In Vivo CRISPR/Cas9-screening om tegelijkertijd de genfunctie in de huid en mondholte van de muis te evalueren
2 november 2020
Hier beschrijven we een snelle en directe in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmethodologie met behulp van echogeleide in utero embryonale lentivirale injecties om tegelijkertijd functies van verschillende genen in de huid en mondholte van immunocompetente muizen te beoordelen.
Dit protocol is belangrijk omdat het onderzoekers toestaat om gelijktijdig de tumoronderdrukkende functies van honderden genen in hoofd- en halskanker te onderzoeken tegen een fractie van de kosten van een conventioneel knockout-muismodel. Deze techniek is flexibel en kan worden aangepast om de expressie van genen te bestuderen om hun functie in de huid te bestuderen. Het gerichte CRISPR-bibliotheekprotocol kan ook worden toegepast voor andere kankersoorten.
Plaats het verdoofde dier met de buikzijde naar boven op de verwarmde operatietafel en gebruik chirurgisch tape om de poten op hun plaats te houden. Breng de neusbuis voor anesthesie aan voor een constante toevoer van isofluraange en zuurstof tot de operatie is voltooid. Om de E9.5-zwangerschap te bevestigen, breng een kleine hoeveelheid haarverwijderingscrème aan op de buik en verspreid deze over een gebied van drie bij drie centimeter met een wattenstaafje.
Na twee tot drie minuten, verwijder voorzichtig de crème met gaas of papier en veeg het gebied schoon met PBS en 70% ethanol. Gebruik de ultrasone sonde en gel om de zwangere muis te controleren op embryonale dag E9.5. Dit kan ook de dag ervoor op E8.5 worden gedaan om tijd te besparen op de dag van de operatie.
Verwijder het ultrasone gel en veeg het gebied schoon met BPS en vervolgens 70% ethanol. Injecteer het meeste met subcutaan pijnstiller. Gebruik vervolgens steriele pincetten en schaar om een verticale incisie in de huid te maken.
Gebruik stompe pincetten om de huid rond de incisie te scheiden van het peritoneum. Gebruik vervolgens steriele pincetten en schaar om door het peritoneum te snijden. Gebruik stompe pincetten om voorzichtig het linker en rechter baarmoederhoorn eruit te trekken en de embryo's te tellen.
Breng het grootste deel van de baarmoederhoorns terug, maar laat het uiteinde van een baarmoederhoorn met drie embryo's blootgesteld. Gebruik stompe pincetten om voorzichtig de baarmoeder met de drie embryo's te duwen en te trekken, door de opening in de siliconenmembraan van de aangepaste petrischaal. Stabiliseer de petrischaal met behulp van blokjes modelklei.
Stabiliseer de baarmoeder met de drie embryo's in de petrischaal, met behulp van een siliconen mal. Plat de siliconen plug aan de zijkant van de embryo's met behulp van een stomp gereedschap. Vul de petrischaal met steriele PBS en spoel de siliconenmembraan aan de onderkant van de petrischaal, met de buik van de zwangere moeder, waardoor lekkage wordt voorkomen.
Verplaats de ultrasone kop in de petrischaal, ongeveer 0,5 centimeter boven het bovenste embryo en pas de standaard aan zodat de vruchtwaterholte duidelijk zichtbaar wordt in de ultrasone weergave. Lijn de injectienaald zorgvuldig uit in de aangepaste petrischaal. Gebruik de micromanipulator om de punt van de naald binnen vijf millimeter van het bovenste embryo te plaatsen en schakel vervolgens de naald heen en weer om in het vlak te bewegen waarbij de punt het helderste lijkt in de ultrasone afbeelding.
Gebruik de micromanipulator om de naald door de baarmoederwand in de vruchtwaterholte te duwen. Injecteer 62 nanoliters van het lentivirus met de sgRNA-bibliotheek met een langzame injectiesnelheid. Druk acht keer op de Inject-knop voor een totaal van 496 nanoliters per embryo.
Herhaal dezelfde procedure voor de andere twee embryo's. Til vervolgens de ultrasone kop op en verwijder de siliconen plug. Duw voorzichtig de eerste twee van de drie embryo's in de buik van de muis met behulp van een steriele wattenstaafje.
Trek de volgende drie embryo's eruit en duw het eerder geïnjecteerde derde embryo erin. Herhaal de injectieprocedure totdat het gewenste aantal embryo's is geïnjecteerd, zorg ervoor dat u de 30 minuten anesthesie niet overschrijdt. Als u klaar bent, tilt u de ultrasone kop, verwijdert u de micromanipulator met de naald, aspireert u de PBS en verwijdert u de petrischaal.
