efficiëntie te verbeteren.
- Om een uitgebreide gids te bieden voor onderzoekers in virale transductie.
- Om de effectiviteit van de geproduceerde adenovirussen in genregulatie aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Recombinatie van plasmiden in bacteriële cellen.
- Verpakking en amplificatie van adenovirale deeltjes in AD293 cellen.
- Zuivering van adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium.
- Functionele testen via GFP-expressie en flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle zuivering van adenovirale deeltjes werd bereikt.
- Ongeveer 50% van de getransduceerde humane en boviene endotheelcellen drukte GFP uit.
- Transductieopbrengsten varieerden tussen verschillende celtypen.
- Optimalisatie verminderde tijd en moeite in adenovirale productie.
Conclusies
- Het geoptimaliseerde protocol is effectief voor het produceren van adenovirale deeltjes.
- Het maakt efficiënte genregulatie mogelijk in verschillende celtypen.
- Deze methodologie kan een waardevolle bron zijn voor onderzoekers in gentherapie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient adenovirus production is critical for gene delivery studies, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics in diverse cell systems. The optimized pAdEasy protocol reduces production time and cost, supporting scalable vector supply for early discovery and preclinical research. This capability strengthens portfolio flexibility and accelerates translational gene therapy initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust gene delivery for functional interrogation of candidate targets in multiple cell types.
- Supports pathway clarification by facilitating transient gene expression in disease-relevant models.
- Improves biological de-risking through reproducible transduction and quantifiable reporter outputs.
- Enhances predictive confidence for target validation by enabling controlled gene modulation.
Screening & Assay Development
- Provides validated viral vectors for standardized transduction in assay-ready cell systems.
- Facilitates reproducible and scalable gene expression for downstream screening workflows.
- Enables quantitative assessment of transduction efficiency via GFP and flow cytometry.
- Supports reliable compound evaluation by ensuring consistent gene delivery across experiments.
Translational & Preclinical Research
- Delivers gene transfer tools applicable to human, bovine, and murine primary cells.
- Maintains continuity from discovery to preclinical validation by supporting functional studies in relevant models.
- Reduces risk in translational research by providing high-quality, purified viral vectors.
- Enables alignment with biomarker strategies through quantifiable gene expression outputs.
Pipeline & Workflow Integration
This adenovirus production method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting target validation, assay development, and translational studies.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway analysis via efficient gene delivery.
- Screening: Supplies reproducible, high-titer viral stocks for assay standardization and scalability.
- Analytics: Provides quantitative readouts (e.g., GFP expression, flow cytometry) for condition comparison.
- Translational Research: Enables gene transfer in primary and disease-relevant cells for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, cost-effective platform for gene delivery across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines production, enhances reproducibility, and supports scalable vector supply.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling rapid vector generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy and functional genomics projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and viral purification techniques.
- Needs access to ultracentrifugation and flow cytometry infrastructure for purification and quantification.
- Demands cross-team standardization for reproducible vector production and transduction protocols.
- Adaptation may be needed for cell types with low adenoviral receptor expression or high sensitivity.
- Production scale and cell viability must be balanced to optimize yield and functional output.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:16
Adenoviral Particles Production using the AdEasy System
1:03
Purification of the Adenovirus From Cell Lysate and Culture Medium
1:14
Harvesting the Virus-producing Cells and the Culture Medium
4:02
Preparation of the Adenovirus Released in the Culture Medium
5:57
Adenovirus Purification by Ultracentrifugation
8:32
Results
9:31
Concluding Remarks