Gebruik steriele doekjes om eventueel opgehoopt PBS in de buikholte te absorberen. Sluit de buiksnede met behulp van absorberbare hechtingen. Gebruik vervolgens twee klampen om de incisie in de buikhuid te sluiten.
Vervolgens moeten de volgende generatie sequencing-lezingen van PCR-versterkte DNA uit plasmide en lentivirale bibliotheek getransduceerde cellen een hoge correlatie vertonen. Als de sgRNA-lezingen van plasmide DNA geen gelijke vertegenwoordiging van sgRNA's vertonen, moet de virale voorbereidings- en concentratieprocedure zorgvuldig worden herhaald. De resultaten van de echografie-geleide injectie van lentivirus dat Cre-recombinase draagt in E9.5 Lox-STOP-Lox confetti muispups op postnatale dag P0, worden hier getoond.
Het uitvoeren van de operatie op E9.5 is cruciaal. Vergeet niet om negen dagen na het opzetten van de kruising de zwangerschap met echografie te controleren en identificeer het embryonale tijdstip bij elke vrouwelijke muis. Zodra de pups zijn geboren, kunnen de getransduceerde cellen worden geïsoleerd en uitgebreid worden geprofileerd met behulp van de nieuwste genprofileringstechnieken zoals single-cell RNA-sequencing.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een snelle en directe in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmethodologie met behulp van echografie-gestuurde in utero embryonale lentivirale injecties. Het stelt onderzoekers in staat om de functies van verschillende genen in de huid en de mondholte van immunocompetente muizen te beoordelen.
Belangrijkste Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- De techniek maakt het mogelijk om de tumorremmende functies van honderden genen te onderzoeken.
- Het is kosteneffectief in vergelijking met conventionele knockout-muismodellen.
- De methode is aanpasbaar voor het bestuderen van genexpressie in de huid.
- Het kan worden toegepast op verschillende kankersoorten.
Doel van het onderzoek
- Om een methodologie te ontwikkelen voor gelijktijdige beoordeling van genfuncties.
- Om de begrip van genrollen in hoofd- en halskanker te verbeteren.
- Om een flexibele tool voor kankeronderzoek te bieden.
Gebruikte methoden
- Echografie-gestuurde in utero embryonale lentivirale injecties.
- Toepassing van isofluraan en zuurstof voor anesthesie.
- Bevestiging van zwangerschap via het aanbrengen van haarontgroeicreme.
- Gebruik van een gerichte CRISPR-bibliotheekprotocol.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beoordeling van genfuncties in vivo.
- Bewezen kosteneffectiviteit van de methode.
- Aanpasbaarheid voor verschillende kankersoorten bevestigd.
- Mogelijkheden voor bredere toepassingen in genfunctiestudies.
Conclusies
- Het protocol biedt een snelle en efficiënte benadering voor genfunctieanalyse.
- Het opent nieuwe wegen voor kankeronderzoek en genstudies.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot buiten hoofd- en halskanker.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
In vivo CRISPR/Cas9 screening enables rapid, multiplexed functional interrogation of gene roles in disease-relevant mouse tissues, accelerating target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery. This approach reduces the time and cost barriers of traditional GEMMs, supporting earlier, data-driven portfolio triage and prioritization. Its adaptability across tissues and gene perturbation types positions it as a scalable platform for preclinical model innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables simultaneous functional assessment of hundreds of candidate tumor suppressor genes in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in tissue-specific oncogenesis.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target prioritization for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Generates validated, multiplexed knockout models for robust screening of gene function.
- Provides quantitative readouts via next-generation sequencing of sgRNA representation.
- Improves reproducibility and scalability compared to single-gene knockout workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease biology by enabling tissue- and context-specific gene perturbation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling single-cell profiling of transduced cells.
- Reduces late-stage attrition risk by providing early, in vivo functional evidence for candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo CRISPR screening method bridges early discovery and preclinical model development, enabling direct functional genomics in relevant tissues before lead identification.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene function testing and pathway mapping in disease-relevant systems.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs for robust comparison of gene perturbations.
- Analytics: Leverages next-generation sequencing for precise measurement of sgRNA enrichment and depletion.
- Translational Research: Supports biomarker discovery and mechanistic alignment with clinical phenotypes.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues, gene sets, and disease models across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and enables high-throughput functional genomics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by providing early, multiplexed in vivo data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero surgery, CRISPR library design, and next-generation sequencing analytics.
- Demands access to ultrasound-guided injection systems and high-titer lentiviral production capabilities.
- Standardization of sgRNA library representation and viral delivery is critical for reproducibility.
- Protocol can be adapted to other organs or CRISPR modalities with appropriate optimization.
- Careful control of viral titer and injection parameters is necessary to avoid confounding effects from multiple sgRNA integration.
